專利名稱：一種雞傳染性支氣管炎病毒減毒疫苗株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程和免疫領域，具體地，為一種雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus, IBV)的減毒株、減毒株的衍生毒株以及其在IBV防治接種、疫苗組合物制備中的應用。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(AvianInfectious Bronchitis, IB)是 IBV(InfectiousBronchitis virus, IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性傳染病。IBV自然感染主要發生于雞，各種年齡的雞都易感。傳染性支氣管炎病毒主要侵害雞的呼吸道，腎臟和輸卵管。臨床癥狀多見于六周齡以內的雞，感染率高，但死亡率低。肉雞感染之后，主 要降低食物轉換率、增重緩慢、同時可能出現繼發感染，造成屠宰合格率低。10日齡以內的雌性雛雞感染后，往往導致永久性輸卵管破壞；但也危害育成雞和產蛋雞群，使之抵抗力降低、產蛋量及蛋的品質下降。目前世界上流行著許多血清型/基因型的IBV。過去IBV的分型是按血清中和反應來確定血清型的。各血清型之間無交叉保護作用或交叉保護作用很低。隨著分子生物學技術的發展，目前常常用Si蛋白的基因的核苷酸和氨基酸序列的比較來確定其基因型。在所有已知血清型中，馬薩諸塞血清型(Massachusetts,以下簡稱Mass或M41)分布和流行最廣，幾乎世界各地有IBV的國家均有該血清型的流行。根據國內外的研究報道，IBV不同血清型/基因型的分布具有明顯的地域特征。Pan J. Y.等從青島地區分離并鑒定出了一種腺胃型IBV毒株，命名為QX株(1999，Genebankaccess No. :AF193424)。后來在2004年，劉勝旺等報道在我國免疫雞群和非免疫雞群中也分離到QX基因型毒株，但病雞多以腎炎為主。最近幾年除呼吸道癥狀和腎臟變化外，雌性雛雞感染后輸卵管出現囊腫也非常常見。我國大陸當前同時流行多個血清型/基因型的IBV毒株，其中類QX型毒株(簡稱QX-like，亦稱LX4_type)是最主要的優勢流行株，比例超過50%，部分地區甚至高達75%。從2003年以來，類QX基因型IBV已在許多國家廣泛流行，如荷蘭、比利時、法國、德國、意大利、俄羅斯、韓國等，除呼吸道癥狀和腎臟變化外，雌性雛雞感染后輸卵管常出現囊腫。美國常用的IBV疫苗株I) Mass-type血清型如H120或Ma5 ；2) Delaware血清型如 DE072 ；3)Georgia 血清型如 GA98 ；4) Connecticut 血清型；5) Arkansas 血清型等。歐洲常用的IBV疫苗株l)Mass-type血清型如H120或Ma5或H52 ;2) 4/91或793B血清型；3)D274血清型；4)D1466血清型；5)類QX基因型等。我國廣泛使用的疫苗均屬于Mass-type血清型的毒株，包括H120、H52、Ma5和W93。當前國內流行毒株除Mass-type血清型外，還有相當一部分在遺傳進化關系上與Mass-type疫苗毒株存在較大差異，因此我國已有疫苗不能有效地預防IB流行毒株的攻擊。研究開發具有較好保護力的新血清型或基因型的疫苗，同時還能與Mass-type血清型IB減毒疫苗聯合應用顯得尤為重要，本發明研究開發了一種新的雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株，解決了以上所述問題。

發明內容
本發明的目的就是提供一種可用于保護禽類宿主以抵抗傳染性支氣管炎的減毒病毒株及其應用。在本發明的第一方面，提供了一種雞傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitis virus, IBV)的減毒株，所述減毒株是雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05，保藏號為 CCTCC. V201232。在本發明的第二方面，提供了衍生自第一方面所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株的衍生病毒株。
在另一優選例中，所述衍生病毒株具有以下一個或多個特性(a)低毒力毒力與CCTCC.V201232的毒力相近或相同；(b)所述的衍生病毒株中SI基因的第1-1643位的核苷酸序列如SEQ ID NO. : I所示；(c)所述衍生病毒株表達的SI蛋白的第54位氨基酸為異亮氨酸(Ile)；(d)所述衍生病毒株表達的SI蛋白的第1-547位如SEQ ID NO. :2所示。本發明的減毒株和所述衍生病毒株安全性好可用于肉雞、蛋雞和種雞的免疫接種；可用于一日齡或一日齡以上(如2-9日齡)雞的免疫接種；和/或可用于蛋雞和種雞在產蛋期間的免疫接種。在本發明的第三方面，提供了一種疫苗組合物，所述組合物含有疫苗上可接受的載體和本發明所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株。在另一優選例中，所述的載體是獸藥學上可接受的載體或藥學上可接受的載體。在另一優選例中,所述疫苗組合物為二價疫苗或多價疫苗。在另一優選例中，所述疫苗組合物還含有一種或多種針對選自下組的血清型的IBV疫苗株(a) M41 血清型，如 Hl20 或 Ma5 或 W93 或 H52 ；(b)4/91 或 793B 血清型。在另一優選例中，所述的疫苗組合物是含保藏號為CCTCC. V201232的減毒株和M41血清型(如H120疫苗株)的二價疫苗組合物。在另一優選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。在另一優選例中，所述的疫苗組合物每劑量中含有103_° IO5 5雞胚半數感染量EID50的減毒株。在另一優選例中，所述的疫苗組合物包括滴鼻劑、點眼劑型。在本發明的第四方面，提供了一種制備雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株的方法，包括步驟在家禽胚卵中，對保藏號為CCTCC. V201232的雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05進行傳代，從而制得減毒株。在另一優選例中，所述的傳代次數為1-1000次，較佳地2-200次。在本發明的第五方面，提供了本發明所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株的用途，即用于制備疫苗組合物。
在另一優選例中，所述的疫苗組合物用于保護禽類宿主以抵抗傳染性支氣管炎。在另一優選例中，所述的禽類宿主包括雞。在本發明的第六方面，提供了一種制備疫苗組合物的方法，包括步驟(a)對保藏號為CCTCC. V201232的雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05進行傳代或培養，從而制得減毒疫苗株；(b)將步驟(a)中制備的所述減毒疫苗株與免疫上可接受的載體混合，從而制得疫苗組合物。在本發明的第七方面，提供了一種雞傳染性支氣管炎(IBV)的雙價疫苗，所述雙 價疫苗是包含(i)本發明所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株和(ii)M41血清型(如IBV-H120疫苗株)的聯合疫苗。在本發明的第八方面，提供了一種對家禽進行接種的方法，包括步驟給需要的家禽接種本發明所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株，或接種本發明第三方面中所述的疫苗組合物。在另一優選例中，所述家禽包括雞、鴿子、雉雞。在另一優選例中，所述的家禽包括1日齡及I日齡以上的雞。在另一優選例中，所述的接種方式包括滴鼻接種、點眼接種、飲水接種、氣霧接種。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了 IBV-KL05與其他基因型IBV毒株SI基因的核苷酸序列比對結果。圖2顯示了 IBV-KL05與其他基因型IBV毒株SI蛋白的氨基酸序列的比對結果。圖I和圖2中，1-6分別表示以下序列1. AY842862. 1W93. seq ;
2.M21970. lstrainH120. seq ；3. AF352315. 1H52. seq ；4. AY189157. 1_LX4. seq ；5. AF193423. 1_QX. seq ；6. IBV-KL05. seq。結果表明，IBV-KL05 與 IBV-LX4 及 IBV-QX 同一性很高(大于95%)，屬于同一基因型。圖3顯示了本發明減毒株IBV-KL05與其他多種IBV毒株的SI蛋白氨基酸第1-100位的比對結果。其中，IBV-KL05.seq為本發明減毒株的序列。結果顯示，本發明減毒株的區別于其它IBV的顯著特征是S1蛋白的第54位氨基酸為異亮氨酸(Ile)。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而具體的研究，對IBV強毒株進行連續傳代致弱，首次意外地獲得了一種減毒株IBV-KL05，該減毒株能夠非常有效地對抗IBV類QX、IBV-QX，因此可開發為預防傳染性支氣管炎的疫苗。此外，該減毒株還可與其他血清型的減毒株(例如M41血清型)形成良好的雙價或多價疫苗，以對抗IBV類QX、IBV-QX以及IBV-M41等不同的病毒株。在此基礎上完成了本發明。術語
本發明中，所述的“雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus,IBV) ”、“ IBV”、“雞染性支氣管炎病毒”、“雞傳染性支氣管炎病毒IBV”可以互換使用，均指雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)。如本文所用，術語“IBV-KL05”指保藏號為CCTCC. V201232的減毒株(或減毒疫苗株)。該減毒株也稱為“IBV-KL05 MVS”。如本文所用，術語，“ IBV-KL05 MVS+3”是衍生自CCTCC. V201232的、經過3次傳代
的衍生減毒株。如本文所用，術語“減毒株”和“減毒疫苗株”可互換使用，都指減毒的、可作為疫苗活性成分使用的病毒株。毒株來源及分離 本發明的毒株來源為2010年山東省某肉雞場疑似的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)感染，肉雞出現腹瀉及呼吸道癥狀，剖檢發現，病雞腎臟腫大。采集氣管、肺及腎臟組織，制成10%組織懸液，接種到9 11日齡的SPF雞胚尿囊腔，接種后18 48小時收獲尿囊液(進行連續傳代，收集每一代尿囊液)。大部分雞胚在接種I 7天后死亡，并表現出典型的IBV病變。將收集的尿囊液提取RNA，根據IBV病毒SI基因序列設計引物，通過RT-PCR擴增得到目的片段，并直接用PCR產物進行測序。將測序結果與已知序列進行比對后，證明本公司分離的病毒為IBV，并在核苷酸和氨基酸水平上與IBV-LX4type或類IBV-QX基因型相似(同源率達95%以上)。將該分離株命名為IBV-QD01，可在9 11日齡SPF雞胚上進行傳代。減毒方法和減毒株在本發明中，通過對雞傳染性支氣管炎病毒強毒株(IBV-QDOl)進行連續傳代，從而獲得了一種效果優異的減毒株。在一優選例中，傳代減毒方法包括使用9 11日齡SPF雞胚對IBV-QDOI病毒株進行連續傳代培養，每代接種2 3枚雞胚的尿囊腔，每胚接種100 200 μ 1，置于37 380C，濕度為45% 60%培養18 48小時后，無菌收集雞胚尿囊液，進行下一次傳代，連續傳代70代以上并進行克隆，進行病毒滴度測定并進行致弱性評價后，獲得了 6株理想的克隆株。一株優選的克隆株是雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05，并于2012年8月2日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢)，保藏號為CCTCC. V201232。研究表明，IBV病毒的S蛋白N-末端在跨越內基質網內膜時可被蛋白酶切除10個疏水氨基酸構成的信號肽，并被裂解切割為Sl(90kDa)和S2(84kDa)亞單位多肽，SI蛋白分子量約為90kDa，由520 538個氨基酸組成，S2約為84kDa，由625個氨基酸組成。通常，可以通過SI基因的核苷酸序列來表征不同的病毒株。幾種病毒株的SI基因的核苷酸序列比對結果示于圖1，SI蛋白的氨基酸序列比對結果示于圖2。本發明CCTCC.V201232的SI基因的部分序列(對應于編碼SI蛋白第I 547位的基因)示于SEQ ID NO. :1，其編碼的SI蛋白第1_547位的氨基酸序列示于SEQ ID NO. :2。應理解，對于本發明減毒株IBV-KL05的各基因序列(包括SI基因序列)而言，應以保藏號CCTCC. V201232的減毒株的序列為準。
本發明人研究表明，本發明病毒株區別于其它IBV的一個顯著特征是所表達的SI蛋白的第54位氨基酸為異亮氨酸(Ile)(見圖3)。疫苗組合物本發明還提供一種防治IBV的組合物，所述組合物是指將本發明的減毒株和免疫(學)上可接受的載體混合后獲得的可用于防治IBV的組合物，尤其是疫苗組合物。在本發明中，免疫(學)上可接受的載體指適合用于疫苗的載體，包括獸藥學可接受的載體和藥學上可接受的載體。“獸藥學可接受的載體”或“藥學上可接受的載體”指用于治療劑(如減毒株或滅活的成分)給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
可接收的載體指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。此外，本發明的疫苗組合物還可含有額外的佐劑。代表性的疫苗佐劑包括(但并不限于)以下種類無機佐劑，如氫氧化鋁，明礬等；有機佐劑，微生物及其產物如分枝桿菌(結核桿菌、卡介苗)、短小桿菌、百日咳桿菌、內毒素、細菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷等；油劑，如費氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。施用方式和應用本發明的主要應用為給需要的家禽接種所述的IBV的減毒株或其衍生病毒株，或接種由其制得的疫苗組合物，激活禽類體內免疫反應并保護禽類宿主以抵抗傳染性支氣管炎。本發明中，所述的禽類包括(但并不限于)雞、鴿子、雉雞，尤其是用于肉雞，蛋雞和種雞的免疫接種。本發明的減毒株或疫苗組合物，可用于一日齡或一日齡以上(如2 9日齡)雞的免疫接種。此外，可在蛋雞和種雞在廣蛋期間進彳丁免疫接種。在進行給藥時，多種給藥方式都是可用的。例如，所述的疫苗組合物可以通過滴鼻免疫、點眼免疫、注射免疫、飲水免疫和氣霧免疫。在進行給藥時，活性成分(減毒株)通常在103_° IO5 5EID5tl每劑量以產生良好的免疫效果。接種次數通常為I次、2次或3次。在本發明中，免疫接種一次后的免疫持續期，通常為至少6周。本發明的主要有益效果包括I.免疫效果確切本發明可對IBV-QX、類QX、LX4等產生良好的免疫效應，能夠很好地防治禽類的IBV感染，免疫持續時間達6周及以上。2.接種時間早，對幼齡禽類無致病性本發明可接種于I日齡的幼雞，不會誘發產生氣管、腎臟及雌性的生殖系統的破壞。3.與其他IBV疫苗免疫相容性良好本發明能與M41血清型活疫苗共同制備成聯合疫苗或與其他IBV強毒共同制備成聯合滅活疫苗，不影響其免疫效果。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。通用方法I.病毒滴度測定 取待檢病毒，進行10倍系列稀釋；選稀釋倍數為10_3 10_6或10_5 10_8的病毒懸液每個稀釋度分別接種5枚9 11日齡的SPF雞胚，每胚接種100 μ I，置于37. 8°C，濕度為45% 60%的溫箱內孵育7 10天(18 19日齡)，每天照胚，接種后24小時內死亡的雞胚為非特異性死亡，棄去不計，記錄7 10天內雞胚的感染數和存活數,按Reed-Muench或 Spearman-Karber 法計算 EID5002.氣管環纖毛停滯試驗2. I 步驟用過量麻醉劑處死雛雞。用剪刀剪開皮膚，用鑷子分離皮膚，暴露氣管。將分離好的氣管放入單獨的容器中，加入足量的無血清細胞培養基，使液面沒過氣管。晃動容器，以保證培養基浸潤氣管。將氣管取出，放入平皿中，并編號，去除多余的脂肪和組織。總共切下10個環，厚為2mm左右的氣管環(會厭部下方取3環，氣管中段4環，氣管底部3環)。將切下的氣管環放入培養皿中或玻璃載玻片上，用無血清培養基保證氣管切片濕潤，置于低倍顯微鏡下觀察。從雞處死到觀察氣管纖毛活動情況應在2小時之內完成。2. 2結果判定根據下列“氣管纖毛停滯試驗評分系統”進行評分。低倍顯微鏡下觀察氣管切片，按判定標準，分別評為0-4分，如下O分所有纖毛活動I分75%纖毛活動2分50%纖毛活動3分25%纖毛活動4分無纖毛活動每個氣管應有10個數據，總得分最大為40分。分值越大，證明病毒復制能力越強，相對致病性越強。2. 3免疫效力試驗的結果判定由于IBV即使強毒接種后，在實驗室條件下動物臨床表現不明顯，尤其是兩周齡以上的雞，因此無法準確、客觀評價保護力。IBV進入動物體內首先感染氣管粘膜，然后才在別的器官上皮細胞復制，如腎臟上皮細胞或輸卵管上皮細胞，IBV在上皮細胞復制之后導致細胞變性，最終使被感染器官出現病理變化。臨床癥狀的嚴重程度，取決于多種因素，比如病毒的毒力，被感染器官，是否有繼發感染以及雞只的健康狀態，總的來說，IBV強毒感染雞之后，一般都會引起氣管纖毛活動停滯。若保護了氣管纖毛活力，也就阻止了 IBV進入別的器官。因此，目前國外(比如歐洲獸藥典)常常采用氣管纖毛停滯試驗，判定雞傳染性支氣管炎疫苗的效力。攻毒后5至7天，處死雞后，立即取出氣管，將分離好的氣管放入生理鹽水或無血清細胞培養基中37°C保存備用。用時將氣管取出，放入平皿中，并編號，去除多余的脂肪和組織。總共切下10個環，厚為2mm左右的氣管環(會厭部下方取3環，氣管中段4環，氣管底部4環)。將切下的氣管放入培養皿中，用生理鹽水或無血清細胞培養基保證氣管切片濕潤，置于顯微鏡下觀察。氣管環纖毛活力大等于50%的氣管環纖毛活動正常被認定為受到了保護，每只雞10個氣管環，至少有9個氣管纖毛活力被認定為受到了保護，可判定該雞得到了保護。氣管環從雞處死到觀察氣管纖毛活動情況應在2小時 之內完成。3.無菌檢驗和支原體檢驗按現行《中華人民共和國獸藥典(三部)》附錄進行無菌檢驗和支原體檢驗。4.外源病毒檢驗分別將病毒株，按現行《中華人民共和國獸藥典(三部)》附錄進行外源病毒檢驗。取病毒樣品(病毒效價約為107_°_7_6EID5tA 0ml)，不稀釋與抗IBV特異性抗血清混合，進行中和后作為待檢樣品。4. I.用雞胚進行外源病毒檢驗(病毒的特異性檢驗)將9 11日齡SPF雞胚24枚分成2組第I組10枚雞胚，經尿囊腔內接種O. 2ml經處理的樣品；第2組10枚雞胚，經絨毛尿囊膜接種O. 2ml經處理的樣品；第3組4枚雞胚作為不接種對照；所有雞胚置于37. 8°C，濕度為45% 60%的溫箱中培養7日。對所有接種24小時后存活的雞胚進行觀察，檢查有無異常。對絨毛尿囊膜進行觀察，檢查有無異常，并對尿囊液進行血凝抗原檢測。4.2.用細胞培養物進行外源病毒檢測對兩個細胞培養瓶(每瓶25cm2)的SPF雞胚成纖維細胞(CEF)單層，接種中和后的病毒液O. 2ml，在37°C下吸附I小時，觀察5日，檢查是否出現由接種物引起的CPE ;用雞紅細胞進行紅細胞吸附試驗，棄去培養液，并洗滌單層細胞，加入O. 1%紅細胞懸液，在4°C吸附60分鐘，用緩沖液洗滌2次細胞后，在顯微鏡下觀察，是否出現CPE和紅細胞吸附現象。4. 3. ELISA對禽白血病病毒檢測對兩個細胞培養瓶(25cm2)的SPF CEF單層，各接種不中和不稀釋的病毒樣品，O. 2ml每瓶，吸附60分鐘，棄去培養液，加入細胞生長液，次日換成維持液。同時設立正常細胞作為對照。培養5 7日，按常規方法消化，收獲細胞，將其中1/2作標記置-60°C檢驗用(P1)，其余細胞分在兩個細胞瓶中。培養7日后，按同樣方法收獲細胞，留樣(P2)，如此繼續傳第3代，收獲細胞(P3)，所有對照同樣處理。將P1、P2、P3和所有對照凍融3次。同時設立陽性對照按“中華人民共和國獸用生物制品質量標準”對每份樣品進行ELISA試劑盒(購自中監所)對禽白血病病毒檢測。5. IBV的致病性試驗5. I對氣管的致病性試驗取7只I日齡SPF雛雞，分為兩組，第一組5只，滴鼻感染IBV病毒，每只IO4 5EID5tl;第二組2只，為正常對照組，不接種。每天觀察期臨床癥狀。接種6天后，將所有雞剖殺，觀察氣管和腎臟的病理變化，取其氣管進行氣管纖毛停滯試驗，觀察氣管纖毛活動情況，根據評分系統判定其致病性。IBV病毒(如IBV-QDOI)感染雞之后，一般都會引起氣管纖毛活動停滯。在纖毛停滯試驗中，每只雞的總評分數超過25分，并且越接近于40分，被認為該病毒毒力越強。
5. 2對雌性雞生殖系統安全性試驗取51只4日齡雌性SPF雛雞，分為兩組，第一組46只，為接種試驗組，每只雛雞點眼和滴鼻接種IBV病毒(如IBV-QD01) IO5 5EID50 ;第二組5只，為正常對照組，不接種。接種11周后，將所有雞剖殺，觀察輸卵管有無異常。對于減毒毒株，方法同上，不同點在于采用I日齡雌性SPF雛雞。6. IBV雞胚傳代毒株的致弱評價試驗在傳代致弱過程中，取雞胚傳50代(EP50)和雞胚傳70代(EP70)進行致弱評價。每個試驗取12只I日齡SPF雛雞，分為兩組，第一組10只，滴鼻感染相應的IBV雞胚毒，每只10“EID5(I;第二組2只，為正常對照組，不接種。每天觀察期臨床癥狀。接種6天后，將所有雛雞剖殺，觀察氣管和腎臟的病理變化，取其氣管進行氣管纖毛停滯試驗，觀察氣管纖毛活動情況，根據評分系統判定其致病力。實施例I減毒株的制備使用9 11日齡SPF雞胚對IBV-QDOl病毒株(可購自上海啟盛生物科技有限公司)進行連續傳代培養，每代接種2 3枚雞胚的尿囊腔，每胚接種100 200 μ 1，置于37. 80C，濕度為45% 60%培養18 48小時后，無菌收集雞胚尿囊液，進行下一次傳代，連續傳代70代以上并進行克隆，進行病毒滴度測定并進行致弱性評價后，獲得了 6株理想的克隆。收毒后再接種雞胚，再進一步擴增一代，無菌收集尿囊液作為下一步動物試驗的病毒材料。一株優選的克隆株是雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05 (InfectiousBronchitis Virus, IBV)，于2012年8月2日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢)，保藏號為CCTCC. V201232。將基于CCTCC. V201232用于后續試驗的減毒原始株稱為IBV-KL05 MVS(原始種毒)，減毒原始株在雞胚中額外傳代3代的衍生減毒株稱為IBV-KLO5MVS+3。實施例2減毒株免疫保護作用在本實施例中，測試了 IBV-KL05株對不同血清型強毒的免疫攻毒保護試驗。方法如下試驗取80只I日齡SPF雛雞，分為五組。
I 2 組每組 20 只，點眼接種 IBV-KL05MVS+3,每只 IO3'5EID50 ；3組20只，點眼接種IBV-H120疫苗，每只IO3 5EID50 ；4 5組為正常對照組，每組10只，不接種。接種后三周，進行攻毒，第1、3和4組攻毒用強毒為IBV-QDOl，第2組和第5組攻毒用強毒為IBV-M41,點眼和滴鼻,攻毒劑量均為每只104_5EID5(i。每天觀察期臨床癥狀。攻毒后6天做氣管環纖毛停滯試驗，觀察氣管纖毛活動情況，來判定其免疫效力。結果IBV_KL05對IBV-QDOU基因型)強毒攻毒的保護力很好，高達95%，對IBV-M41 (血清型)強毒攻毒有一定的保護力，為45%。IBV-H120疫苗對IBV-QDOl強毒攻毒的保護力較弱，為40%。由此可認為，本發明的減毒株可有效地引發針對IBV的免疫保護，具體如表I : 表I
權利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus, IBV)的減毒株，其特征在于，所述減毒株是雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05，保藏號為CCTCC. V201232。
2.—種權利要求I所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株的衍生病毒株； 優選地，所述衍生病毒株具有以下一個或多個特性 (a)低毒力毒力與CCTCC.V201232的毒力相近或相同； (b)所述的衍生病毒株中SI基因的第1-1643位的核苷酸序列如SEQID NO. : I所示； (c)所述衍生病毒株表達的SI蛋白的第54位氨基酸為異亮氨酸(Ile)； (d)所述衍生病毒株表達的SI蛋白的第1-547位如SEQID NO. :2所示。
3.一種疫苗組合物，其特征在于，所述組合物含有疫苗上可接受的載體和權利要求I 所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株。
4.如權利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物為二價疫苗或多價疫苗。
5.如權利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還含有一種或多種針對選自下組的血清型的IBV疫苗株 (a)M41血清型，如Hl20或Ma5或W93或H52； (b)4/91或793B血清型。
6.一種制備雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株的方法，其特征在于，包括步驟在家禽胚卵中，對保藏號為CCTCC. V201232的雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05進行傳代，從而制得減毒株。
7.權利要求I所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株的用途，其特征在于，用于制備疫苗組合物； 更佳地，所述的疫苗組合物用于保護禽類宿主以抵抗傳染性支氣管炎。
8.一種制備疫苗組合物的方法，其特征在于，包括步驟 (a)對保藏號為CCTCC.V201232的雞傳染性支氣管炎減毒疫苗株IBV-KL05進行傳代或培養，從而制得減毒疫苗株； (b)將步驟(a)中制備的所述減毒疫苗株與免疫上可接受的載體混合，從而制得疫苗組合物。
9.一種雞傳染性支氣管炎(IBV)的雙價疫苗，其特征為，所述雙價疫苗是包含(i)權利要求I所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株和(ii)M41血清型(如IBV-H120疫苗株)的聯合疫苗。
10.一種對家禽進行接種的方法，其特征在于，包括步驟給需要的家禽接種權利要求I所述的雞傳染性支氣管炎病毒的減毒株或其衍生病毒株，或接種權利要求3所述的疫苗組合物。
全文摘要
本方法涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒減毒疫苗株及其應用。本發明人對雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)進行傳代致弱，成功地獲得了一種IBV減毒株CCTCC.V201232及其衍生病毒株。本發明的減毒株及衍生病毒株可用于制備預防傳染性支氣管炎的疫苗組合物。實驗表明，本發明的減毒株和疫苗組合物接種于幼齡禽類后，可有效激活禽類體內的免疫系統并對雞傳染性支氣管炎有良好的預防作用。
文檔編號A61P31/14GK102851257SQ20121030887
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月27日 優先權日2012年8月27日
發明者侯艷霞, 張超, 董文龍, 寇芮 申請人:上海啟盛生物科技有限公司