專利名稱：一種泡騰片式低分子量膠原蛋白肽及其制備方法
技術領域：
本發明涉及膠原蛋白肽提取及應用領域，更加具體地說，具體涉及一種泡騰片式低分子量膠原蛋白肽及其制備方法。
背景技術：
膠原蛋白或稱膠原是由動物(從海綿動物到脊椎動物)細胞合成的一種生物高分子化合物，廣泛存在于動物骨、腱、軟骨和皮膚及其它結締組織中，約占哺乳動物總蛋白1/3，在骨頭與肌腱中約有90%以上，皮膚中約有50%以上的蛋白質為膠原蛋白。而膠原蛋白的水解產物膠原蛋白肽具有抗血壓、調節免疫、抗腫瘤、護膚美容等眾多功效。蛋白質水解產生的膠原蛋白活性肽主要是以化學法和酶法水解而來，化學法以酸或堿斷開蛋白質肽鍵，由于反應環境較極端，不利于活性的保持，而酶解蛋白質生產活性肽的安全性卻很高，能在溫和的條件下進行定位水解分裂產生特定的肽，且水解過程易控制，因而近幾年報道 的活性肽的制備方法均為酶解法。酶的選擇是酶解法生產活性肽的關鍵，而目標活性肽的下游技術則是決定能否將之用于生產的關鍵。對于化妝品級膠原蛋白肽而言，《皮膠原蛋白的酶法提取及在高附加值領域的應用》、《化妝品級水解蛋白質分子量分布的研究》等相關文獻指出分子量低于2KD或IKD左右的膠原蛋白肽可以很好地滲入人體皮膚，達到美容護膚的作用。CN102199649A、CN102154424A、CN102031279A等相關專利以超濾、納濾設備為基礎截獲低分子量的膠原蛋白肽，但是從膠原蛋白肽的提取率上說，這種純化方法有一定的局限性，并且成本較高。目前市面上的膠原蛋白化妝品分子量分布較寬，IKD的膠原肽的比重不高，直接影響膠原化妝品的質量。并且絕大多數化妝品里都含有防腐劑，這增加了安全隱患。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種低分子量膠原蛋白肽的提取方法以及相對應的泡騰片劑型和制備方法。不僅解決現有技術所存在的化妝品中含有人體難以吸收的高分子膠原蛋白的問題，也解決了工業生產中膠原蛋白肽分布范圍寬，得率低的問題；同時首創了不含有防腐劑的膠原化妝品新劑型。本發明的技術目的通過下述技術方案予以實現一種低分子量膠原蛋白肽的提取方法，按照下述步驟進行步驟1，除去豬皮中非膠原性蛋白質選取新鮮豬皮(即原料豬皮)，清洗，浙干，常溫20-25攝氏度的條件下，用O. Imol/Γ0. 15mol/lNaOH水溶液浸泡，料液比為1:25 1:30 (g/ml,即豬皮的質量和NaOH水溶液的體積比)，在100-200轉/min下攪拌18tT24h，以除去豬皮里非膠原性蛋白質，然后過濾，得
豬皮備用。步驟2，脫除豬皮中的脂肪按料液比為l:25 l:30(g/ml，即步驟I處理后的豬皮質量和水的體積比)的比例取水，然后加入占原料豬皮質量29Γ4%的脂肪酶，調整溫度和體系的pH值以使加入的脂肪酶活性達到最大，在100-200轉/min的攪拌條件下脫除脂肪。例如使用脂肪酶(天津市諾奧科技發展有限公司，型號IF-G-NL2)時，使用Na2CO3粉末調節pH值為9 9. 3，35°C恒溫低速100-200轉/min攪拌8h 10h。步驟3，溶膠將脫去脂肪的豬皮置于水中，料液比l:15 l:20(g/ml，即步驟2處理后的豬皮質量和水的體積比)，800C的條件下恒溫加熱，低速100-200轉/min攪拌4tT6h，得到豬皮和水溶性膠原的混合物。步驟4，制備胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液將上一步的豬皮和水溶性膠原的混合物降溫，同時調節混合物溶液的pH值以使加入的胰蛋白酶活性達到最大，加入胰蛋白酶，E/[S]=100(T2500u/g (即每g原料豬皮對應的胰蛋白酶活性為1000-2500U)，低速100-200轉/min攪拌18h_24h。然后將酶解后的蛋 白肽液滅酶活，離心除去不溶物，得到胰蛋白酶酶解蛋白肽液。利用使用胰蛋白酶(天津市諾奧科技發展有限公司，型號YDB-G-035)時，將上一步的豬皮和水溶性膠原的混合物降溫至50°C，保持50°C恒溫。調節混合物溶液的pH=7，加入胰蛋白酶，將酶解后的蛋白肽液置于95°C的環境下5-10min，以滅酶活。步驟5，蛋白肽液脫色配置2wt°/T4wt%的硅藻土的水溶液，抽濾，使濾紙表面形成一層均勻的硅藻土層，以此為過濾介質，對蛋白肽液抽濾。抽濾后的蛋白肽液進入樹脂柱進行分離，得到澄清透明的膠原蛋白肽液。在使用D296R樹脂(南開大學化工廠，全稱為大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂)時，可控制流速為以2ml/min 6ml/min的流速進入D296R型樹脂柱。步驟6，濃縮干燥將澄清透明的膠原蛋白肽液進行真空濃縮和噴霧干燥得膠原蛋白肽粉末。在操作時，可在真空濃縮階段，待體系中出現固形物且固形物質量分數達到整個澄清透明的膠原蛋白肽液體系(即固形物和液體的總質量)的30°/Γ35%時停止濃縮，并進行噴霧干燥。利用上述方法得到的低分子量膠原蛋白肽為原料，制備泡騰片式低分子膠原蛋白肽，具體方案如下泡騰片式低分子膠原蛋白肽，按質量份計，由以下組分組成
碳酸氫鈉20 23份
檸檬酸16 19份
低分子量膠原蛋白肽〗4 18份
蘆薈8 14份
聚乙一.醇60002 4份
甘露醇8~15份
山梨醇22~26份
組分A5 10份
其中所述組分A為5%PVP70%乙醇，稱5gPVP(天津市江天化工技術有限公司，型號為K30，數均分子量6000)，加入70wt%乙醇的水溶液至100g，攪拌溶解混勻即可。各組分優選如下泡騰片式低分子膠原蛋白肽，按質量份計，由以下組分組成
碳酸氫鈉22.2份
檸檬酸17.8份
低分子量膠原蛋白肽15份
) *10 I份
聚乙一.醇60003份
甘露醇12份
山梨醇24份
組分A10份制備所述泡騰片式低分子膠原蛋白肽的方法，按照下述步驟進行將低分子量膠原蛋白肽(粉料)、蘆薈(粉料)、檸檬酸(粉料)分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻后加入組份A后造粒，40— 45°C真空干燥，得到第一顆粒①；將低分子量膠原蛋白肽(粉料)、蘆薈(粉料)、碳酸氫鈉(粉料)分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻后加入組份A后造粒，40— 45 °C真空干燥，得到第二顆粒②；然后將甘露醇，山梨醇，聚乙二醇6000混勻，過80目篩，加入上述第一和第二顆粒①②，混合均勻，迅速轉移至溫度(20 土 2) V、濕度(40 土 5) %無菌操作間中進行壓片制得產品。其中所述甘露醇，山梨醇，聚乙二醇6000三者均為粉末狀固體。在制備第一顆粒和第二顆粒時，優選在44°C真空干燥。在制備第一顆粒和第二顆粒時，可選擇將低分子量膠原蛋白肽(粉料)、蘆薈(粉料)和組分A等用量地分配在第一顆粒和第二顆粒中。本發明的技術方案采用溶膠和酶解工藝，得到分子量集中分布在50(T1600D的膠原蛋白肽，省略了進行納濾或者超濾工藝；硅藻土和樹脂聯合脫色，解決了傳統的活性炭脫色后活性炭再生困難的問題和H2O2脫色后有毒物質殘留的問題，并利用得到的膠原蛋白采用不含防腐劑的壓片式劑型(泡騰片)，更利于皮膚的美容和安全；這些有益的工藝措施使得生產工藝簡單，原料利用率高，安全可靠，生產成本大大降低。


圖I為實施例I膠原蛋白肽分子量的質譜圖(質譜為德國布魯克·道爾頓的型號MALDI-TOF)ο圖2為實施例2膠原蛋白肽分子量的質譜圖(質譜為德國布魯克·道爾頓的型號MALDI-TOF)ο圖3為實施例3膠原蛋白肽分子量的質譜圖(質譜為德國布魯克·道爾頓的型號MALDI-TOF)ο
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術方案。本發明采用市售的分析純原料，使用天津市諾奧科技發展有限公司，型號IF-G-NL2的脂肪酶，天津市諾奧科技發展有限公司，型號YDB-G-035的胰蛋白酶，硅藻土 (青島盛泰硅業有限公司，D30)，D296R樹脂(南開大學化工廠，全稱為大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂)，PVP (聚乙烯吡咯烷酮)購于天津市江天化工技術有限公司，型號為K30，數均分子量6000。使用的二號篩網20目孔徑O. 89毫米，產地浙江上虞市五星沖壓篩具廠；80目篩孔徑O. 2毫米，產地浙江上虞市五星沖壓篩具廠。實施例I(I)除去豬皮中非膠原性蛋白質選取新鮮切碎豬皮500g，清洗，浙干，常溫條件下，用體積為15L的O. 15mol/lNa0 H溶液25°C浸泡，200轉/min攪拌18h，以除去豬皮里非膠原性蛋白質。然后過濾，得豬皮備用。⑵脫除豬皮中的脂肪把步驟(I)處理后的豬皮放入15L清水中，用Na2CO3粉末調清水pH值為9，然后加入2. 5g脂肪酶，35°C恒溫200轉/min攪拌10h。然后過濾，清水洗凈豬皮備用。⑶溶膠將步驟(2)洗凈后的豬皮置于IOL蒸餾水中，80°C恒溫，低速200轉/min攪拌5h，得到豬皮和水溶性膠原的混合物。⑷制備胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液將步驟(3)豬皮和水溶性膠原的混合物降溫至50°C，保持50°C恒溫。調節混合物溶液的pH=7，加入胰蛋白酶，E/[S]=2000u/g，200轉/min攪拌18h，得到胰蛋白酶酶酶解過的蛋白肽液。然后將蛋白肽液置于95°C的環境下8min。離心除去不溶物，取上清液，得膠原蛋白肽液。(5)膠原蛋白肽液脫色配置2wt%的硅藻土水溶液500ml，抽濾，使濾紙表面形成一層均勻的硅藻土層，以此為過濾介質，然后對膠原蛋白肽液抽濾。抽濾后的蛋白肽液以4ml/min的流速進入D296R型樹脂柱，得到澄清透明的膠原蛋白肽液。(6)濃縮干燥將澄清透明的膠原蛋白肽液進行真空濃縮至固形物質量分數為35%，噴霧干燥得膠原蛋白肽粉末，圖I為實施例I膠原蛋白肽分子量的質譜圖，從圖I看出，所制備的膠原蛋白粉的分子量集中分布在50(Tl560Da之間，提取率85%，純度91%。(7)壓片將7. 5g膠原蛋白肽粉、5g蘆薈粉與17. Sg檸檬酸粉分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻，加入5g5%PVP70%乙醇后造粒，44°C干燥，得到顆粒①；將7. 5g膠原蛋白粉、5g蘆薈粉與22. 2g碳酸氫鈉粉分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻，加入5g5%PVP70%乙醇后造粒，44°C干燥，得到顆粒②；然后將12g甘露醇，24g山梨醇，3g聚乙二醇6000混合均勻，過80目篩后，加入上述①②顆粒，混勻，迅速轉移至溫度(20±2)°C、濕度(40±5)%無菌操作間中進行壓片制得泡騰片式膠原蛋白肽泡騰片。實施例2(I)除去豬皮中非膠原性蛋白質選取新鮮豬皮500g，清洗，浙干，常溫條件下，用體積為15L的O. Imol/lNaOH溶液常溫20°C浸泡，低速100轉/min攪拌20h，以除去豬皮里非膠原性蛋白質。然后過濾，得豬皮備用。⑵脫除豬皮中的脂肪把步驟(I)處理后的豬皮放入15L清水中，用Na2CO3粉末調清水pH值為9. 3，然后加入5g脂肪酶，35°C恒溫低速100轉/min攪拌10h。然后過濾，清水洗凈豬皮備用。⑶溶膠 將步驟(2)洗凈后的豬皮置于IOL蒸餾水中，80°C恒溫，低速100轉/min攪拌6h，得到豬皮和水溶性膠原的混合物。⑷制備胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液將步驟(3)豬皮和水溶性膠原的混合物降溫至50°C，保持50°C恒溫。調節混合物溶液的pH=7，加入胰蛋白酶，E/ [S] =2500u/g,低速100轉/min攪拌18h，得到胰蛋白酶酶酶解過的蛋白肽液。然后將蛋白肽液置于95°C的環境下8min。離心除去不溶物，取上清液，得膠原蛋白肽液。(5)膠原蛋白肽液脫色配置4wt%的娃藻土水溶液500ml,抽濾,使濾紙表面形成一層均勻的娃藻土層，以此為過濾介質，然后對膠原蛋白肽液抽濾。抽濾后的蛋白肽液以6ml/min的流速進入D296R型樹脂柱，得到澄清透明的膠原蛋白肽液。(6)濃縮干燥將澄清透明的膠原蛋白肽液進行真空濃縮至固形物質量分數為30%，噴霧干燥得膠原蛋白肽粉末，圖2為實施例2膠原蛋白肽分子量的質譜圖，從圖2看出，所制備的膠原蛋白粉的分子量集中分布在50(Tl600Da之間，提取率87. 2%，純度94%。(7)壓片將7g膠原蛋白肽粉、4g蘆薈粉與19g檸檬酸粉分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻，加入2. 5g5%PVP70%乙醇后造粒，45°C干燥，得到顆粒①；將7g膠原蛋白粉、4g蘆薈粉與20g碳酸氫鈉粉分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻，加入2. 5g5%PVP70%乙醇后造粒，45°C干燥，得到顆粒②；然后將Sg甘露醇，26g山梨醇，4g聚乙二醇6000混合均勻，過80目篩后，加入上述①②顆粒，混勻，迅速轉移至溫度(20±2)°C、濕度(40±5)%無菌操作間中進行壓片制得泡騰片式膠原蛋白肽泡騰片。實施例3(I)除去豬皮中非膠原性蛋白質選取新鮮豬皮500g，清洗，浙干，常溫條件下，用體積為15L的O. Imol/lNaOH溶液常溫20°C浸泡，低速150轉/min攪拌24h，以除去豬皮里非膠原性蛋白質。然后過濾，得豬皮備用。⑵脫除豬皮中的脂肪把步驟(I)處理后的豬皮放入15L清水中，用Na2CO3粉末調清水pH值為9. 2，然后加入5g脂肪酶，35°C恒溫低速150轉/min攪拌10h。然后過濾，清水洗凈豬皮備用。⑶溶膠將步驟(2)洗凈后的豬皮置于IOL蒸餾水中，80°C恒溫，低速150轉/min攪拌6h，得到豬皮和水溶性膠原的混合物。⑷制備胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液將步驟(3)豬皮和水溶性膠原的混合物降溫至50°C，保持50°C恒溫。調節混合物溶液的pH=7，加入胰蛋白酶，E/ [S] =1000u/g,低速150轉/min攪拌18h，得到胰蛋白酶酶酶解過的蛋白肽液。然后將蛋白肽液置于95°C的環境下5min。離心除去不溶物，取上清液，得膠原蛋白肽液。(5)膠原蛋白肽液脫色
配置4wt%的硅藻土的水溶液500ml，抽濾，使濾紙表面形成一層均勻的硅藻土層，以此為過濾介質，然后對膠原蛋白肽液抽濾。抽濾后的蛋白肽液以6ml/min的流速進入D296R型樹脂柱，得到澄清透明的膠原蛋白肽液。(6)濃縮干燥將澄清透明的膠原蛋白肽液進行真空濃縮至固形物質量分數為30%，噴霧干燥得膠原蛋白肽粉末。圖3為實施例3膠原蛋白肽分子量的質譜圖，從圖3看出，所制備的膠原蛋白粉的分子量集中分布在50(Tl600Da，提取率85. 8%，純度92. 5%。(7)壓片將9g膠原蛋白肽粉、7g蘆薈粉與16g檸檬酸粉分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻，加入5g5%PVP70%乙醇后造粒，40°C干燥，得到顆粒①；將9g膠原蛋白粉、7g蘆薈粉與23g碳酸氫鈉粉混勻，加入5g5%PVP70%乙醇后造粒，40°C干燥，得到顆粒②；然后將15g甘露醇，22g山梨醇，2g聚乙二醇6000混合均勻，過80目篩后，加入上述①②顆粒，混勻，迅速轉移至溫度(20±2)°C、濕度(40±5)%無菌操作間中進行壓片制得泡騰片式膠原蛋白肽泡騰片。將本發明的泡騰片置于水中，溶解迅速，水溶液無異味，澄清透明。將其水溶液涂于皮膚表面，保濕性良好，膠原蛋白肽透過率高。對20人(10男、10女，年齡為22— 25周歲)次進行每天早中晚三次涂于皮膚表面，長期使用3個月，發現其能有效補充人體皮膚所需的膠原蛋白含量，有助于美容。以上對本發明做了示例性的描述，應該說明的是，在不脫離本發明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領域技術人員能夠不花費創造性勞動的等同替換均落入本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種低分子量膠原蛋白肽的提取方法，其特征在于，按照下述步驟進行 步驟1，除去豬皮中非膠原性蛋白質，其中用O. Imol/Γο. 15mol/lNaOH水溶液浸泡原料豬皮，料液比為1:25^1:30，以除去豬皮里非膠原性蛋白質 步驟2，脫除豬皮中的脂肪，其中按料液比為1:25 1:30的比例取水，然后加入占原料豬皮質量29Γ4%的脂肪酶，調整溫度和體系的pH值以使加入的脂肪酶活性達到最大，脫除脂肪 步驟3，溶膠，其中將脫去脂肪的豬皮置于水中，料液比1:15 1:20，8(TC的條件下恒溫加熱，低速100-200轉/min攪拌4tT6h，得到豬皮和水溶性膠原的混合物 步驟4，制備胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液，將上一步的豬皮和水溶性膠原的混合物降溫，同時調節混合物溶液的pH值以使加入的胰蛋白酶活性達到最大，加入胰蛋白酶，E/[S]=100(T2500U/g，然后將酶解后的蛋白肽液滅酶活，離心除去不溶物，得到胰蛋白酶酶解蛋白妝液 步驟5，蛋白肽液脫色，配置2wt9T4wt%的硅藻土的水溶液，抽濾，使濾紙表面形成一層均勻的硅藻土層，以此為過濾介質，對蛋白肽液抽濾，抽濾后的蛋白肽液進入樹脂柱進行分離，得到澄清透明的膠原蛋白肽液 步驟6，濃縮干燥，將澄清透明的膠原蛋白肽液進行真空濃縮和噴霧干燥得膠原蛋白肽粉末。
2.根據權利要求I所述的一種低分子量膠原蛋白肽的提取方法，其特征在于，在所述步驟2中，使用Na2CO3粉末調節pH值為9 9. 3，35°C恒溫低速100-200轉/min攪拌8tTl0h，脫除豬皮中的脂肪。
3.根據權利要求I所述的一種低分子量膠原蛋白肽的提取方法，其特征在于，在所述步驟4中，將上一步的豬皮和水溶性膠原的混合物降溫至50°C，保持50°C恒溫，調節混合物溶液的pH=7，加入胰蛋白酶，低速100-200轉/min攪拌18h_24h，將酶解后的蛋白肽液置于95°C的環境下5-10min，以滅酶活。
4.根據權利要求I所述的一種低分子量膠原蛋白肽的提取方法，其特征在于，在所述步驟5中，所述樹脂柱為D296R型樹脂柱,控制抽濾后的蛋白妝液流速為以2ml/min 6ml/min的流速進入D296R型樹脂柱，得到澄清透明的膠原蛋白肽液。
5.根據權利要求I所述的一種低分子量膠原蛋白肽的提取方法，其特征在于，在所述步驟6中，在真空濃縮階段，待體系中出現固形物且固形物質量分數達到整個澄清透明的膠原蛋白肽液體系的30°/Γ35%時停止濃縮，并進行噴霧干燥。
6.一種利用本發明制備的低分子量膠原蛋白肽粉末的泡騰片式低分子膠原蛋白肽，其特征在于，按質量份計，由以下組分組成碳酸氫鈉20 23份檸檬酸16 19份低分子量膠原蛋白肽14 18份蘆薈8 14份聚乙二醇60002~4份甘露醇8 15份山梨醇22 26份組分A5-10份 其中所述組分A為5%PVP70%乙醇，稱5gPVP，加入70wt%乙醇的水溶液至100g，攪拌溶解混勻即可。
7.根據權利要求6所述的泡騰片式低分子膠原蛋白肽，其特征在于，各組分優選如下 碳酸氫鈉22.2份 檸檬酸17.8份 低分子量膠原蛋白肽15份蘆薈10份 聚乙二醇60003份甘露醇12份山梨醇24份組分A10份
8.一種制備如權利要求6所述的泡騰片式低分子膠原蛋白肽的方法，其特征在于，按照下述步驟進行 將低分子量膠原蛋白肽、蘆薈、檸檬酸分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻后加入組份A后造粒，4045°C真空干燥，得到第一顆粒①；將低分子量膠原蛋白肽、蘆薈、碳酸氫鈉分別研磨成細粉，過20目篩網，混合均勻后加入組份A后造粒，40-45°C真空干燥，得到第二顆粒②；然后將甘露醇，山梨醇，聚乙二醇6000混勻，過80目篩，加入上述第一和第二顆粒①②，混合均勻，迅速轉移至溫度(20±2)°C、濕度(40±5)%無菌操作間中進行壓片制得女口廣叩ο
9.根據權利要求8所述的一種泡騰片式低分子膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述甘露醇，山梨醇，聚乙二醇6000三者均為粉末狀固體。
10.根據權利要求8所述的一種泡騰片式低分子膠原蛋白肽的方法，其特征在于，在制備第一顆粒和第二顆粒時，優選在44°C真空干燥；在制備第一顆粒和第二顆粒時，可選擇將低分子量膠原蛋白肽、蘆薈和組分A等用量地分配在第一顆粒和第二顆粒中。
全文摘要
本發明公開了一種泡騰片式低分子膠原蛋白肽及其制備方法，主要步驟為去除非膠原性蛋白、生物酶脫脂、溶膠、胰蛋白酶酶解、硅藻土和大孔樹脂聯合脫色、濃縮干燥、與多種有益原料混合壓制成泡騰片。它在傳統工藝的基礎上，優化溶膠和酶解的工藝條件，得到分子量集中分布在500~1600Da的膠原蛋白肽，簡化后續工藝操作，降低生產成本，首次提出用硅藻土和大孔樹脂聯合對膠原蛋白肽液進行脫色，脫色效果好，膠原蛋白肽損失少。在劑型方面引入泡騰片，在美容保濕的基礎上，皮膚透過性好，而且不添加任何防腐劑，使得本化妝品對人體皮膚更加安全有益。
文檔編號A61K8/65GK102888436SQ20121036176
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者朱宏吉, 張華 , 王世鵬, 滕欣余, 路明月, 姜珊, 方潔, 張鑫 申請人:天津大學