專利名稱：一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種寡糖，涉及一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法，該寡糖利用菌株與龍須菜的共培養制備而成，具有抗氧化、防紫外線等生理活性。
背景技術：
寡糖是指由2 20個相同或不同單糖構成的直鏈或支鏈低度聚合糖類物質，又稱低聚糖，包括普通寡糖和功能性寡糖兩大類。普通寡糖中有人們熟悉的蔗糖、麥芽糖、乳糖等，這些糖可以被機體消化吸收，對腸道有益菌并無生長促進作用，另一類是功能性寡糖，例如果寡糖、低聚木糖、大豆低聚糖、殼寡糖、瓊膠寡糖、褐藻膠寡糖等，它們本身不能被機體消化吸收，但具有多種生理活性，在食品、農業等領域有著廣闊的市場空間。 海藻寡糖近年來被發現具有重要的生理活性，其中來自江籬、石花菜等紅藻的瓊膠寡糖研究得較為廣泛。例如中國專利CN200410024380. 9中所主張的瓊膠寡糖具有益生元的作用，中國專利CN03138973. 2專利中所主張的瓊膠低聚糖混合物可用作制備降血糖的藥物或者食品添加劑，中國專利CN1171592C專利中所主張的瓊膠低聚寡糖具有成纖維細胞生長促進作用以及紫外線氧化損傷保護作用等。但至今瓊膠寡糖的應用仍然較少，影響其應用開發的瓶頸因素主要在于制備方法。目前瓊膠寡糖的制備過程都是先從江籬、石花菜等紅藻中提取出瓊膠，然后再用化學法或酶法將瓊膠降解為分子量更小的寡糖。例如中國專利CN01115094. 7，CN021132573. 1，CN03138971.6等分別主張采用不同的化學方法降解瓊膠獲取低聚糖；中國專利CN03112515. 8，CN03112518. 2，CN200310114439. 9等主張利用天然菌或者基因工程菌所獲得的瓊膠酶制劑進行瓊膠低聚糖的制備等。但是無論是化學法還是酶解法都存在較為嚴重的缺點，包括①這些方法都只能作用于瓊膠等海藻多糖，而從海藻中提取海藻多糖需經過堿、酸反復處理和反復的水洗，造成了嚴重的污染和水資源的消耗；②酶解法需先經過酶制劑的大規模制備，然后才能應用于多糖的降解。但是酶制劑的制備對儀器設備的要求高，提高了生產成本，并使整體工藝復雜化；③目前仍然缺乏高效的瓊脂酶，導致瓊膠寡糖無法得到大規模生產和應用；④化學法生產的瓊膠寡糖分子量不均一，產品質量不穩定，難以進行大規模生產。目前僅有美國使用大西洋假單胞菌的瓊膠酶制備瓊膠低聚糖的產品，但價格昂貴，無法滿足開發和生產的要求。我國海藻養殖規模龐大，本發明所涉及的龍須菜是一種江蘺屬海藻，也是我國主要的海藻養殖品種之一，其經濟價值主要來自于提取瓊膠和作為鮑魚飼料，處于低值化利用階段。本發明采用菌株與龍須菜共培養的方法，利用微生物所產的酶系直接降解龍須菜得到瓊膠寡糖，可解決限制瓊膠寡糖應用開發中的上述問題，實現龍須菜的高值化利用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法。本發明的第2目的在于提供龍須菜瓊膠寡糖在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中的應用。所述龍須菜瓊膠寡糖是利用太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2與龍須菜共培養，利用菌株所產的酶系直接降解龍須菜獲得聚合度為4 8的瓊膠寡糖，具有抗氧化、吸收紫外線等生理活性。所述太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacif ica) H2由本發明人自行分離得到，并于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012229,地址為中國武漢大學(郵編430072)。樣品的來源為太平洋深海5378m深處的泥樣(E157° 24' 31"，N19° 30' 30〃)。菌株的篩選分離和培養方法為將深海沉積物2g放入30mL含1%經60 80目過篩的龍須菜粉末的2216E液體培養基中，于4°C中富集。然后將富集液稀釋1000倍，涂布于含1%經60 80目過篩的龍須菜粉末的2216E平板上，于16°C培養。將得到的菌株進一步純化保種，并進行鑒定。本發明所述龍須菜瓊膠寡糖的制備方法如下
I)將菌株太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica) H2用活化培養基平板進行活化后，接種于種子培養基中，振蕩培養得發酵液；2)將步驟I)中得到的發酵液接種入產糖培養基中，繼續振蕩發酵培養后離心，收集上清液；3)采用膜過濾設備，將上清液依次用O. 45 μ m，0. 22 μ m濾膜，10000 50000D超濾膜和300 600D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖。在步驟I)中，所述活化培養基平板可為含經60 80目過篩后的龍須菜粉末1%，酵母膏O. 2%，NaC13%，瓊膠粉I. 5%，蒸餾水配制，經121°C，20min滅菌后使用；所述種子培養基可為含CMC-Na2O. 5% I. 5%，酵母膏O. 2%，NaC13%，蒸餾水配制，經121°C，20min滅菌后使用；所述振蕩培養的條件可為在25 37°C條件下，250r/min振蕩培養至OD6tltl = I. O
I.5。在步驟2)中，所述產糖培養基可為含經60 80目過篩的龍須菜粉末1% 5%，MgCl2O. 1% O. 5%，蒸餾水配制，經121°C，20min滅菌后使用；發酵液的接種比例可為5% ;所述振蕩發酵培養的條件可為在25 37°C條件下，300r/min振蕩發酵培養24 72h。在步驟3)中，所述發酵液離心的條件可為10000Xg離心15min ;所述濾膜可為卷式有機膜。本發明所述龍須菜瓊膠寡糖可在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中應用。本發明中所述龍須菜瓊膠寡糖制備工藝的優點是I.采用菌株與龍須菜共培養，利用菌株所產的酶系，一步法直接獲得瓊膠寡糖。而現有研究報道或專利中所述酶解法制備寡糖均需要多個步驟，主要包括由產瓊膠酶菌株發酵制備瓊膠酶、由龍須菜等海藻提取瓊膠、將瓊膠酶與瓊膠進行反應以獲得寡糖等。本發明中的工藝具有明顯的創新性，且工藝簡單、無污染、成本低、效率高，具有很好的實用性。2.在產糖培養基中利用低濃度的MgCl2代替發酵中常用的NaCl (濃度一般在1%以上)，不僅減少對發酵設備的腐蝕，而且降低了海藻寡糖后續純化的成本。本發明中所述龍須菜瓊膠寡糖的生理活性特征為具有顯著的抗氧化性，包括對CCl4引起的小鼠急性肝損傷，和百草枯造成的果蠅死亡具有明顯的保護作用；具有很強的吸收短、中波紫外線的活性。在目前所公開的海藻寡糖相關專利中，CN1843325A所主張的海藻寡糖為褐藻膠寡糖，主要用于化妝品防曬、保濕的活性；CN1843153A所主張的海藻寡糖主要用于飼料添加劑；CN1593433A所主張的瓊膠寡糖作為益生元用于動物和人體。因此，本發明中所獲得的瓊膠寡糖的活性均未見其它研究報道或專利。CN1843325A所主張的海藻寡糖雖然提到具有防曬活性，與紫外吸收活性相關，但該專利所述海藻寡糖為褐藻膠寡糖，并非本發明中所述瓊膠寡糖。綜上所述，本發明中所制備的瓊膠寡糖具有明顯的創造性和實用性。


圖I為龍須菜活性寡糖的薄層層析分析。在圖I中，M :從上到下依次為分別為Neoagarotetraose, neoagarohexaose 和 neoagarooctaose 標準品；1，2:龍須菜瓊膠寡糖。圖2為肝臟切片HE染色結果。圖3為龍須菜瓊膠寡糖全波長掃描圖。在圖3中，橫坐標是波長(nm)，縱坐標為絕 對強度Abs。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步詳細描述，但本發明不僅僅局限于以下實施例。實施例I龍須菜瓊膠寡糖的微生物發酵法制備I)將菌株太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培養基(含經60 80目過篩的龍須菜粉末1%，酵母膏O. 2%，NaCl3%,瓊膠粉I. 5%，蒸餾水配制，pH7 8，經121°C滅菌20min后使用)進行活化后，挑取單菌落接種于種子培養基(含CMC_Na2l%，酵母膏O. 2%，NaC13%，蒸餾水配制，pH7 8，經121°C滅菌20min后使用)中，在30°C的條件下振蕩培養至 OD6tltl = 1.0;2)將發酵液按照3%的接種比例加入產糖培養基(含經60 80目過篩的龍須菜粉末3%，MgCl2 O. 25%，蒸餾水配制，pH7 8，經121°C滅菌20min后使用)中，繼續在30°C條件下振蕩發酵培養48h ；3)將發酵液經IOOOOXg離心15min，收集上清液；4)采用膜過濾設備，將上清液依次用0.4511111，0.2211111濾膜，300000超濾膜和300D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖；5)用DNS法測定寡糖濃度，于10°C以下溫度中保存。所得龍須菜瓊膠寡糖成分的薄層層析圖參見圖1，所制備的寡糖為4 8糖的混合物。以下給出所得龍須菜瓊膠寡糖抗氧化生理活性的實驗驗證。I.龍須菜瓊膠寡糖對小鼠四氯化碳急性肝損傷的保護作用小鼠腹腔注射CCl4后，CCl4在肝臟中酶的催化下產生自由基使細胞膜發生脂質過氧化,從而破壞細胞膜結構和功能的完整性,使細胞質內酶類滲入血液中，導致血清酶活性發生改變，同時使細胞發生氣球樣變和壞死，這一過程可選擇性的破壞小葉中央區的肝細胞。動物實驗
實驗動物及分組選用健康的雄性、BALB/c小鼠，6 7周大小，體重18 20g。按隨機分組的方法將小鼠分為4組，每組3只。第I組為高劑量龍須菜瓊膠寡糖給藥組，第2組為低劑量龍須菜瓊膠寡糖給藥組，第3組為空白對照組，第4組為CCl4損傷對照組。給藥量及方法A組灌藥量為200mg/ (kg. BW)，B組灌藥量為150mg/ (kg. BW)，C、D組每日灌等量滅菌蒸餾水。各組連續灌7天，7天后對A、B、D組小鼠按lmL/kg體重的用量腹腔注射CCl4(按照2 5的比例將CCl4稀釋于液體石蠟中)，注射48h后眼球取血分離血清，解剖取肝臟進行分析。小鼠觀察指標的測定主要觀察指標為小鼠體重、肝重、血清ALT含量和肝臟病理組織檢查。小鼠體重在取血前稱量，肝重在解剖后進行稱量。血清中的ALT含量采用賴氏法進行測定，將血清稀釋50倍左右后用ALT試劑盒測得其吸光度值；將得到的賴氏法單位換算回酶單位IU/L，在25°C條件下I卡門氏單位=0. 4821 U/L。而肝臟病理組織檢查采用 蘇木精-伊紅(HE)染色法進行觀察，選取小鼠肝臟組織制成石蠟切片后進行HE染色后在電鏡下觀察。實驗結果通過測量各組小鼠的體重、肝重和血清中ALT結果，得到如表I的數據表I
權利要求
1.一種龍須菜瓊膠寡糖，其特征在于所述龍須菜瓊膠寡糖是利用太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica) H2與龍須菜共培養,利用菌株所產的酶系直接降解龍須菜獲得聚合度為4 8的瓊膠寡糖； 所述太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2已于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012229o
2.如權利要求I所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)將菌株太平洋火色桿菌(FlammeovirgaPacifica) H2用活化培養基平板進行活化后，接種于種子培養基中，振蕩培養得發酵液； 2)將步驟I)中得到的發酵液接種入產糖培養基中，繼續振蕩發酵培養后離心，收集上清液； 3)采用膜過濾設備，將上清液依次用O.45 μ m，0. 22 μ m濾膜，10000 50000D超濾膜和300 600D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖。
3.如權利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述活化培養基平板為含經60 80目過篩后的龍須菜粉末1%，酵母膏0.2%，NaCl 3%，瓊膠粉I. 5%，蒸餾水配制，經121°C，20min滅菌后使用。
4.如權利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述種子培養基為含CMC-Na2O. 5% I. 5%，酵母膏O. 2%, NaCl 3%，蒸餾水配制，經121°C，20min滅菌后使用。
5.如權利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述振蕩培養的條件為在25 37°C條件下，250r/min振蕩培養至OD6tltl = I. O I. 5。
6.如權利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述產糖培養基為含經60 80目過篩的龍須菜粉末1% 5%，MgCl2O. 1% O. 5%，蒸餾水配制，經121°C，20min滅菌后使用。
7.如權利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述發酵液的接種比例為5%。
8.如權利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述振蕩發酵培養的條件為在25 37°C條件下，300r/min振蕩發酵培養24 72h。
9.如權利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述發酵液離心的條件為10000Xg離心15min ;所述濾膜可為卷式有機膜。
10.如權利要求I所述一種龍須菜瓊膠寡糖在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中的應用。
全文摘要
一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法與應用，涉及一種寡糖。提供一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法與龍須菜瓊膠寡糖在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中的應用。所述龍須菜瓊膠寡糖是利用太平洋火色桿菌H2與龍須菜共培養，利用菌株所產的酶系直接降解龍須菜獲得聚合度為4～8的瓊膠寡糖，具有抗氧化、吸收紫外線等生理活性。制備時將菌株用活化培養基平板進行活化后，接種于種子培養基中，振蕩培養得發酵液，再接種入產糖培養基中，繼續振蕩發酵培養后離心，收集上清液，采用膜過濾設備，將上清液依次用0.45μm，0.22μm濾膜，10000～50000D超濾膜和300～600D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖。
文檔編號A61K8/60GK102827899SQ20121034710
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者曾潤穎, 產竹華, 萬瑋, 高超 申請人:國家海洋局第三海洋研究所