專利名稱：一種新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物學、免疫學和水產(chǎn)動物病害防治領域，特別是涉及到一種用于防治魚類因弧菌、愛德華氏菌、鏈球菌和嗜水氣單胞菌引發(fā)病害的新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗及其應用。
背景技術：
水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為世界上發(fā)展最快的動物源性食品生產(chǎn)業(yè)之一。據(jù)世界糧農(nóng)組織(FAO) 2010年統(tǒng)計資料顯示自2000年以來，漁品的增長主要來自于水產(chǎn)養(yǎng)殖。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化和工業(yè)化的發(fā)展，展示在我們面前的將是一個以魚類養(yǎng)殖為發(fā)展
重點的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，接踵而至的是各種病害的爆發(fā)。世界各國的生產(chǎn)實踐表明，病害爆發(fā)和蔓延已經(jīng)成為世界范圍內水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)獲取更大發(fā)展的一個重要制約因素，各種重大傳染性疫病的風險始終是水產(chǎn)養(yǎng)殖漁業(yè)中最為重大的風險之一。我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經(jīng)濟損失高達數(shù)百億元。病害問題業(yè)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展的關鍵性制約因素之一。針對各種病害的發(fā)生，一個全球性關注的挑戰(zhàn)已經(jīng)凸現(xiàn)隨著抗生素抗藥病原的大量出現(xiàn)和蔓延而導致大量藥物防治效力的逐漸喪失、化學藥物等導致的環(huán)境污染以及水產(chǎn)品的藥物殘留等負面影響日趨嚴重，我們已步入一個后抗生素時代，水產(chǎn)品安全已成為備受關注的全球性問題。 預防性治療可以防止或大幅減少易感病害的發(fā)生發(fā)展，利用生物技術開發(fā)的各種疫苗使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有更多機會面對挑戰(zhàn)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展起到關鍵性支撐作用。為遏制各種環(huán)境因素和養(yǎng)殖密度激增等造成的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害日益嚴重的趨勢，推進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，接種疫苗已成為世界范圍內現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達國家和地區(qū)的生產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類品種繁多，主要為以羅非魚、草魚、鯰魚為代表的大宗淡水魚類和以鲆鰈魚類、鱸魚、大黃魚和石斑魚為代表的海水魚類。在過去的十多年中，世界范圍內主要爆發(fā)的是弧菌病(Vibriosis,鰻弧菌Vibrio anguillarum、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈氏弧菌Vibrio harveyi等為重要病原)、愛德華氏菌病(Edwardsiel Iosis,其中遲純愛德華氏菌Edwardsiella tarda和魚愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri為重要病原)、鏈球菌病(Streptococcicosis,海豚鏈球菌Streptococcus iniae和無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae為重要病原)和氣單胞菌病(Haemorrhagic septicaemia and ulcer,嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila 為重要病原)等重大細菌性病害，嚴重制約了我國的魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康可持續(xù)發(fā)展，使我國魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)蒙受巨大損失。針對上述重要魚類病害，目前主要采取以各種抗生素為代表的化學療法。我國除草魚出血病病毒疫苗外，尚未有任何商品化細菌性魚類疫苗問世。在生產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，由于各種病害病原可在養(yǎng)殖水體中同時傳播，養(yǎng)殖魚類面對的將是一個多病原共同侵襲的挑戰(zhàn)，因此只針對單一病原病害的單效價疫苗在生產(chǎn)中很難達到較好的實際防治應用效果。開發(fā)可同時預防多種重要病原的多價疫苗始終是水產(chǎn)疫苗的重要方向，有著巨大而現(xiàn)實的市場迫切需求。目前國內外針對弧菌(Vibrio spp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、愛德華氏菌(Edwardsiella spp.)和氣單胞菌(Aeromonasspp.)的單效價疫苗或多聯(lián)疫苗已有不少文獻報道，但可同時針對上述四種重要細菌性病原而設計研發(fā)的多價疫苗還未有文獻報道。在水產(chǎn)疫苗的開發(fā)中，疫苗接種給藥方式往往是制約其商業(yè)化應用的關鍵制約因素。魚類疫苗在生產(chǎn)應用中主要有三種接種給藥方式注射、浸泡和口服。注射接種是目前已開發(fā)的水產(chǎn)疫苗中所有接種方式中免疫效果最好，保護期也最長，但由于其接種操作需要大量人力和特殊設備設施，耗時較長，因此給藥成本最高，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)往往難以承受其給藥成本。同時,注射接種往往給魚造成較高的應激刺激,所以副作用和操作損失往往也較高。并且，這種接種方式很難應用到魚苗期和幼魚期(一般大于20g以上)，在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖 中其應用范圍受到很大限制。浸泡接種是將魚放入一定濃度的疫苗稀釋液中一段時間進行疫苗接種的方式，浸泡免疫的一個最大優(yōu)點是可為魚苗(體重I飛克)接種疫苗。其在生產(chǎn)應用也較易為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)接受。口服主要是通過將疫苗和飼料結合通過飼喂方式進行疫苗接種，這種接種方式在生產(chǎn)應用中最方便也最溫和，不會給魚類造成應激反應。如果免疫效力得到保證，這是水產(chǎn)疫苗最為理想的疫苗產(chǎn)品應用形式。但從國內外的研制開發(fā)和實際應用中發(fā)現(xiàn)，該類型的疫苗由于無法避免魚類動物腸道的消化破壞的影響，往往保護期很短、免疫效力低下，難以獲得理想的免疫效果。鑒于關鍵應用技術尚未有突破，目前國內外市場上尚未有具有良好免疫效果的口服水產(chǎn)疫苗產(chǎn)品問世。綜上所述，針對養(yǎng)殖魚類主要重大病害，開發(fā)具有多種病害防治效力的經(jīng)濟、高效、使用便利的多效價口服疫苗是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求。針對多價口服疫苗的產(chǎn)品特性要求，其需解決的關鍵技術在于如下兩點1)篩選一種或多種針對魚類主要病害病原的保護性廣譜抗原；2)篩選并選取一種能夠穩(wěn)定定植存活于魚類動物腸道的載體菌株，其可耐受腸道的低PH環(huán)境和各種消化蛋白酶的破壞，能夠將保護性廣譜抗原有效呈遞到魚類動物的相關免疫系統(tǒng)中以激發(fā)保護性免疫應答反應。同時，該載體菌株可耐受飼料制備工藝中各種加工環(huán)節(jié)的考驗，可方便地制備成飼料劑型產(chǎn)品，以實現(xiàn)口服接種的產(chǎn)品特性。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為一個看家基因廣泛存在于幾乎所有的生物體中。GAPDH是一個傳統(tǒng)糖酵解蛋白，然而近年來的研究表明GAPDH在不同的亞細胞部位顯示出和糖酵解無關的多種活性功能(3化(^6，14.，1997，了 Cell Biochem,66 (2):133-40;Sirove,M. A. , 1999,Biochim Biophys Acta，1432(2):159_184)。在許多微生物(酵母，細菌和致病性寄生蟲)的細胞膜上發(fā)現(xiàn)有GAPDH存在，其中GAPDH做為外膜蛋白的潛在免疫保護性受到廣泛的關注。GAPDH的免疫原性首次發(fā)現(xiàn)于白色念珠菌(Gil-Navarro et al.，1997，J Bacteriol，179 :4992-4999)。目前在布魯氏菌和遲鈍愛德華氏菌中已經(jīng)證實，GAPDH能夠激發(fā)宿主的保護性免疫反應(Kawai K. et al,2004, Vaceine, 22 :3411-3418 ；RosinnhaG. M. et al. ,2002, J Med Mierobiol,51 (8) :661_671)。同時許多致病菌的 GAPDH 的相似性非常高，X. Li等已證實GAPDH是重要的廣譜性保護抗原，在不同的病原菌間具有顯著的交叉免疫力(X. Li et al. , 2012, Letters in Applied Microbiology, 54 (I): 1-9)。因此，GAPDH具有開發(fā)成為一種針對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物重要病原的候選廣譜抗原的潛力。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種好氧性的革蘭氏陽性細菌,對人畜無害，常被作為動物的益生菌廣泛應用于陸地和水生動物的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，是國際上公認的具有良好生物安全性的宿主菌株。同時，其具有顯著的胞外分泌功能，經(jīng)基因工程改造后可向胞外大量分泌表達特定生物活性物質，被廣泛應用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵。枯草芽孢桿菌還具有在營養(yǎng)缺乏或其他脅迫條件下形成抗逆性休眠體芽孢的特點，芽胞具有極佳的的抗逆性，不僅能耐受100°C的高溫，還可耐受較低的酸性環(huán)境。因此，以枯草芽孢桿菌作為口服疫苗載體，以芽孢形式添加到飼料中，既可耐受飼料高溫加工過程的破壞和魚類胃液中的酸性環(huán)境，又可順利穿過胃腸屏障，通過向胞外大量分泌表達外源抗原激發(fā)較強的免疫反應，達到較好的免疫效果。由于枯草芽孢桿菌這種顯著的的胞外分泌功能和芽孢獨特的抗逆性和免疫學特性以及生物安全性，使其成為極具商業(yè)開發(fā)價值的口服疫苗載體。枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術，通過芽孢表面展示蛋白與目標蛋白相融合，將目標蛋白展示在芽孢表面，可用于研制新型口服重組蛋白疫苗，近年來已成為國內外科學家關注的焦點。Medaglini D等利用衣孢蛋白作為芽孢表面展示外源抗原的融合載體蛋白， 成功地在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示了破傷風毒素(TTFC)C末端的459氨基酸片段。試驗結果證明TTFC抗原展示于芽孢表面，每個芽孢表面約有I. 15X IO3個TTFC蛋白分子，可被特異性抗體識別，并且TTFC的出現(xiàn)并未影響芽孢孢衣的結構和功能(Medaglini D，2001，Vaccine, 19 :1931_9)。D. ning等將VP28展示在枯草芽孢桿菌表面，制備的對蝦口服疫苗對對蟲下白斑綜合癥病毒有一定的預防作用(D. ning et al. , 2011, J Appl Microbiol, 111
(6):1327-36),這些研究表明了枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術可有效用于口服疫苗的研究和開發(fā)。穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)是具有細胞膜穿透能力的一小段堿性氨基酸多肽，如HIV-I TAT、HSP-VP22和Antennapedia (ANTP)等，能有效運輸各物質進入細胞及細胞核的系統(tǒng)，也稱作蛋白質轉導結構域(Lindgren M et al., 2000, TrendsPharmacol Sci, 21 (3):99_103)。通過穿膜肽攜帶的物質有蛋白質、DNA、化學藥物、寡核苷酸等。現(xiàn)在研究最多的、應用范圍最廣的穿膜肽來源于人免疫缺陷病毒I型的轉錄激活因子(trans-activating transcriptional activator, TAT) Tat 蛋白，此多妝蛋白中部序列具有富含陽離子區(qū)域，能夠攜帶外源分子轉導進入細胞，同時穿膜肽的轉導不依賴于能量、胞吞作用、受體及離子通道等作用，可直接穿越脂質雙分子層完成跨膜轉運，并且能攜帶其它DNA、多肽及蛋白質等大分子物質進入細胞內。由于穿膜肽的這一特殊功能，被廣泛應用于藥物的研究(L. Crombez et al, 2009, Mol. Ther. ,17, pp. 95-103 ；S. C. Pero et al,2007, Br. J. Cancer, 96，pp. 1520-1525)和疫苗的開發(fā)(Zhang Y et al，2012，Journalof virological methods,181 (1):59_67)。以枯草芽孢桿菌作為口服疫苗載體，經(jīng)基因工程改造后向胞外大量分泌表達穿膜肽和抗原蛋白融合形成的融合蛋白，利用穿膜肽具有將抗原蛋白跨膜攜帶進入細胞內的特點，使抗原蛋白直接進入動物體內激發(fā)免疫反應，達到體內注射相似的效果，同時利用芽孢表面展示技術在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示另一種病原菌抗原蛋白，達到交叉免疫保護的功效。該策略開發(fā)的口服疫苗巧妙的將枯草芽孢桿菌顯著的胞外分泌特點、穿膜肽良好的穿膜特性、芽孢對高溫和酸性條件下優(yōu)異的耐受性以及芽孢表面展示技術作為疫苗開發(fā)的優(yōu)越性高度集成在一起，開發(fā)出一種具有安全性好、保護效率高、同時對抗多種病原的多價高效口服疫苗。以此策略進行魚類疫苗的研究及產(chǎn)品開發(fā)在國內外尚無報道，本發(fā)明為首次提出。本發(fā)明利用一種枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心組成制備成一種新型的口服劑型多價載體疫苗，該枯草芽孢桿菌芽孢表面展示有以魚類重要病原無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為模板的廣譜抗原蛋白，同時在其染色體上整合有穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)融合基因，使該菌株能持續(xù)向胞外分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗原蛋白的融合蛋白。該多價載體疫苗可通過口服給藥方式接種，能有效預防養(yǎng)殖魚類鏈球菌病、弧菌病、愛德華氏菌病和嗜水氣單胞菌病等重要細菌性病害。

發(fā)明內容
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種枯草芽孢桿菌多價載體疫苗及其應用，該疫苗是以枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心制備而成的一種新型的口服劑型多價載體疫苗，通過誘導枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢，當芽孢萌發(fā)形成營養(yǎng)細胞時可以分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。按照本發(fā)明提供的技術方案一種新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302 (Bacillus subtilis HT5302)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為 CCTCCNo M 2012380。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成芽孢后能夠在芽孢表面展示無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上重組整合有以枯草芽孢桿菌衣殼蛋白基因cotB為分子載體并與無乳鏈球菌基因相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: I)，所述融合基因片段重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的amyE基因位點，通過誘導該枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無乳鏈球菌3_磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營養(yǎng)細胞時能夠分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組整合有由枯草芽孢桿菌分泌信號肽基因、穿膜肽tat基因和鰻弧菌甘油醛脫氫酶#3/70 基因相融合所獲得的sacB-tat~gapdh融合基因序列(SEQ ID NO: 2),該sacB-tat~gapdh融合基因序列克隆至枯草芽孢桿菌P43啟動子下游并利用同源交換整合至枯草芽孢桿菌染色體的IacA基因位點，該枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營養(yǎng)細胞時能夠胞外分泌表達穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)融合蛋白。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組有抗生素壯觀霉素篩選標記基因，所述壯觀霉素抗性基因重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的必基因位點。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組有抗生素紅霉素篩選標記基因，所述紅霉素篩選標記基因重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的IacA基因位點。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌重組菌株構建方法為
采用枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術，利用枯草芽孢桿菌孢衣蛋白基因mii 為分子載體，與無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶基因濟識過融合，利用同源交換原理整合至枯草芽孢桿菌染色體政基因位點；然后以該枯草芽孢桿菌為出發(fā)載體菌株，進一步從鰻弧菌中克隆基因并與枯草芽孢桿菌分泌信號肽基因和穿膜肽基因tat融合，獲得sacB-tat-gapdh融合基因，將融合基因克隆至枯草芽孢桿菌p43啟動子下游并利用同源交換整合至上述枯草芽孢桿菌染色體基因位點。通過上述方法獲得的重組菌株即為枯草芽孢桿菌多價載體疫苗。本發(fā)明還提供了所述枯草芽孢桿菌多價載體疫苗在魚類養(yǎng)殖中防治因鏈球菌、弧·菌、愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌等引發(fā)的重要細菌性病害的應用。作為所述應用的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌多價載體疫苗是以枯草芽孢桿菌芽孢形式添加到魚飼料及飼料添加劑中，以口服方式免疫。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，優(yōu)點在于本發(fā)明的枯草芽孢桿菌疫苗株，形成芽孢后能夠在芽孢表面展示無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH蛋白，在形成營養(yǎng)細胞時能夠分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶構成的融合蛋白。本發(fā)明利用芽孢所具有的獨特抗逆性，將該枯草芽孢桿菌多價載體疫苗以芽孢形式添加到魚飼料中口服免疫，芽孢能攜帶無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH蛋白順利通過魚的消化道屏障，激發(fā)魚的免疫反應，同時芽孢在魚腸道定植萌發(fā)形成營養(yǎng)細胞，營養(yǎng)細胞能夠大量分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶構成的融合蛋白，穿膜肽攜帶GAPDH透過胃腸道細胞的磷脂雙分子層進入細胞，激活魚的免疫反應。本發(fā)明構建的枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，相對于其它疫苗具有交叉保護、穿透魚消化道屏障并能夠及時將抗原傳遞到宿主細胞內部的效果，并且該疫苗能夠添加到飼料中，耐受飼料的高溫定型，具有廣闊的商業(yè)開發(fā)景。生物材料保藏
一種新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302(Bacillus subtilis HT5302)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學，保藏日期為2012年9月25日，保藏號為CCTCCNo M 2012380。


圖I是以大菱鲆為實驗用魚的各實驗組的累計死亡率統(tǒng)計曲線圖。圖2是以羅非魚為實驗用魚的各實驗組的累計死亡率統(tǒng)計曲線圖。圖3是以石斑魚為實驗用魚的各實驗組的累計死亡率統(tǒng)計曲線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步描述。實施例I :枯草芽孢桿菌多價載體疫苗的制備
I、培養(yǎng)基配制(I)DSM 液體培養(yǎng)基細菌營養(yǎng)肉湯(Difco) 8g，10% (w/v) KCl 10ml, I. 2% (w/v)MgSO4 ·7Η20 10ml, IM NaOH I. 5ml，調 pH 至 7. 6，ddH20 定容至 1000ml。高壓滅菌后，冷卻至50°C，在使用前分別加入已滅菌的IM Ca (NO3)2、O. OIMMnCl2、ImMFeSO4各lml。(2) PBS 緩沖液=Na2HPO4 · 2H20 2. 74g/L，NaH2PO4 · H2O O. 63g/L，將所述成份溶解于IOOOml蒸餾水，于121°C滅菌20分鐘。(3)LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 10g/L，調 pH 至 7. O。2、平板培養(yǎng)基復蘇取_80°C保存的保藏號為CCTCCNo M 2012380的枯草芽孢桿菌重組菌株種子劃線接種于LB固體平板上，在37°C培養(yǎng)過夜，使枯草芽孢桿菌重組菌株復壯，形成單菌落。3、種子的制備挑取單菌落接種于100ml DSM液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18h，0D600 至2. O,作為種子液。4、發(fā)酵液的制備制備的種子液按照1%的接種量接種到5L生物反應器中，采用DSM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，通氣量2L/分鐘，pH7. 5，培養(yǎng)25_30h，至芽孢形成率90%以上，終止發(fā)酵，得發(fā)酵液。5、枯草芽孢桿菌芽孢菌粉的制備將上述發(fā)酵液于室溫以5000g離心10分鐘，收集菌泥，向菌泥中加入15%重量百分比的淀粉，噴霧干燥，得到水分重量百分含量〈5%的枯草芽孢桿菌芽孢菌粉，該枯草芽孢桿菌芽孢菌粉即為所述的枯草芽孢桿菌多價載體疫苗。6、疫苗飼料的制備將上述的枯草芽孢桿菌芽孢菌粉與魚飼料原料混合制粒，包被大約I X IO10個芽孢/ g飼料，飼料經(jīng)微粉碎后過40目篩，混合均勻后用小型顆粒飼料機加工成直徑I. 5mm的顆粒飼料備用，飼料加工過程中溫度65-70°C持續(xù)時間約lOmin。
實施例2 :以大菱鲆為實驗用魚的口服免疫效力評價試驗。病原菌懸浮液的制備在TSB (2% NaCl)液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌至0D600為O. 6，在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至0D600為O. 6，然后于室溫以5000rpm離心10分鐘，收集沉淀菌體，用PBS緩沖液懸浮至終濃度為I X 107cfu/ml。實驗用魚的飼養(yǎng)從山東購置的試驗用魚(大菱鲆)暫養(yǎng)于200L水族箱，配以流動循環(huán)水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持18±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個體。選擇體長為12-15cm的健康大菱鲆隨機分組至20L試驗水族箱，每個水族箱30尾，實驗水族箱每天換水兩次，換水量為1/3，維持水溫18±2°C，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。免疫效力評價上述已分組水族箱分別設置口服對照組A、免疫對照組A、免疫組A、口服對照組B、免疫對照組B、免疫組B、口服對照組C、免疫對照組C、免疫組C和空白對照組，口服對照組A、口服對照組B和口服對照組C飼喂基礎飼料，免疫對照組A、免疫對照組B和免疫對照組C飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎飼料，免疫組A、免疫組B和免疫組C飼喂實施例I制備的疫苗飼料，空白對照組飼喂基礎飼料，每組設置2個平行。將上述各組大菱鲆連續(xù)飼喂免疫3天，每條魚每天免疫Ig飼料，免疫3天后各組停止免疫，均改喂普通基礎飼料，停止免疫28天后，對除空白對照組外的各組大菱鲆分別攻毒，其中口服對照組A、免疫對照組A和免疫組A分別腹腔注射遲鈍愛德華氏菌病原菌懸浮液，口服對照組B、免疫對照組B和免疫組B分別腹腔注射鰻弧菌病原菌懸浮液，口服對照組C、免疫對照組C和免疫組C分別腹腔注射嗜水氣單胞菌病原菌懸浮液，每條魚的注射劑量為100 μ I。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況，14天后，各組的累計死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計各組魚的累計死亡率，統(tǒng)計結果如圖I所示。利用下列公式計算相對免疫保護率
相對免疫保護率(RPS)% =(穩(wěn)定后的口服對照組的累計死亡率-穩(wěn)定后的免疫組的累計死亡率)/穩(wěn)定后的口服對照組的累計死亡率X 100%。經(jīng)計算，實施例I制備的枯草芽孢桿菌多價載體疫苗對鰻弧菌的免疫保護率達到93. 4%，對遲鈍愛德華式菌的免疫保護率達到79. 3%，對嗜水氣單胞菌的免疫保護率達到70%，由此可見，該疫苗對鰻弧菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保護大菱鲆抵御鰻弧菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的侵染，呈現(xiàn)出顯著的交叉免疫力。實施例3 以羅非魚為實驗用魚的口服免疫效力評價試驗
病原菌懸浮液的制備在腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基(胰蛋白質胨10. Og/L，氯化鈉5. Og/L，磷酸氫二鈉2. 5g/L，葡萄糖2. Og/L，牛心浸出液500mL/L，pH7. 4)中分別培養(yǎng)無乳鏈球菌和海豚鏈球菌至0D600為O. 6，在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至0D600為O. 6，然后于室溫以5000rpm離心10分鐘，收集沉淀菌體，用PBS緩沖液懸浮至終濃度為I X IO7Cfu/ml ο實驗用魚的飼養(yǎng)從山東購置的試驗用魚(羅非魚)暫養(yǎng)于200L水族箱，配以流動循環(huán)淡水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持24±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個體。選擇體長為12-15cm的健康羅非魚隨機分組至20L試驗水族箱，每個水族箱30尾，實驗水族箱每天換水兩次，換水量為1/3，維持水溫24±2°C，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。免疫效力評價上述已分組水族箱分別設置口服對照組A、免疫對照組A、免疫組A、口服對照組B、免疫對照組B、免疫組B、口服對照組C、免疫對照組C、免疫組C和空白對照組，口服對照組A、口服對照組B和口服對照組C飼喂基礎飼料，免疫對照組A、免疫對照組B和免疫對照組C飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎飼料，免疫組A、免疫組B和免疫組C飼喂實施例I制備的疫苗飼料，空白對照組飼喂基礎飼料，每組設置2個平行。將上述各組羅非魚連續(xù)飼喂免疫3天，每條魚每天免疫Ig飼料，免疫3天后各組停止免疫，均改喂普通基礎飼料，停止免疫28天后，對除空白對照組外的各組羅非魚分別攻毒，其中口服對照組A、免疫對照組A和免疫組A分別腹腔注射無乳鏈球菌病原菌懸浮液，口服對照組B、免疫對照組B和免疫組B分別腹腔注射海豚鏈球菌病原菌懸浮液，口服對照組C、免疫對照組C和免疫組C分別腹腔注射嗜水氣單胞菌病原菌懸浮液，每條魚的注射劑量為100 μ I。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況，14天后，各組的累計死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計各組魚的累計死亡率，統(tǒng)計結果如圖2所示。利用下列公式計算相對免疫保護率
相對免疫保護率(RPS)% =(穩(wěn)定后的口服對照組的累計死亡率-穩(wěn)定后的免疫組的累計死亡率)/穩(wěn)定后的口服對照組的累計死亡率X 100%。經(jīng)計算，實施例I制備的枯草芽孢桿菌多價載體疫苗對無乳鏈球菌的免疫保護率達到93. 4%，對海豚鏈球菌的免疫保護率達到90%，對嗜水氣單胞菌的免疫保護率達到76%，由此可見，該疫苗對無乳鏈球菌、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保護羅非魚抵御無乳鏈球菌、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌的侵染，呈現(xiàn)出顯著的交叉免疫力。
實施例4 :以石斑魚為實驗用魚的口服免疫效力評價試驗
病原菌懸浮液的制備在腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基(胰蛋白質胨10. Og/L，氯化鈉5. Og/L，磷酸氫二鈉2. 5g/L，葡萄糖2. Og/L，牛心浸出液500mL/L，pH7. 4)中培養(yǎng)海豚鏈球菌至0D600為O. 6，在TSB (2%NaCl)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)溶藻弧菌至0D600為O. 6，在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至0D600為O. 6，然后于室溫以5000rpm離心10分鐘，收集沉淀菌體，用PBS緩沖液懸浮至終濃度為I X 107cfu/ml。實驗用魚的飼養(yǎng)從山東購置的試驗用魚(石斑魚)暫養(yǎng)于200L水族箱，配以流動循環(huán)海水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持23±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個體。選擇體長為12-15cm的健康石斑魚隨機分組至20L試驗水族箱，每個水族箱30尾，實驗水族箱每天換水兩次，換水量為1/3，維持水溫23±2°C，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。免疫效力評價上述已分組水族箱分別設置口服對照組A、免疫對照組A、免疫組A、口服對照組B、免疫對照組B、免疫組B、口服對照組C、免疫對照組C、免疫組C和空白對照組，口服對照組A、口服對照組B和口服對照組C飼喂基礎飼料，免疫對照組A、免疫對照組B和免疫對照組C飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎飼料，免疫組A、免疫組B和免疫組C飼喂實施例I制備的疫苗飼料，空白對照組飼喂基礎飼料，每組設置2個平行。將上述各組石斑魚連續(xù)飼喂免疫3天，每條魚每天免疫Ig飼料，免疫3天后各組停止免疫，均改喂普通基礎飼料，停止免疫28天后，對除空白對照組外的各組石斑魚分別攻毒，其中口服對照組A、免疫對照組A和免疫組A分別腹腔注射海豚鏈球菌病原菌懸浮液，口服對照組B、免疫對照組B和免疫組B分別腹腔注射溶藻弧菌病原菌懸浮液，口服對照組C、免疫對照組C和免疫組C分別腹腔注射嗜水氣單胞菌病原菌懸浮液，每條魚的注射劑量為100μ I。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況，14天后，各組的累計死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計各組魚的累計死亡率，統(tǒng)計結果如圖3所示。利用下列公式計算相對免疫保護率
相對免疫保護率(RPS)% =(穩(wěn)定后的口服對照組的累計死亡率-穩(wěn)定后的免疫組的累計死亡率)/穩(wěn)定后的口服對照組的累計死亡率X 100%。經(jīng)計算，實施例I制備的枯草芽孢桿菌多價載體疫苗對海豚鏈球菌的免疫保護率達到90%，對溶藻弧菌的免疫保護率達到86. 2%，對嗜水氣單胞菌的免疫保護率達到73. 4%，由此可見，該疫苗對海豚鏈球菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保護石斑魚抵御海豚鏈球菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌的侵染，呈現(xiàn)出顯著的交叉免疫力。需要指出的是，上述實施例僅僅作為本發(fā)明的說明，而不是限制。本發(fā)明所指的魚類并不局限于上述實施例所描述的大菱鲆、羅非魚和石斑魚，對于經(jīng)充分說明的本發(fā)明來說，根據(jù)本發(fā)明的所闡述的內容進行簡單實驗所作出的變換及改型的方案，仍然屬于本發(fā)明的保護范圍。總之，本發(fā)明的保護范圍應包括那些對于本領域普通技術人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
權利要求
1.一種新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302 (Bacillussubtilis HT5302)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNo M 2012380。
2.如權利要求I所述的新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成芽孢后能夠在芽孢表面展示無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白。
3.如權利要求2所述的新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上重組整合有以枯草芽孢桿菌衣殼蛋白基因cotB為分子載體并與無乳鏈球菌識/7過基因相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: 1)，所述融合基因片段重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的_yE基因位點，通過誘導該枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢。
4.如權利要求2所述的新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營養(yǎng)細胞時能夠分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。
5.如權利要求4所述的新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組整合有由枯草芽孢桿菌分泌信號肽基因、穿膜肽iai基因和鰻弧菌甘油醒脫氫酶基因相融合所獲得的融合基因序列(SEQ ID NO: 2)，該識/7過融合基因序列克隆至枯草芽孢桿菌p43啟動子下游并利用同源交換整合至枯草芽孢桿菌染色體的基因位點，該枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營養(yǎng)細胞時能夠胞外分泌表達穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)融合蛋白。
6.權利要求f5任一項所述的新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗在魚類養(yǎng)殖中防治因鏈球菌、弧菌、愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌等引發(fā)的重要細菌性病害的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述枯草芽孢桿菌多價載體疫苗是以枯草芽孢桿菌芽孢形式添加到魚飼料及飼料添加劑中，以口服方式免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗及其應用。所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNoM2012380。該枯草芽孢桿菌多價載體疫苗是以枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心制備而成，通過誘導枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢，芽孢萌發(fā)形成營養(yǎng)細胞時可以分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。該疫苗具有對鏈球菌病、弧菌病、愛德華氏菌病和嗜水氣單胞菌等細菌性病害的多效價防護作用。
文檔編號A61K39/02GK102949713SQ20121037603
公開日2013年3月6日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:無錫海健生物科技有限公司