專利名稱：一種用于修復脊髓損傷的緩釋nt-3明膠海綿圓柱體支架的構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于修復脊髓損傷的緩釋神經營養素-3(neurotrophin-3,NT-3)明膠海綿圓柱體支架的構建方法，尤其是一種含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構建方法及其應用。
背景技術：
中樞神經損傷如嚴重的脊髓創傷主要表現為截癱和四肢癱，目前還沒有行之有效的治療方法。傳統認為，脊髓神經損傷后很難再生?，F在認為，脊髓神經再生困難的原因主要是它們所處微環境中缺乏促進神經再生的神經營養因子。因此，要想脊髓神經損傷后能夠再生，必需進行人工干預?，F階段促進脊髓神經損傷修復的策略，多著力于改善神經元發出的神經纖維再生微環境，讓再生的神經纖維借助橋接物支架穿過損傷區，進入另一側的 脊髓組織中，重建神經通路聯系，恢復原有的功能。在脊髓損傷修復的策略中，生物組織工程材料作為具有保護神經元和促進其軸突再生作用的活性因子或作為移植干細胞的載體，被用于治療脊髓損傷且逐漸引起人們的關注。組織工程材料主要有天然高分子生物材料和可降解高分子合成材料。天然高分子生物材料包括明膠、膠原、殼聚糖和海藻酸鹽等。天然材料具有良好的生物相容性，在體外能促進細胞的黏附、增殖與分化。它們方便承載神經營養因子，與脊髓組織的整合性好，能夠降低炎癥反應以及減少星形膠質細胞增生所形成的疤痕，在一定程度上能夠促進受損傷脊髓的結構和功能恢復。由于天然材料存在加工、機械性能較差和降解速率不易調控等問題，在體內應用受到一定限制?？山到獾母叻肿雍铣刹牧弦跃圩笮樗?poly D,L-Iactic acid,PLLA)和聚乳酸-聚輕基乙酸共聚物(poly D, L-Iactic-co-glycolic acid, PLGA)為代表，它最大的優點易于加工成各種復雜的結構和形狀，有一定的機械強度，能夠起到橋接組織的作用，降解產物易于被吸收。但是，這種材料在體外沒有促進細胞黏附和生長的功能，植入體內后可能存在降解產物呈酸性的問題。天然生物材料做成的凝膠、明膠海綿和膠原海綿，都可用于橫斷性脊髓損傷修復。凝膠能夠在脊髓損傷空洞處起填充作用，促進軸突再生，減少星形細胞增生形成的疤痕。但是，它不能較好地引導再生軸突穿越損傷區域，尤其是缺乏機械強度。明膠和膠原具有凝膠的優點，且能夠方便承載活性物質。明膠來自于膠原，但去膠原的自然屬性后(de-naturecollagen)沒有了膠原的抗原性，而且含有類似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，能夠促進細胞的黏附和遷移。另外，明膠價格比較便宜，但其機械強度也不高。明膠海綿應用于臨床已經有許多年的歷史了，這得益于它的良好的組織相容性和細胞親和力。但是近年有病例報告指出，由于明膠海綿吸水容易膨脹，最終導致植入中樞神經后出現對周圍組織擠壓的情況?；谶@種情況，我們設計用一種相對膨脹系數較小的材料PLGA膜作為導管外殼，并在導管的中央填塞明膠海綿(曾園山，曾湘。一種用于修復神經損傷的明膠海綿圓柱體支架的構建。獲中華人民共和國發明專利，發明專利號ZL200910040176. 9)。這明膠海綿圓柱體支架一方面可以盡可能保持明膠海綿的良好材料特性，另一方面可以減少明膠海綿的過度膨脹。此外，由于有了機械強度較高的PLGA膜作為導管外殼，導管中間的明膠海綿不容易發生塌陷。這些優點都有利于我們進行體內、外的實驗研究。絲素蛋白(silk fibroin)與其它天然高分子相比有明顯的優越性(I)安全可靠；絲素蛋白是來源于家蠶的天然高純度蛋白質，向人類傳播疾病的風險比較少，而且具有明確的一級結構，不存在潛在的危害性。(2)通過不同處理方法可以獲得膜狀或液態性狀。
(3)可以通過某些氨基酸的氨基和側鏈的化學修飾，改變其表面性能，較容易吸附細胞。(4)在體內、外可緩慢降解，具有一定的緩釋性。應用神經營養因子治療中樞神經損傷是目前研究的熱點之一，但所運用的多是神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)和神經營養素-3 (neurotrophin-3，NT-3)等神經營養因子?，F已證明NGF主要作用于感覺神經元，對運動神經元作用不明顯，而BDNF 作用的神經元類型范圍較窄小。許多研究認為，NT-3對神經元的發育、分化以及對受損傷中樞神經元的存活及其軸突再生有重要作用。有研究還證實，NT-3對脊髓損傷處皮質脊髓束神經纖維的再生有明顯的促進作用，這也在我們先前的研究中得到了驗證。目前脊髓損傷后神經再生尚未得到有效解決，損傷處微環境缺乏神經營養因子可能是最關鍵的因素之一。因此，給予外源性神經營養因子是必要的。新近認為，聯合治療策略有望使脊髓損傷修復達到更好的效果，如神經營養因子與生物支架材料聯合應用等。研究表明，由于外源性給藥方式不能滿足在脊髓神經再生過程中的要求，傳統注射神經營養因子等給藥途徑取得的臨床效果并不理想，使得神經營養因子的廣泛應用受到了限制。因此，亟需找到一種理想的承載神經營養因子，且能使其在脊髓損傷處微環境一定時間內維持有效濃度的方法。綜合上述研究中存在的問題，本項發明專利試圖通過在天然生物材料一一多孔隙明膠海綿圓柱體支架內添加NT-3/絲素蛋白，利用絲素蛋白特性將使NT-3結合到明膠上，構建一種用于修復脊髓損傷的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。然后，在此支架內種植骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)。

發明內容
目前，在國內、外尚未見有文獻資料報道用于修復脊髓損傷的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構建方法，尤其是一種含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構建方法及其應用。本發明的目的是想克服現有臨床上治療脊髓損傷所使用的方法上的不足，應用我們自行構建的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料治療脊髓創傷性疾病，可能會更好地促進受損傷脊髓神經再生和功能修復。 本發明的基本方案包括以多孔隙明膠海綿為主體，加入絲素蛋白和NT-3，外面應用PLGA薄膜包裹，形成一種形貌像圓柱體的支架材料。在此基礎上種植骨髓間充質干細胞等，構建成能夠促進脊髓神經再生的人工神經導管。應用時，將其移植到脊髓橫斷性損傷處。本發明有其顯著優點；它是在我們前一項發明專利(一種用于修復神經損傷的明膠海綿圓柱體支架的構建，發明專利號ZL200910040176. 9)的基礎上構建一種能夠緩釋NT-3的明膠海綿圓柱體支架，用于促進受損傷的脊髓神經再生及其功能修復，對危害人民健康較大的創傷性中樞神經疾病進行臨床前研究，將會有力地推動整個創傷性中樞神經疾病防治研究領域的發展。這對延長人類壽命，提高傷病者生存質量，減輕社會和家庭負擔，促進我國社會經濟發展都具有重要意義。本發明將使我國的創傷性中樞神經疾病防治水平居于國際領先水平。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明所用的主要儀器、可降解天然生物材料、可降解高分子合成材料、家蠶蠶繭、神經營養因子、實驗細胞、實驗動物和試劑作詳盡的描述I.主要儀器超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、普通離心機(日本久保田制作所)、低溫高速離心機(美國Eppendorf公司)、5% CO2培養箱(美國Queue公司)、倒置突光顯微鏡 (德國Leica公司)、酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)、恒冷箱切片機(英國Shandon公司)和XL30 FEG型掃描電鏡(德國Philips公司)。2.可降解天然生物材料明膠海綿購自南京金陵藥業股份有限公司的產品。3.可降解高分子合成材料PLGA(50 50)薄膜購自濟南岱罡生物科技公司的產品。4.家蠶蠶繭制備絲素蛋白溶液所用的原料家蠶蠶繭，是由浙江省農業科學院蠶桑研究所贈送的產品。5.神經營養因子人NT-3基因重組蛋白(neurotrophin-3, NT-3 ;購自Sigma公司的產品)6.實驗細胞和實驗動物綠色熒光骨髓間充質干細胞(MSCs，自行分離培養獲取)和綠色熒光蛋白轉基因SD (Sprague-Dawley)大鼠乳鼠(Osaka University, Osaka, Japan)。7.主要試劑DMEM-LG (Gibico)，優級胎牛血清(TBD)，多聚賴氨酸(Sigma)，D-HankJ s 平衡液(自配)，胰蛋白酶(Sigma) ,EDTA(Sangon) ,0. 01mol/l PBS (中杉金橋)，MTT (Sigma), 二甲基亞砜(DMSO) (Sangon)，Hoechst33342 (Sigma)，山羊血清(中杉金橋)等。本發明詳細的具體操作技術說明如下I.緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架的構建所述的緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架的構建可分為4個步驟。第I步驟是制備支架外殼外殼薄壁是環繞圓柱體的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA),其由可降解的高分子合成材料PLGA (聚乳酸與聚輕基乙酸比值為50 50，分子量為100 000)構成。0.02mm厚PLGA薄膜購自山東濟南岱罡生物技術公司，材料的構建方法如下取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中，配成5%溶液，待PLGA完全溶解后，澆注與已調水平的聚四氟模具中，室溫(控制溫度在20°C )，揮發24小時，第2天小心揭下薄膜，反置于模具中24小時，剪裁到適宜大小后干燥保存。將薄膜包繞在直徑為3mm的不銹鋼圓柱磨具上一圈，邊緣用丙酮粘貼，形成直徑為3mm的圓筒狀PLGA外殼。使用時將PLGA外殼剪成2mm長度，酒精浸泡15分鐘，隨后用無菌D_Hank’ s平衡液浸洗3次，每次10分鐘。第2步驟是制備絲素蛋白溶液(I)將20g Na2CO3溶于4升水中，加熱至100°C，放入75g家蠶蠶繭(由浙江省農業科學院蠶桑研究所贈送)，保持溶液微沸，并不斷攪拌。I小時后，倒去溶液。再重復上述過程I次。將煮沸好的蠶繭自然冷卻，用去離子水沖洗干凈，放在烘箱內24小時，50°C烘干后備用。(2)取CaCl244. 40g、乙醇46. 00ml，去離子水57. 60ml制成混合溶液，在此溶液中放入烘干的蠶繭15.00g。使溶液充分浸沒蠶繭后，80°C水浴加熱，攪拌溶解。I小時后，蠶繭全部溶解為絲素蛋白溶液。停止加熱和攪拌，自然冷卻絲素蛋白溶液至室溫。(3)用透析袋(購自于廣州市齊云生物技術有限公司)透析去除絲素蛋白溶液中的鹽離子。前2天用自來水浸泡含有絲素蛋白溶液的透析袋,后I天改用去離子水浸泡，共透析3天。在透析期間，每隔3小時換I次自來水或去離子水。(4)將透析后的絲 素蛋白溶液倒入量筒中，靜置4小時，除去溶液中的固體雜質。用錐形瓶收集靜置后的絲素蛋白溶液，4°C冰箱保存，在I周內使用完畢。(5)取約IOml靜置后的絲素蛋白溶液倒入小燒杯中，60°C烘干。稱量烘干后的絲素蛋白的質量，除以溶液質量，即可得到絲素蛋白溶液
的濃度。計算公式為C = gf^C為絲素蛋白溶液的濃度! 為小燒杯的質量噸為絲素
蛋白溶液與燒杯質量的；m2干燥后絲素蛋白與燒杯質量的和。我們制備的絲素蛋白溶液濃度約為6% 7%。第3步驟是制備負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿(I)取0. 2 y g人NT-3基因重組蛋白(NT-3，購自Sigma公司)溶于Iml絲素蛋白溶液中，混勻。將此混勻的NT-3/絲素蛋白溶液加入到明膠海綿(無菌醫用明膠海綿，購自南京金陵藥業公司)上至飽和。再在4°C冰箱內靜置4小時，接著放入_80°C冰箱冷凍過夜。(2)將冷凍后負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿放入冷凍干燥機中，_80°C真空冷凍干燥12小時。(3)將凍干后的負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿放入帶帽的離心管中，_80°C冰箱保存。在應用負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿前用甲醇處理5分鐘。第4步驟是制備緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架在超凈工作臺中將負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿剪成直徑3mm，厚度2mm大小，其形貌呈圓柱體。再將負載NT-3/絲素蛋白的圓柱體明膠海綿用尖嘴鑷小心塞入消毒好PLGA外殼中。緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架無菌干燥保存待用。2.負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT-3釋放檢測取兩個負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿材料(體積與質量大體相同)，75%酒精消毒10分鐘，用D-Hank’ s平衡液浸洗3次后放置于24孔板中。每孔加入L-DMEM培養液300 iil，于37 °C溫箱中放置。每天定時取出L-DMEM培養液(收集后放入_30°C冰箱保存)，同時補充加入300 ill新的L-DMEM培養液。如此重復到至28天為止。取I天、3天、5天、7天、14天、21天和28天7個時間點的培養液，用ELISA的方法檢測其中的NT-3濃度，并繪制NT-3釋放線條圖。3.負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的形貌及其孔隙大小檢測取I個負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿材料，在干燥的狀態下直接噴鍍金，并在掃描電鏡下觀察、拍照。觀察負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿材料的表面形貌，并在材料中取5個視野，測算其孔隙的直徑與范圍。4.大鼠骨 髓間充質干細胞的體外分離、培養及鑒定參照我們前一項發明專利的骨髓間充質干細胞(MSCs)體外分離、培養及鑒定方法(曾園山，曾湘。一種用于修復神經損傷的明膠海綿圓柱體支架的構建。2011年6月8日獲中華人民共和國發明專利，發明專利號ZL200910040176. 9)。5. MSCs種植于緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料內的過程將緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料在75%酒精中浸泡10分鐘消毒，用D-Hank’s平衡液浸洗3次，將殘留酒精成分清除。獲取P3-P5代骨髓間充質干細胞(MSCs)，棄丟培養液后用D-Hank’s平衡液浸洗I次，用0. 25%胰酶(0. 02% EDTA)消化I分鐘，再用含10% FBS的L-DMEM培養液終止消化。IOOOr/分鐘，離心5分鐘。棄上清，用含10%FBS的L-DMEM培養液重新懸浮MSCs，用計數板計數。按每個支架材料種植2 3 X IO5個細胞/20iU。計算體積后，獲取相應細胞量再離心，后棄上清液。以相應體積的含10% FBS的L-DMEM培養液重新懸浮MSCs。種植MSCs時，要在支架材料上、下兩面加入MSCs懸浮液。最后在支架材料周圍加入少量含10% FBS的L-DMEM培養液過夜，讓支架材料內種植的MSCs更好地貼壁生長。第2天再更換培養液，其量以浸沒支架材料為宜。以后兩天換液I次。在上述培養液中常規加入1%雙抗。6. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內的粘附及其分布檢測取出種植MSCs后培養7天的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，用4%多聚甲醛固定30分鐘，用0. OlM PBS漂洗支架材料3次。將支架材料行連續冰凍切片，片厚25 u m。分別取位于支架材料外側及其中部的橫切片于熒光鏡下觀察MSCs的分布。7. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內的生長活力檢測用MTT方法檢測種植在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內的MSCs生長活力。培養I天、3天、5天和7天后，各時間點各取4個支架材料做MSCs生長活力檢測。每組4個復孔。每孔加入MTT(5mg/ml，即0. 5% MTT) 50 U I和L-DMEM培養液450 y 1，37°C繼續孵育4小時。棄丟上清液，每孔加入DMSO 350 u 1，脫色搖床上劇烈搖晃20分鐘。將每孔的DMSO溶液分別轉移到另一 96孔板中，每個支架材料加3個復孔，每孔100 yl。在酶聯免疫監測儀上選擇波長490nm，測定各孔的光密度值。以各分組為橫坐標，光密度值(0D值)為縱坐標,繪制MSCs生長活力線條圖。8.掃描電鏡觀察MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架上的生長狀態取第I天、7天的支架材料用0. OlM PBS沖洗5分鐘X2，后以2. 5%戊二醛0. Imol/L磷酸緩沖液后固定，一般室溫30分鐘左右。隨后用梯度酒精脫水30%酒精，10分鐘；50%酒精，10分鐘Xl ;75%酒精，10分鐘Xl ;95%酒精，10分鐘Xl ;100%酒精，15分鐘XI。然后，將支架材料放置自然干燥，每個支架材料噴金120秒。后行掃描電鏡觀察，并拍照。9.統計學分析MTT方法檢測MSCs生長活力數據，用均數土標準差(f >表示，運用方差分析(one-way AN0VA)。P < 0. 05表不差異有顯著性意義。實驗結果顯示
I.應用PLGA膜包裹負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿構建成緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架如圖I顯示所制備的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的形貌。A.家蠶蠶繭；B. PLGA薄膜；C.醫用明膠海綿；D.左為負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿，右為醫用明膠海綿；E. PLGA薄膜圍卷成的中空圓柱體；F.緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。圖6A顯示緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的低倍大體形貌；圖6B顯示支架內部的高倍形貌結構；2.負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT-3體外釋放曲線如圖2顯示，兩個負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT_3釋放量在第I天最高，隨著體外培養時間的延長，每天的釋放量呈逐漸下降的趨勢。在第28天時，仍有NT-3的釋放。這表明，在28天的觀察期內，每天都有NT-3從負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿中緩慢釋放出來。、3.緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的形貌及其孔隙大小如圖6B顯示，緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的明膠海綿是一種不規則、多孔隙結構材料。隨機取5個高倍視野觀察，其孔隙的大小大部分在30 y m 300 y m之間。4. MSCs的體外培養與純化在MSCs的原代培養過程中，根據其貼壁的特性分離和純化MSCs。第4天后，細胞克隆中的細胞不斷增殖，數目增多，細胞形態變為長梭形、成纖維細胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落。當細胞培養至接近融合時，由相鄰集落爬出的細胞互相融合，成放射狀或旋渦狀排列，細胞長梭形，胞界清楚，胞核飽滿。隨著細胞的傳代，細胞也逐漸趨于純化。當傳到P4代時，細胞形態比較均一，多為長梭形或星形(圖3)。5. MSCs 的鑒定見我們前一項發明專利的MSCs鑒定結果(曾園山，曾湘。一種用于修復神經損傷的明膠海綿圓柱體支架的構建。2011年6月8日獲中華人民共和國發明專利，發明專利號ZL200910040176. 9)。6. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內的粘附及其分布種植7天后，MSCs在支架內分布相對均勻。支架外側橫切片上MSCs (圖4A)比中部的橫切片的MSCs (圖4B)分布均勻。MSCs在支架不同層面的數量，外側層面要比中部層面的多。7. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內生長的活力應用MTT方法檢測顯示，MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內有較好的生長活力(圖5)。MSCs生長活力線條圖表明，MSCs生長活力隨培養時間的延長而逐步增高，第3天生長活力開始明顯增高，一直增高至第7天。8.掃描電鏡顯示MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內生長的形態掃描電鏡顯示MSCs種植到緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內I天和7天的生長形態。如圖6C所示，在第I天，支架材料表面有MSCs附著，細胞多呈梭形，有較短的突起伸出。有些MSCs之間的突起相互接觸。圖6D示第7天支架材料表面有許多MSCs粘附，細胞均勻分布，多數為梭形。它們伸出較長的突起，并相互發生接觸。


圖I.所制備緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的形貌A.家蠶蠶繭；B. PLGA薄膜；C.醫用明膠海綿；D.左為負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿，右為醫用明膠海綿；E. PLGA薄膜圍卷成的中空圓柱體；F.緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。圖2.示兩個負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT-3體外釋放曲線。圖3.體外培養與純化的MSCs。白箭示培養的P4代MSCs (綠色熒光)，它們呈長梭形或星形的胞體，其中含有藍色熒光的細胞核(Hoechst33342標記)。熒光顯微鏡，標尺=40 y m0圖4.種植7天后MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架中的粘附和分布。A.白箭示支架外側橫切片上MSCs的分布；B.白箭示中部橫切片上MSCs的分布。標尺=320 u m圖5. MTT方法檢測MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內的生長活力。 圖6.掃描電鏡顯示MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架中的粘附與分布。A.示支架材料的低倍大體形貌；B.示支架材料內部的高倍形貌結構；C.紅箭示在支架中培養I天的MSCs ；D.紅箭示在支架中培養7天的MSCs。
權利要求
1.一種用于修復橫斷性脊髓損傷的含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其形貌特征是圓柱體支架表面包裹著由聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly D，L-Iactic-co-glycolic acid, PLGA)薄膜構成的薄壁，圓柱體中央填充著負載NT_3/絲素蛋白的明膠海綿；通過負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿吸附種植的干細胞及其分化的細胞，構建成有利于受損傷脊髓神經再生及其功能修復的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。
2.根據權利要求I所述的用于修復橫斷性脊髓損傷的含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其結構特征是所述的圓柱體支架是由外表薄層的PLGA管壁和內部的負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿構成。
3.根據權利要求2所述的用于修復橫斷性脊髓損傷的 含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其成份特征是PLGA中聚乳酸與聚羥基乙酸比值為50 50 ，分子量為100 000。
4.根據權利要求3所述的用于修復橫斷性脊髓損傷的含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其特征是=PLGA構成的管壁厚度為0. 02mm,橫截面直徑為3mm，長度為2mm o
5.根據權利要求2所述的用于修復橫斷性脊髓損傷的含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其特征是負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿為多孔隙結構。
6.根據權利要求5所述的用于修復橫斷性脊髓損傷的含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其結構特征是負載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿為圓柱體，橫截面直徑3mm,長度為2_。
7.根據權利要求I所述的用于修復橫斷性脊髓損傷的含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其特征是所吸附種植的細胞為骨髓間充質干細胞或神經干細胞。
全文摘要
本發明涉及一種用于修復脊髓損傷的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構建方法，尤其是一種含有干細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構建方法及其應用。應用時將種植有干細胞及其分化細胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架移植到橫斷性脊髓損傷處，可更好地促進受損傷中樞神經再生和功能修復。本發明在生物組織工程水平上加強對橫斷性脊髓損傷后保護受損傷神經元、促進其軸突再生、提高傷病者生存質量、減輕社會和家庭負擔，促進我國社會經濟發展有重要意義。
文檔編號A61L27/54GK102727936SQ20121020520
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者張可, 曾園山 申請人:中山大學