專利名稱：鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽性免疫不育中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療男性抗精子免疫不育的新藥物，屬于生物醫藥領域的發明。
背景技術：
男性不育的原因非常復雜，其中抗精子免疫性因素是非常重要的方面林寶英.抗精子抗體與免疫性不育[J]·皖南醫學院學報，2004，23 (1):71 73 ;[2]萬霞·免疫性不育與抗精子抗體，實用醫技雜志，2007，14 (21) :2926— 2927。一項關于男性不育癥病因的研究發現，抗精子免疫性不育高達29. 9%向桂橋，陳榮安，張益康，等.6498例男性不育癥病因分析[J]·南華大學學報醫學版，2005，33(2):211-223。抗精子抗體(AsAb)介導的免疫性不育已證實為男性不育的重要原因之一。目前，WHO已把免疫性因素列為男性不育常規檢查的項目。·
男性抗精子免疫性不育是指以精子作為抗原，在體內激發免疫反應所引起的不育。正常情況下，由于生殖免疫屏障的存在，機體不會對自身精子產生免疫反應。但在病理狀態下，由于血睪屏障的破壞，就會造成精子或其可溶性抗原成分的逸出，誘發機體產生抗精子抗體(AsAb)。AsAb可對體內精子產生細胞毒作用，影響精子受精過程和受精卵及胚胎的發育，造成生殖障礙。泌尿生殖道的感染和阻塞等因素有可能與抗精子抗體產生有關。抗精子抗體導致男性不育的機理十分復雜，可在抵制和降低精子獲能、頂體反應穿越透明帶和精卵融合、受精卵甚至胚胎發育等多個環節上影響生育。抗體引起的精子制動、精子凝集，精子的運動能力下降等，都有可能使其不能達到女性生殖道的受精地點。此外，AsAb所具有的細胞毒效應，在補體的參與下，也可造成精子死亡或失去活力。精漿的中TNF-α、IL-6、IL-2的過度表達也不同程度參與了發病。目前，對男性抗精子免疫性不育的治療尚缺乏高效特異的方法。現有的治療首先是去除病因，其次是降低患者體內的抗精子抗體的滴度。現代醫學藥物治療主要是類固醇激素江海身.男性不育的診斷與治療.中國性科學，2007，16 (7): 18-21。其他如采用免疫阻斷和輔助生育技術。輔助生育技術因條件所限，一般難以廣泛推廣。而激素類藥物的毒副作用和可能存在的其他風險，使得其臨床應用非常謹慎。近年來，國內學者在采用中醫藥或中西醫結合的方法治療該病方面取得了一定的成績。但目前有關中藥在這方面的研究缺乏系統性，尤其是作用機理不清楚。鹽酸青藤堿，是從中藥青風藤[防已科植物青藤sinomenium acutum(Thumb)Rehd. et Wils 毛青藤 sinomenium acutum (thumb) Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd.Et Wils的莖或根莖]中提取的青藤堿的鹽酸鹽。研究證實，鹽酸青藤堿具有顯著的免疫抑制作用，和抗炎、鎮痛作用。目前由該成分制成的口服片劑和注射液在臨床使用。商品名為“正清風痛寧”的系列產品即為由鹽酸青藤堿制成的系列藥品制劑，目前，該類制劑批準用途為治療類風濕性關節炎、強直性脊椎炎、慢性腎炎等疾病，有非常確切的療效，近年來，對鹽酸青藤堿抗炎、免疫作用機理的研究不斷深入，但是，尚未見到有鹽酸青藤堿治療男性抗精子免疫不育的研究報道，本專利的申請，是關于首次發現鹽酸青藤堿抗精子免疫免疫不育治療作用新用途的研究結果。本發明的目的是提供一種治療男性抗精子抗體陽性免疫性不育的新藥劑，為男性抗精子抗體陽性免疫性不育的臨床治療開辟新的治療途徑。

發明內容
一、本發明的技術方案為
第一步明確鹽酸青藤堿的來源及確定已有鹽酸青藤堿制劑作為藥品在臨床應用。每二步研究證實鹽酸青藤堿對抗精子陽性免疫不育的治療作用并分析其作用機制，包括
I:模擬制備男性抗精子免疫性不育的動物模型
2:對模型動物采用鹽酸青藤堿進行治療，并設陽性對照與空白對照。3:考察治療藥物對模型動物生殖力的影響，將治療后雄鼠與雌鼠合籠交配，通過觀察所交配雌鼠的妊娠率與胚胎數與發育情況，考察鹽酸青藤堿對免疫性不育動物模型生殖力的影響。4 :對鹽酸青藤堿治療男性抗精子免疫不育的作用機理進行分析。觀察指標包括經鹽酸青藤堿治療后模型動物血清和精漿中的抗精子抗體滴度、精子的數量和質量、與抗精子免疫相關的細胞因子、及生精組織與細胞的形態學。二、本發明的有益效果為
I.免疫性不育模型動物經鹽酸青藤堿治療后生育力較模型對照明顯增強，所交配雌鼠的受孕率提高、胚胎數增加，且胚胎發育正常。2.鹽酸青藤堿顯著降低抗精子免疫不育雄性大鼠血清中的抗精子抗體水平，劑量增加后作用增強，與模型組比較有統計學差異。3.鹽酸青藤堿能對抗與精子免疫相關的部分細胞因子表達。降低精漿中的腫瘤壞死因子(TNF-α )、白細胞介素6 (IL-6)、白細胞介素2 (IL-2)的含量，與模型組比較有統計學意義。4.鹽酸青藤堿可改善抗精子免疫不育大鼠的精子數量和質量，使精子數量增加、精子的活率和活力均明顯提高，與模型組比較有統計學意義。5.睪丸組織病理學檢查證實，鹽酸青藤堿可改善抗精子抗體陽性大鼠睪丸組織中治療后的動物較對照組的成熟精子增多。三、本發明的具體實施方式
為
對鹽酸青藤堿來源及制劑產品的研究
鹽酸青藤堿是從中藥青風藤防已科植物青藤sinomenium acutum (Thumb) Rehd. etWils 或毛青藤 sinomenium acutum (thumb) Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils的莖或根莖中提取的生物堿單體——青藤堿，再制備成可供藥用的鹽酸鹽，目前，已有獲得國家藥品監督管理局批準生產的鹽酸青藤堿制劑在臨床使用，目前常見的片劑、緩釋劑和注射液均有此作用。青藤堿來源的原植物
青藤堿是從中藥青風藤防已科植物青藤sinomenium acutum (Thumb) Rehd. et Wils或毛青藤 sinomenium acutum (thumb) Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils 的莖或根莖中提取的生物堿單體。青藤Sinomenium acutum (Thun b. )Rehd. Et Wils0 為落葉纏繞藤本。莖帶木質，枝綠色，葉互生，花小，單性，雌雄異株；種子半月形。藥用其干燥藤莖部分。藤莖呈細長圓柱形，直徑5 20毫米，外表灰褐色，有縱皺及橫向皮孔，節處膨大。體輕，質堅實而脆，易折斷，斷面灰黃色或淡灰棕色，不平坦。橫切面韌皮部很窄，木質部導管與射線呈放射狀排列，導管較大，中央為圓形的髓。氣弱，味苦。毛青藤 sinomenium acutum(thumb)Rehd. et Wils. Var cinereum Rehd. EtWils，外表特征與青藤相似，維管束數稍多。青藤堿的提取工藝
是從青風藤中提取青藤堿已經有了比較成熟工藝，回流提取和超聲提取的方法為目前常用的提取工藝。 (一)回流提取法
采用回流提取法提取青藤堿時，優選出青風藤中青藤堿最佳提取工藝為用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次I. 5h，該提取工藝還可進一步優化為以7. 5% 10%的熟石灰、I. 8倍量水進行堿化，用I. 5倍量工業苯回流提取。產品經紫外分光光度法測定，青藤堿含量大于95%。(二)超聲提取法
以苯為溶劑，采用超聲法也可從青風藤中提取青藤堿。超聲提取物經活性炭脫色和重結晶得到青藤堿，青藤堿的產率為2. 12%，含量為98. 73%。使用超聲提取分離青藤堿不影響其分子結構、操作簡便，所得產品的含量與回流提取法基本相近，但高效液相色譜檢測時，雜質峰較回流提取法多。、青藤堿的理化性質
青藤堿由氫菲核及乙胺橋組成，類似嗎啡，分子式C19H23NO4,分子質量329. 39Da,其性狀為長絲狀晶體，熔點161°C，熔化后熔點又升至182°C，易溶于氯仿、丙酮、乙醇和堿液中，微溶于水、乙醚和苯，較難溶于乙酸乙酯中，其鹽酸溶液加三氯化鐵呈草綠色，鹽酸鹽為長針狀晶體，熔點233°C，易溶于水
O1
青藤堿的化學結構式
(二).對鹽酸青藤堿治療男性抗精子免疫不育治療作用的研究
I.實驗材料 1.1實驗動物
SPF級SD性成熟大鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，體重180 220g。實驗藥物 1.2. I受試藥物
鹽酸青藤堿片(商品名正清風痛寧片)。國藥準字號Z43020278。由湖南正清制藥集團股份有限公司生產，批號1001109，規格24片/盒，每片含20mg鹽酸青藤堿。I. 2. 2陽性對照藥物
醋酸潑尼松片(強的松片)國藥準字號H33021207，由浙江仙琚制藥股份有限公司生產，批號:100875，規格:5mg/片。實驗試劑
M199培養液賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；
Freund完全佐劑美國Sigma公司；
大鼠抗精子抗體(AsAb)、白細胞介素-6 (IL-6)、白細胞介素-2 (IL-2)腫瘤壞死因子α (TNF-α )酶聯免疫試劑盒均由長沙力生試劑公司提供。·
主要實驗儀器
島津UV-1750紫外可見分光度計(島津儀器公司)；RT-6000全自動酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；
Reichert Histo STAT 820型切片機為美國生產，MOTIC BISERLES型顯微攝影系統為麥克奧迪(廈門)醫療診斷系統有限公司產品。實驗方案
2.1抗精子抗體陽性免疫不育大鼠模型的建立
模型的制備參照文獻[I]:張淑芹，溫海霞，趙林山，等.抗精子陽性大鼠動物模型的建立[J].中國比較醫學雜志，2003，13 (6) :370-373; [2]:張瑋，張輝，邊淑玲，等.NO對抗精子抗體陽性大鼠精予凋亡的影響[J].中國男科學雜志，2003，17(6) :384-386方法并加以改進，采用人工主動免疫法造模，共免疫三次，在第三次免疫后于大鼠眼眶采血，分離血清，用酶聯免疫法檢測血清的抗精子抗體(AsAb)滴度，與正常對照動物比較應有明顯增加，具體過程如下
2. I. I制備大鼠佐劑性精子抗原
取性成熟雄性大鼠若干只，用頸椎脫白法處死，立即取出雙側附睪，在滅菌紙上除去血液和脂肪組織，然后在2ml生理鹽水中剪碎附睪，37°C靜置lOmin，使精子充分游出，用孔徑200 μ m尼龍網過濾，濾液置37°C培育20min后用血球計數板調精子數為3X 109/ml，與等量完全弗氏佐劑混勻，在乳缽中充分研磨，直至呈“油包水”狀，即為精子的免疫性抗原。同種異體注射佐劑性精子抗原制備抗精子抗體陽性大鼠模型
取性成熟雄性大鼠(體質理180—220g)，除正常對照組外，其余各鼠均以制備的上述精子抗原O. 5ml，在雙側腹股溝及頸背部脊柱兩側皮下多點注射作為首次抗原免疫，分別采用了于首次免疫后的第10天在原部位I次注射免疫攻擊、和在首次免疫后的第10天和第20天，在原部位2次注射免疫攻擊的方法進行模型制備，正常組給予O. 5ml生理鹽水注射作為對照，在免疫攻擊完成后第7天，采血檢測血清中的抗精子抗體(AsAb)滴度，檢測方法采用酶聯免疫分析法，具體操作按試劑盒要求，用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中大鼠抗精子抗體(AsAb)濃度。結果，用精子與弗氏佐劑制備的佐劑免疫抗原進行攻擊，2次免疫攻擊與I次攻擊比較，大鼠經2次免疫攻擊后，血清中抗精子抗體滴度升高更顯著，見表1，表明制備抗精子抗體陽性免疫不育模型，采用同種異體精子抗原2次免疫注射攻擊更為可靠。表I.同種異體精子抗原不同免疫攻擊次數的大鼠血清AsAb檢測結果
權利要求
1.本發明提供了一種鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽性免疫不育中的應用。
2.如權利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽性免疫不育中的應用，即為臨床使用的鹽酸青藤堿有治療男子抗精子抗體陽性免疫不育的作用。
3.如權利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽性免疫不育中的應用，證明鹽酸青藤堿可顯著降低人或動物血清的抗體水平和與抗精子免疫相關的部分細胞因子表達，精子數量增加、活率和活力明顯提高，有增強模型動物生育力作用。
4.如權利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽性免疫不育中的應用，證明經鹽酸青藤堿治療后男性抗精子抗體陽性免疫不育的生育力較模型對照明顯增強，所交配雌鼠的受孕率提高、胚胎數增加，且胚胎發育正常。
5.如權利要求I所述的鹽酸青藤堿在治療男性抗精子抗體陽性免疫不育中的應用，證明目前常見的鹽酸青藤堿片劑、緩釋劑和注射液均有此作用。
全文摘要
本發明提供了一種治療男性抗精子抗體陽性免疫性不育的新藥劑，該藥劑為已被批準在臨床使用的鹽酸青藤堿。本項目首次發現鹽酸青藤堿用于治療男性抗精子抗體陽性免疫性不育的新用途。
文檔編號A61K31/485GK102908348SQ20121034584
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者邱賽紅, 吳紅娟, 朱傳湘, 鄒龍 申請人:湖南中醫藥大學