專利名稱：一種多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種生物材料，特別是ー種多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法及其在制備組織工程支架中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組織工程學(xué)(Tissue Engineering)是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)的原理，研究開發(fā)用于修復(fù)或改善人體病損組織或器官的結(jié)構(gòu)、功能的生物活性替代物的ー門新興學(xué)科。人體組織的病損會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙。目前的修復(fù)方法主要包括自源性移植、異源性移植和人造材料移植。自源性移植和異源性移植均是移植來自人體的組織，只不過自源性移植的是來自患者本身的組織，而異源性移植的是來自他人的組織。但是不論是自源性移植還是異源性移植均受到組織源缺乏，形狀、大小等不匹配，可能會(huì)造成額外傷害等的限制。因此使得組織工程學(xué)逐步興起。 組織工程支架(Tissue engineering scaffolds)可用于不同的人體組織，一般需要具有三維、多孔且主要孔相互連接的結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞粘附、増殖和再生為組織的基礎(chǔ)，是細(xì)胞生長的細(xì)胞外基質(zhì)的替代物。因此組織工程支架材料除了應(yīng)當(dāng)滿足特定的組織對機(jī)械性能的要求、具有良好的生物相容性及生物可降解性之外，最為重要的是其必須還要具有一定的生物活性，即應(yīng)該能夠積極地促進(jìn)細(xì)胞在其表面的粘附、増殖和分化。目前，常用的組織工程支架材料主要分為天然生物材料和人工合成材料。前者主要有殼聚糖、藻酸鹽、纖維蛋白凝膠等。這類材料雖然通產(chǎn)具有良好的生物相容性和生物可降解性，但是其機(jī)械強(qiáng)度普遍不足。而后者主要有聚乳酸PLA、聚酯類如PLGA等，但是其吸水能力較差，對于細(xì)胞的粘附能力較弱，某些產(chǎn)品的降解產(chǎn)物還可能對人體造成毒害。石蠟又稱為晶型蠟，通常是白色或無色的無味蠟狀固體，熔點(diǎn)47°C左右，不溶于水，可溶于醚、苯等有機(jī)溶剤。常用于食品或其他組分或包裝材料。生物纖維素材料是近年來新興ー種生物材料,其是通過醋酸菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和八疊球菌屬(Sarcina)等中的某些微生物發(fā)酵制得，其具有獨(dú)特的超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此具有良好的生物相容性及生物可降解性以及良好的機(jī)械性能。此外，生物纖維素具有良好的吸水性，且即使在高含水量的情況下，仍然能夠保持良好的機(jī)械性能。但是傳統(tǒng)的生物纖維素材料，雖然能夠使細(xì)胞粘附于其表面，但是由于其納米纖維形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)十分致密，細(xì)胞的粘附性并不好，而且細(xì)胞的移動(dòng)和營養(yǎng)物質(zhì)的滲透均存在困難，因此其在組織工程學(xué)中并不能獲得良好的技術(shù)效果。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明首先提供ー種多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其包括如下步驟
I)制備固體石蠟微球并低溫滅菌；2)在生物纖維素的制備培養(yǎng)基中加入滅菌的固體石蠟微球；
3)接種生物纖維素凝膠產(chǎn)生菌種，進(jìn)行發(fā)酵；以及
4)在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵獲得的生物纖維素凝膠材料水浴加熱到50-60°C，保持10-20分鐘，然后趁熱進(jìn)行過濾，分離出石蠟即獲得多孔性生物纖維素凝膠材料。上述的固體石蠟微球可以通過包括如下步驟的方法制備將石蠟融化，通過噴霧設(shè)備噴霧到冷的、與石蠟不互溶的介質(zhì)中，待石蠟?zāi)绦纬晌⑶蚝蠊桃悍蛛x得到固體石蠟微球。例如可以將石蠟熔化后噴霧到冷水中即形成固體石蠟微球。還可將分離出的固體石蠟微球進(jìn)行冷凍干燥處理以進(jìn)ー步固型。固體石蠟微球的滅菌，可以是在形成微球之前進(jìn)行高溫滅菌，或在形成微球之后 進(jìn)行低溫滅菌。可以采用的滅菌方法有，例如，固體石蠟高溫加熱熔化，即同時(shí)進(jìn)行了滅菌處理，再在無菌條件下將其噴霧到冷的無菌水中，形成無菌的固體石蠟微球。滅菌方法還可以是將其在濃度為70%的こ醇溶液總浸泡6-12小時(shí)，取出后再在無菌條件下用無菌水漂洗。滅菌方法還可以采用紫外線照射等本領(lǐng)域其他已知的手段。固體石蠟微球的直徑優(yōu)選是200-600微米，更優(yōu)選是300-400微米。固體石蠟微球的直徑可以通過調(diào)整噴霧時(shí)噴嘴的尺寸，液體石蠟的流速來進(jìn)行調(diào)整。上述固體石蠟微球的用量為培養(yǎng)基體積的40-65% (v/v)，更優(yōu)選為培養(yǎng)基體積的50-55%。上述的發(fā)酵優(yōu)選使用靜態(tài)淺盤發(fā)酵，發(fā)酵條件為28_35°C，發(fā)酵5-10天。發(fā)酵條件優(yōu)選30°C，發(fā)酵7天。上述方法中，優(yōu)選在發(fā)酵完成后，將多孔性生物纖維素材料浸泡在堿性溶液中一段時(shí)間后，在用去離子水反復(fù)洗滌，以去除其表面附著的培養(yǎng)基和菌體。優(yōu)選用0. 05-2M的氫氧化鈉溶液浸泡1-4小時(shí)。上述分離出固體石蠟的方法，優(yōu)選將發(fā)酵后、內(nèi)嵌有固體石蠟微球的生物纖維素材料水浴加熱到50-60°C，保持10-20分鐘，使固體石蠟融化，再趁熱進(jìn)行過濾，從而分離出石蠟。更優(yōu)選在過濾后用50-60°C的去離子水和/或表面活性劑溶液反復(fù)洗滌生物纖維素材料。上述發(fā)酵中優(yōu)選接種木醋桿菌或木葡糖酸醋桿菌為發(fā)酵菌種。接種量優(yōu)選為培養(yǎng)基重量的8-12%，更優(yōu)選10%。上述發(fā)酵中可以使用任何能夠使發(fā)酵菌種生長繁殖并產(chǎn)生物纖維素的培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供上述任一方法制得的多孔性生物纖維素材料。本發(fā)明還進(jìn)ー步提供上述的多孔性生物纖維素材料在制備組織工程支架中的應(yīng)用，其以上述的多孔性生物纖維素材料為材料，通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備成組織工程支架。本發(fā)明所提供的方法能夠在生產(chǎn)生物纖維素時(shí)，使固體石蠟微球被包覆其中，在去除石蠟之后，就會(huì)形成多孔性的生物纖維素凝膠材料。所制備的多孔性生物纖維素凝膠材料，在保持了生物纖維素材料良好機(jī)械性能、生物相容性以及生物可降解性的同時(shí)，使生物纖維素具備了多孔性，為細(xì)胞的活動(dòng)以及營養(yǎng)物質(zhì)的滲透提供了空間，并進(jìn)一步提高了細(xì)胞的吸附性能，更適用于制備組織工程支架。


圖I是多孔性生物纖維素凝膠材料的電鏡照片；
圖2是多孔性生物纖維素凝膠材料(左)與普通生物纖維素凝膠材料(右)經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后的染色電鏡照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :固體石蠟微球的制備及滅菌 將固體石蠟水浴加熱到85°C，使其融化，將融化的液體石蠟通過噴霧裝置，噴到冷水中攪拌，使石蠟?zāi)蹋^濾分離出固體石蠟，用去離子水反復(fù)洗滌后，過200-600微米孔徑的篩，再冷凍干燥即可制得固體石蠟微球。再將固體石蠟微球在70%的こ醇溶液中浸泡8小時(shí)，取出后在無菌條件下，用無菌水反復(fù)洗滌，得到滅菌的固體石蠟微球備用。實(shí)施例2 :固體石蠟微球的制備及滅菌
將固體石蠟水浴加熱到90°C，使其熔化，繼續(xù)保持該溫度20min，以實(shí)現(xiàn)殺菌，通過已滅菌的噴霧裝置，將液體石蠟噴霧到冷的無菌水中，使石蠟?zāi)蹋^濾分離出固體石蠟，無菌條件下用無菌水反復(fù)洗滌，過200-600微米孔徑的篩，即得滅菌的固體石蠟微球，備用。實(shí)施例3 :多孔性生物纖維素材料的制備
取葡萄糖50g，蔗糖50g，蛋白胨20g，磷酸ニ氫鉀lg，磷酸氫ニ鉀lg，用去離子水配成IOOOg培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基倒入發(fā)酵淺盤中，用量筒量取500ml的實(shí)施例I中制得的滅菌固體石蠟微球，加入到發(fā)酵淺盤中，并攪拌均勻，再接種木葡糖酸醋桿菌，接種量10%，28°C下發(fā)酵7天，獲得內(nèi)嵌有固體石蠟微球的生物纖維素材料。從發(fā)酵淺盤中取出上述材料，將其在0. IM的氫氧化鈉溶液中浸泡2小時(shí)后，用去離子水反復(fù)清洗，以去除其表面附著的培養(yǎng)基成分和菌體。再將其水浴加熱到55°C，保持10分鐘，使石蠟融化，趁熱過濾，固形物用55°C的去離子水反復(fù)清洗。即制得本發(fā)明中的多孔性生物纖維素凝膠材料。實(shí)施例4 :多孔性生物纖維素凝膠材料的制備
取葡萄糖75g，蔗糖25g，蛋白胨10g，酵母膏15g，硫酸鎂lg，磷酸ニ氫鉀lg，磷酸氫ニ鉀lg，用去離子水配成IOOOg培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基倒入發(fā)酵淺盤中，用量筒量取450ml的實(shí)施例2中制得的滅菌固體石蠟微球，加入到發(fā)酵淺盤中，并攪拌均勻，再接種木葡糖酸醋桿菌，接種量8%，30°C下發(fā)酵10天，獲得內(nèi)嵌有固體石蠟微球的生物纖維素凝膠材料。從發(fā)酵淺盤中取出上述材料，將其在0. 15M的氫氧化鈉溶液中浸泡I小時(shí)后，用去離子水反復(fù)清洗，以去除其表面附著的培養(yǎng)基成分和菌體。在將其水浴加熱到60°C，保持12分鐘，使石蠟融化，趁熱過濾，固形物用60°C的去離子水反復(fù)清洗。即制得本發(fā)明中的多孔性生物纖維素材料。實(shí)施例5 :多孔性生物纖維素凝膠材料的制備
取葡萄糖25g,乳糖75g,酵母膏25g,硫酸銨5g,磷酸ニ氫鈉0. 5g,磷酸氫ニ鈉0. 5g，用去離子水配成IOOOg培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基倒入大三角瓶中，用量筒量取450ml的實(shí)施例I中制備的滅菌固體石蠟微球，加入到大三角瓶中，再接種木葡糖酸醋桿菌，接種量12%，35°C下?lián)u床動(dòng)態(tài)發(fā)酵5天，獲得內(nèi)嵌有固體石蠟微球的生物纖維素凝膠材料。從大三角瓶中取出上述材料，將其在0. IM的氫氧化鈉溶液中浸泡4小時(shí)后，用去離子水反復(fù)清洗，以去除其表面附著的培養(yǎng)基成分和菌體。在將其水浴加熱到50°C，保持20分鐘，使石蠟融化，趁熱過濾，固形物用60°C的肥皂水反復(fù)清洗。即制得本發(fā)明中的多孔性生物纖維素凝膠材料。實(shí)施例6
取實(shí)施例3-5中制得的多孔性生物纖維素凝膠材料，根據(jù)實(shí)際需要制備成所需的組織工程支架。實(shí)驗(yàn)例I :多孔性生物纖維素凝膠材料的電鏡分析
取實(shí)施例3中制得的多孔性生物纖維素凝膠材料，進(jìn)行電鏡掃描，照片見附圖I。從中 可以明顯看出，本發(fā)明中的多孔性生物纖維素凝膠材料中形成了許多微小的小孔。實(shí)驗(yàn)例2
配制0-|^11培養(yǎng)基，接種小鼠原成骨細(xì)胞此31341。將實(shí)施例3中制得的多孔性生物纖維素凝膠材料和作為對照的普通生物纖維素凝膠材料(發(fā)酵時(shí)不加入固體石蠟微球而同樣條件發(fā)酵制得)切割成2cm2，厚度0. 6mm的小圓片，滅菌后，在接種了 MC3T3-E1的MEM培養(yǎng)基中浸泡I小時(shí)，取出后置于預(yù)先放置了培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C，5%ニ氧化碳條件下進(jìn)行孵育，每2天換液一次，7天后取出生物纖維素凝膠材料圓片，用PBS洗滌3次后再用去離子水洗滌3次備用。
將經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)的多孔性生物纖維素凝膠材料和對照用3%的甲醛溶液洗滌固定后用羅丹明鬼筆環(huán)肽和DAPI分別進(jìn)行染色，再進(jìn)行電鏡分析。照片見附圖2。從圖2可以看出，細(xì)胞在多孔性生物纖維素凝膠材料和對照上均有附著，在多孔性生物纖維素凝膠材料上更為密集，且在微孔中分布的更多。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)制備經(jīng)過滅菌的固體石蠟微球； 2)在生物纖維素的制備培養(yǎng)基中加入滅菌的固體石蠟微球； 3)接種生物纖維素凝膠產(chǎn)生菌種，進(jìn)行發(fā)酵；以及 4)在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵獲得的生物纖維素凝膠材料水浴加熱到50-60°C，保持10-20分鐘，然后趁熱進(jìn)行過濾，分離出石蠟即獲得多孔性生物纖維素凝膠材料； 其中所述固體石蠟微球通過包括下述方法制備將石蠟融化，通過噴霧設(shè)備噴霧到冷的、與石蠟不互溶的介質(zhì)中，待石蠟?zāi)绦纬晌⑶蚝蠊桃悍蛛x得到固體石蠟微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于步驟4)的趁熱過濾后用50-60°C的去離子水和/或表面活性劑溶液反復(fù)洗滌多孔性生物纖維素凝膠材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于其中的固體石蠟微球的直徑為200-600微米。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于其中的固體石蠟微球的直徑為300-500微米。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于滅菌的固體石蠟微球的用量為培養(yǎng)基體積的30-65%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于滅菌的固體石蠟微球的用量為培養(yǎng)基體積的50-55%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于制得的滅菌固體石蠟微球是經(jīng)過冷凍干燥處理的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多孔性生物纖維素凝膠材料的制備方法，其特征在于其中所述的生物纖維素凝膠產(chǎn)生菌種為木葡糖酸醋桿菌。
9.通過上述任一權(quán)利要求中所述的方法制得的多孔性生物纖維素凝膠材料。
10.權(quán)利要求9中所述的多孔性生物纖維素凝膠材料在制備組織工程支架中的用途。
全文摘要
本申請涉及一種多孔性生物纖維素凝膠材料及其在制備組織工程支架中的應(yīng)用。本發(fā)明在生物纖維素的培養(yǎng)基中加入固體石蠟微球進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵時(shí)，微生物產(chǎn)生的生物纖維素會(huì)將固體石蠟微球包覆在其內(nèi)，發(fā)酵結(jié)束后，再去除被包覆的固體石蠟即可獲得多孔性生物纖維素凝膠材料。本發(fā)明中的多孔性生物纖維素凝膠材料，能夠?yàn)榧?xì)胞的移動(dòng)和營養(yǎng)物質(zhì)的滲透提供空間，并進(jìn)一步提高細(xì)胞的依附性能，更適于用于制備組織工程支架。
文檔編號A61L27/56GK102764451SQ20121018761
公開日2012年11月7日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者鐘春燕 申請人:鐘春燕