聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，其制備方法以及聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體及其制備方法，所述載體包含聚乙烯亞胺衍生物和脂質(zhì)成分，其中聚乙烯亞胺衍生物與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為0.05∶1-20∶1，優(yōu)選1∶1-8∶1；所述載體的粒徑為1-100,000nm，優(yōu)選10-500nm。本發(fā)明還涉及聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米藥物，其由包載有藥物的所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體構(gòu)成。
【專利說明】聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，其制備方法以及聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因治療的遞送載體領(lǐng)域，具體地，一種脂質(zhì)體復(fù)合載體，其制備方法和包載有藥物的所述載體。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療主要通過向靶細(xì)胞或組織中引入外源的DNA或RNA片段以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷或抑制異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療的目的。在基因治療中，基因遞送技術(shù)包括將目的基因、基因片斷或短鏈干擾RNA導(dǎo)入到靶細(xì)胞內(nèi)以達(dá)到治療目的的方式。基因遞送技術(shù)和用于基因遞送的系統(tǒng)(如載體等)是基因治療的關(guān)鍵，也是基因治療從實(shí)驗(yàn)研究階段走向臨床應(yīng)用階段的重要挑戰(zhàn)。
[0003]理想的基因遞送技術(shù)的載體應(yīng)具備以下特征:(I)靶向特異性；(2)穩(wěn)定性，容易制備；(3)無毒性；(4)有利于基因高效遞送和長期表達(dá)。近年來，陽離子脂質(zhì)體已經(jīng)成為基因遞送技術(shù)中非常廣泛而具代表性的一種，其屬于非病毒載體。
[0004]伴隨著研究的深入和市場的擴(kuò)大，各國研究者也在不斷的開發(fā)適合市場應(yīng)用的具有高的基因遞送效率、高的生物相容性、高的體內(nèi)靶向性的新型基因遞送載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一方面提供一種聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體。其是在傳統(tǒng)陽離子脂質(zhì)體的基因遞送系統(tǒng)的研究基礎(chǔ)上，將脂質(zhì)體技術(shù)與納米聚合物膠束技術(shù)結(jié)合而構(gòu)建的，是一種制備簡單、成本低廉、安全性好、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因遞送系統(tǒng)。
[0006]本發(fā)明另一方面提供一種制備上述聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的方法。
[0007]本發(fā)明另一方面提供一種聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物，其由包載有藥物的上述聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體構(gòu)成。
[0008]本發(fā)明中的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體包含聚乙烯亞胺衍生物和脂質(zhì)成分，其中聚乙烯亞胺衍生物與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為大約0.05: 1-20: 1，優(yōu)選大約1:1-8:1;粒徑為大約l-100，000nm，優(yōu)選大約10_500nm。
[0009]本發(fā)明所述的脂質(zhì)成分包括膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3 β-Ν_(Ν’，Ν’_ 二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿中的一種或多種，優(yōu)選選自膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺、卵磷脂或3β-[Ν-(Ν’，N’ - 二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇，及其組合。
[0010]本發(fā)明中所述的聚乙烯亞胺衍生物可溶于極性有機(jī)溶劑如氯仿、二氯甲烷、乙醇等，以及水中，其重均分子量在大約1000-1，000，000道爾頓之間。其優(yōu)選選自聚乙烯亞胺
基三(十二烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十六烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基-油酸，及其組合。`
[0011]本發(fā)明所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體可以通過聚乙烯亞胺衍生物與脂質(zhì)成分的復(fù)合來制備含聚乙烯亞胺和脂質(zhì)成分的納米顆粒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述制得到納米顆粒可以利用聚乙烯亞胺表面的-NH2或脂質(zhì)成分如1，2 二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG所含的功能化基團(tuán)羧基、氨基等與蛋白或抗體進(jìn)行偶聯(lián)，以制備表面修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體。
[0012]本發(fā)明中所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的制備方法包括但不限于乳化蒸發(fā)法，薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、復(fù)乳法、離心法等。
[0013]其中乳化蒸發(fā)法的步驟包括:將聚乙烯亞胺衍生物和脂質(zhì)成分共溶于極性有機(jī)溶劑中混勻作為有機(jī)相，得到的混合物中聚乙烯亞胺衍生物質(zhì)量濃度約1% -100%，脂質(zhì)成分的質(zhì)量濃度約0.1% -60% ;水相為含質(zhì)量濃度約0.1% -20%吐溫-80的0.9%的生理鹽水或PH在大約6-9之間的緩沖液；將上述得到的水相與有機(jī)相混合，水相和有機(jī)相的體積比為約1: 6-6: 1，進(jìn)行超聲乳化，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去所述極性有機(jī)溶劑。
[0014]其中薄膜分散法的步驟包括:將殼聚糖長鏈烷基季銨鹽(最終質(zhì)量濃度1% -100% )和脂質(zhì)成分(最終質(zhì)量濃度0.1% -60% )共溶于有機(jī)溶劑如氯仿中，混勻作為有機(jī)相；除去有機(jī)溶劑使成薄膜，然后加入水相通過振蕩使脂質(zhì)膜水化，其中使用的水相為0.9%的生理鹽水或pH約為6-9的緩沖溶液。
[0015]本發(fā)明中所述的脂質(zhì)成分包含構(gòu)成普通脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)體的脂類，如選自膽固醇、卵磷脂、二油酰脂酰乙醇胺ΦθΡΕ)、3β-[Ν-(Ν’，Ν’_ 二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺，及其組合。
[0016]本發(fā)明所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體可以包載有藥物以制備聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物。
[0017]所述的藥物包括有機(jī)藥物、水溶性藥物、水不溶性藥物、基因DNA/siRNA、探針和診斷試劑，如治療基因、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環(huán)胞苷)、直接影響和破壞DNA結(jié)構(gòu)及其功能的藥物(如氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉬、絲裂霉素、喜樹堿)，及其組合。
[0018]本發(fā)明所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體可以用一些特定功能的蛋白進(jìn)行表面修飾；所用的蛋白修飾劑選自表皮生長因子(EGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”三肽序列(RGD),以及單克隆抗體曲妥珠?單抗(Trastuzumab),及其組合。使用以上物質(zhì)對載體進(jìn)行表面修飾的方法包括直接對所述復(fù)合納米載體的表面修飾或先制備含活性成分的前體物質(zhì)再進(jìn)行組裝等方法。
[0019]如此得到的EGF抗體修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體對EGF受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞SMMC-7721和MCF-7等，具有靶向性。EGF抗體修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的制備方法優(yōu)選為先制備在水相中濃度為約0.l-5mg/mL的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的納米粒，然后使用偶聯(lián)劑將EGF抗體偶聯(lián)到納米粒的表面，其中所用的聚乙烯亞胺衍生物、脂質(zhì)成分和EGF抗體的質(zhì)量濃度分別為約1% -100%,0.1% -60%，和
0.1% -39%。
[0020]本發(fā)明所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體可以用于對藥物和基因的遞送、緩釋、控釋、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥特性及對疾病的診斷和治療。本發(fā)明的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體作為基因轉(zhuǎn)染的非病毒載體時(shí)，與商業(yè)可獲得的陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine? 2000相比,具有更低的細(xì)胞毒性和更高的基因轉(zhuǎn)染效率。
【具體實(shí)施方式】 [0021]實(shí)施例1:聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的制備
[0022]稱取聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨(PQA)(季銨鹽取代度為90.0 %，重均分子量為1，OOODa) 15.0mg，DOPE 12.0mg共溶于3.0ml 二氯甲烷中，振蕩均勻得溶液I，放入茄形瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾，并不時(shí)的通入氮?dú)猓敝炼燃淄閾]發(fā)完全，然后室溫真空干燥24h后，再用pH = 7.4的5.0mL PBS緩沖溶液II超聲水化10分鐘(薄膜法)；或?qū)⑷芤篒和溶液II共混乳化，超聲10分鐘，待形成穩(wěn)定的乳液后放入茄形瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾至二氯甲烷揮發(fā)完全；得PQA/D0PE納米粒。
[0023]所得的聚乙烯亞胺脂質(zhì)體復(fù)合納米載體是一種陽離子高分子脂質(zhì)體載體。類似的可用其他脂質(zhì)成分代替DOPE制備聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體。
[0024]實(shí)施例2:轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的制備
[0025]以轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體PQA/D0PE為例，具體的實(shí)驗(yàn)過程如下:
[0026]如實(shí)施例1所述制備質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的聚乙烯亞胺脂質(zhì)體復(fù)合納米載體PQA/D0PE溶液50mL(pH = 7.4的PBS緩沖液)備用；80mg轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于2mL ρΗ=7.4的PBS緩沖液中備用；將上述二備用溶液混合。1.065mg SPDP (N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡基二硫)_丙酸酯)溶于80μ I無水乙醇，在攪拌下將SPDP滴加入上述溶液中，25°C反應(yīng)40分鐘。離心超濾4次除去未反應(yīng)的SPDP和其它小分子物質(zhì)，得轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)體復(fù)合納米載體PQA/D0PE。
[0027]實(shí)施例3 =EGF抗體修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的方法。
[0028]配置溶有EGF抗體(質(zhì)量濃度為1.0mg/mL)的PBS溶液(pH = 7.4，濃度0.1mol/L)備用；配置如實(shí)施例1所制備的質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體(PQA/D0PE溶液)備用；將EGF抗體溶液和PQA/D0PE納米溶液按體積比為1:1進(jìn)行混合，加入EDC(1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)(1.0mg/mL)和NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)(0.5mg/mL)，混合均勻，反應(yīng)10-48小時(shí)，之后透析，除去未反應(yīng)的EDC和NHS,凍干后備用。Img聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體可連接有0.08mg EGF抗體。
[0029]使用以上方法可類似地制備其它抗體修飾的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體。
[0030]實(shí)施例4:聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物
[0031]稱取聚乙烯亞胺基-油酸(重均分子量為2，0000&)1511^，卵磷脂1511^，膽固醇
8.0mg,溶于3ml 二氯甲烷中，振蕩均勻得溶液I，然后放入茄形瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾，并不時(shí)的通入氮?dú)猓敝炼燃淄閾]發(fā)完全，然后室溫真空干燥24h ;稱取3.0mg長春新堿溶于5mlPBS(pH = 7.4)緩沖溶液中，搖勻使長春新堿充分溶解得水溶液II ;然后將上述5.0ml長春新堿溶液II加入爺形瓶中，在超聲的條件讓脂質(zhì)薄膜充分水化，超聲IOmin后，過凝膠分離柱分離游離的藥物得包載有長春新堿的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物。使用此方法制備的包載有長春新堿聚乙烯亞胺脂質(zhì)體納米載體的包封率可達(dá)90.0%以上，且在Tris-HCl (pH = 7.4)緩沖溶液中具有良好的緩控釋功能。[0032]用類似方法也可分別制得由包載了其它水溶性藥物的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體構(gòu)成的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物，只須將需要的水溶性物質(zhì)溶于相應(yīng)的水溶液II既可。
[0033]實(shí)施例5:聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物
[0034]本實(shí)施例為制備載基因聚乙烯亞胺脂質(zhì)納米粒的探討。
[0035]配制質(zhì)量濃度為lmg/mL的PQA/D0PE溶液備用；配置質(zhì)量濃度為1.0g/L的綠色熒光蛋白(PEGFP)質(zhì)粒的溶液備用；在室溫下，將二者按質(zhì)量比為3: I進(jìn)行混合，孵育20-30分鐘后得到載有基因的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的溶液。
[0036]實(shí)施例6:聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0037]轉(zhuǎn)染的方法包括以下步驟:
[0038](I)轉(zhuǎn)染前24h，將生長狀態(tài)良好的乳腺癌MCF-7細(xì)胞常規(guī)消化后種板，無抗生素全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度應(yīng)達(dá)到80% ；
[0039](2)播種細(xì)胞24h之后，移除培養(yǎng)孔中的全培養(yǎng)基，洗后，每孔加入無血清的培養(yǎng)基使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)；
[0040](3)將實(shí)施例5的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物及陽性對照加入細(xì)胞培養(yǎng)版中，前后晃動(dòng)培養(yǎng)板使其充分混勻；
[0041](4)將細(xì)胞培養(yǎng)版置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24_48h ；
[0042](5) 24h之后取出培養(yǎng)版置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，并將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞常規(guī)消化并清洗后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析或用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行定量。
[0043]結(jié)果表明，實(shí)施例5所制備的所制備的包載綠色熒光蛋白質(zhì)粒的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物在293T(市購 )和NIH-3T3(市購)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率與陽性對照陽離子脂質(zhì)體LipofeCtamineTM2000相當(dāng)，但前者與后者相比在L929細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞)具有更低的細(xì)胞毒性。
[0044]盡管本發(fā)明的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體、聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物及其制備方法已通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法改動(dòng)，更具體地說，所有相類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
【權(quán)利要求】
1.一種聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，包含聚乙烯亞胺衍生物和脂質(zhì)成分，其中聚乙烯亞胺衍生物與脂質(zhì)成分的質(zhì)量比為0.05: 1-20: 1，所述載體的粒徑為1-100，OOOnm。
2.權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，其中所述質(zhì)量比為1: 1-8: I。
3.權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，其中所述粒徑為10-500nm。
4.權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，其中所述的脂質(zhì)成分選自膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-[Ν-(Ν’，N’ - 二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿，及其組合。
5.權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，其中所述的聚乙烯亞胺衍生物選自聚乙烯亞胺基三(十二烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十六烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基三(十八烷基)氯化銨、聚乙烯亞胺基-油酸，及其組合。
6.權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體，其中所述載體用選自表皮生長因子，血管內(nèi)皮生長因子，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽，以及曲妥珠單抗，及其組合，的蛋白修飾劑進(jìn)行表面修飾。
7.權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體的制備方法，包括以下步驟: a)將聚乙烯亞胺衍生物和脂質(zhì)成分溶于極性有機(jī)溶劑中，混勻得到含有質(zhì)量濃度1% -100%的聚乙烯亞胺衍生物和質(zhì)量濃度0.1%~60%的脂質(zhì)成分的有機(jī)相； b)制備水相，其為含質(zhì)量濃度0.1 %~20%吐溫-80的0.9%的生理鹽水或pH為6-9的緩沖液； c)將水相與有機(jī)相按體積比1: 6-6: I混合進(jìn)行超聲乳化； d)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去極性有機(jī)溶劑。
8.—種聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物，其由包載有藥物的權(quán)利要求1-6所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米載體構(gòu)成。
9.權(quán)利要求8所述的聚乙烯亞胺脂質(zhì)復(fù)合納米基因藥物，其中所述藥物選自治療基因、RB基因、p53基因、紫杉醇、消炎痛、甲氨蝶呤、順鉬、絲裂霉素、喜樹堿、阿霉素、光輝霉素、長春堿、依托泊苷，及其組合。
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK103566374SQ201210261860
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】王華茂, 趙紅霞, 梁曉飛, 宋波 申請人:上海銳勁生物技術(shù)有限公司