一種獼猴桃素及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種獼猴桃素及其制備方法和用途。所述獼猴桃素的制備方法為：將獼猴桃根的水提物用大孔樹脂進行柱層析分離，將所得分離產物進行醇沉淀，收集沉淀即得。所述的大孔樹脂為極性大孔樹脂，其包括強堿性大孔樹脂或弱堿性大孔樹脂，其粒徑為0.3～1.25mm，孔徑為所述獼猴桃素可明顯地抑制腫瘤的生長和惡化發展；同時能夠有效提高T淋巴細胞的應答功能，增強小鼠脾細胞對靶細胞的殺傷力，促進NK活性，提高細胞免疫功能。該獼猴桃素抑制腫瘤生長時所引起的副作用很小，具有良好的安全性。該獼猴桃素作為一種新型低毒的抗腫瘤藥物，有可能發展成為治療癌癥的中藥新藥。
【專利說明】一種獼猴桃素及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明具體涉及一種獼猴桃素及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]獼猴桃藥用歷史悠久，唐《本草拾遺》、宋《本草衍義》、明《本草綱目》均有記載，用于治療肝炎、水腫、風濕性關節炎、跌打損傷、痢疾、絲蟲病、胃癌、乳腺癌等。現代藥學研究表明獼猴桃具有降血脂、抗脂質過氧化、清除活性氧自由基、抑制腫瘤細胞、提高免疫功能等方面的藥理活性。如獼猴桃果汁對環磷酰胺(CP)誘發的大鼠外周血雙核淋巴細胞微核細胞的致突變作用有顯著抑制效果，Collinset al.的單細胞凝膠試驗表明獼猴桃果汁有明顯的抗DNA氧化的作用，獼猴桃根具有抗多種腫瘤作用。
[0003]肺癌作為常見惡性腫瘤，患者逐年增多，大約每年有118萬人死亡。其中80%為非小細胞肺癌?；颊?年生存率僅約15%。肺癌對于傳統的化療和放療不敏感，藥物治療仍是對抗疾病的主要手段，但目前的抗腫瘤藥物副作用較大。

【發明內容】

[0004]因此，本發明所要解決的技術問題是針對目前臨床上治療惡性腫瘤的藥物種類較少，而且化學合成類藥物副作用很大的缺陷，提供一種獼猴桃素及其制備方法和應用。本發明提供的獼猴桃素制備方法簡便，生物活性強，具有良好的抗腫瘤活性，同時其安全性高，副作用小。
[0005]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一為:一種獼猴桃素，其中所述獼猴桃素由包括以下步驟的方·法制備而得:將獼猴桃根的水提物用大孔樹脂層析柱分離，將所得分離產物進行醇沉淀，收集沉淀即得。
[0006]其中所述獼猴桃素優選地為獼猴桃根水提物大孔樹脂30%乙醇流份的乙醇沉淀物，該獼猴桃素命名為獼猴桃素-D，或者TLG30-1I。
[0007]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二為:上述獼猴桃素的制備方法，該制備方法包括以下步驟:將獼猴桃根的水提物用大孔樹脂層析柱分離，將所得分離產物進行醇沉淀，收集沉淀即得。
[0008]其中所述的獼猴桃根的水提物由本領域常規水提方法制備。其中所述的獼猴桃根為本領域常規的獼猴桃根，其中藥名為藤梨根。所述獼猴桃根的來源為本領域常規來源，優選地為產自浙江省磐安縣的藤梨根藥材，其形態為本領域常規形態。所述水提方法較佳地為水煎法，水的添加量較佳地為獼猴桃根重量的8~10倍，優選地為獼猴桃根重量的10倍。所述水煎的溫度較佳地為95~105°C，優選地為105°C，所述水煎的時間較佳地為I~3小時，優選地為3小時。
[0009]其中所述的大孔樹脂較佳地為極性大孔樹脂，所述極性大孔樹脂較佳地包括強堿性大孔樹脂或弱堿性大孔樹脂。所述強堿性大孔樹脂較佳地包括D-201大孔樹脂或D-202大孔樹脂；所述弱堿性大孔樹脂優選地為D-302大孔樹脂。所述極性大孔樹脂的粒徑較佳地為0.3~1.25mm,優選地為1.0mm。所述大孔樹脂孔徑較佳地為100~200人,優選地為130A。
[0010]其中所述的將獼猴桃根的水提物用大孔樹脂層析柱分離為本領域常規的層析分離方法。所述大孔樹脂層析柱分離方法較佳地包括:首先將獼猴桃根水提物的上清液上樣到大孔樹脂層析柱，之后以洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液即得。
[0011]其中所述的上樣方法條件參數為:分離層析柱體積較佳地為3~5L，分離層析柱徑優選地為6~8cm，上樣流速較佳地為f 1.5倍柱體積/小時，優選地為1.5倍柱體積/小時。
[0012]其中所述洗脫劑較佳地包括:10%~95%乙醇溶液或15%~30%丙酮溶液，其優選地為30%乙醇水溶液，所述百分比為體積百分比。所述乙醇水溶液的流速較佳地為2~3倍柱體積/小時,優選地為3倍柱體積/小時。
[0013]其中所述大孔樹脂層析柱分離方法較佳地包括:將所述大孔樹脂分離產物濃縮得到浸膏液，將浸膏液進行醇沉淀后，即得如上所述的獼猴桃素。所述濃縮為本領域常規濃縮技術。所述濃縮技術較佳地為減壓濃縮，濃縮真空度較佳地為-0.8^1.0MPa，濃縮溫度較佳地為40~50°C，優選地為50°C。濃縮后所得浸膏液的密度較佳地為I~1.5g/ml，優選地為 1.25g/ml ο
[0014]其中所述的醇沉淀為本領域常規的沉淀方法。所述的醇較佳地包括甲醇、乙醇、乙二醇中的一種或幾種，其優選地為乙醇。其中所述的乙醇較佳地為90%~95%的乙醇水溶液，優選地為95%的乙醇水溶液，所述百分比為體積百分比。所述95%乙醇水溶液的添加量較佳地為所得浸膏液的3~5倍體積，優選地為浸膏液的5倍體積。
[0015]將所得混合物靜置沉淀析出，固液分離，取固體，即得所述獼猴桃素，其中所述靜置的時間較佳地為15~18小時。更佳地，將所得固體洗滌后真空干燥，即得本發明所述獼猴桃素。
[0016]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三為:上述獼猴桃素在制備抗腫瘤藥物中的用途。
[0017]其中所述腫瘤為本領域常規腫瘤。所述腫瘤較佳地包括:白血病，肝癌，肺癌，皮膚癌，胃癌，肝癌，口腔癌或淋巴瘤。其中所述白血病優選地為人慢性髓原白血病，所述肺癌優選地為人大細胞肺腺癌或肺非小細胞癌，所述胃癌優選地為人低分化胃腺癌，所述口腔癌優選地為人口腔表皮癌。
[0018]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0019]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0020]本發明的積極進步效果在于:
[0021]1、本發明所述獼猴桃素制備方法步驟簡單，提取效率較高，所制備的獼猴桃素抗腫瘤活性較強。
[0022]2、本發明提供的獼猴桃素可明顯地抑制裸鼠A549肺癌、小鼠Lewis肺癌的生長，抑制腫瘤的惡化發展；同時有效提高T淋巴細胞的應答功能，增強小鼠脾細胞對靶細胞的殺傷力，促進其NK活性，并提高其細胞免疫功能。
[0023]3、在實驗中所用的獼猴桃素濃度下，觀察到荷瘤小鼠的體重無明顯變化，小鼠狀態良好，外觀、毛色、活動等均正常，表明本發明提供獼猴桃素在抑制腫瘤生長時所引起的副作用很小，具有良好的安全性。因此，獼猴桃素作為一種新型低毒的抗腫瘤藥物，有可能發展成為治療癌癥的中藥新藥，具有較大的社會和經濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為獼猴桃素制備工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0025]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0026]獼猴桃根(中藥名藤梨根)來源:藤梨根藥材，產地:浙江省磐安縣。
[0027]大孔樹脂(天津市大鈞科技開發有限公司生產，型號為D-201型、D-202型和D-302型)粒徑為0.3~1.25_，孔徑為100~200A。
[0028]小鼠Lewis肺癌細胞，人非小細胞肺癌細胞A549，Yac_l細胞，K562人慢性髓原白血病細胞，H460人大細胞肺癌細胞，A431人表皮癌細胞，BGC-823人低分化胃腺癌細胞，KB人口腔表皮癌細胞和QGY人肝癌細胞，上述細胞均購自中科院上海生命科學院細胞庫。
[0029]環磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產。
[0030]云芝肝泰膠囊(Yunzhi)，上海中西藥業股份有限公司新R制藥廠生產。
[0031]DMEM培養基干粉、新生牛血清及0.5%胰蛋白酶/0.02EDTA均購自GIBCO公司。
[0032]3H-TdR:上海原子核研究所，放射性濃度lmci/ml。
[0033]刀豆球蛋白(ConA):50g/ml,購自Sigma公司。
[0034]C57BL/小鼠(SPF級)，上海斯萊克實驗動物責任有限公司[SCXK(滬)2008-0016]，雄性19~21g，雌性18~20g。
[0035]BALB/C裸鼠(SPF級)，上海斯萊克實驗動物責任有限公司[SCXK(滬)2007-0005]，雄性，18~20g/6周齡。
[0036]多頭細胞收集器，紹興市衛星醫療設備制造有限公司，型號:ΖΤ1-3型。
[0037]液閃儀，上海原子核所日環光電儀器有限公司，型號:SN_6930型。
[0038]實施例1提取獼猴桃素
[0039]1.獼猴桃根水提物制備
[0040]取Ikg水煎獼猴桃根，加入IOL 7jC, 105°C水煎3小時。離心收集上清即得獼猴桃根水提物。
[0041]2.獼猴桃根水提物大孔樹脂層析分離
[0042]取上述獼猴桃根水提物，進行大孔樹脂柱層析`，所用樹脂型號為D-201，柱體積5L，柱徑8cm，流速為1.5倍柱體積/小時上樣，分別以去離子水洗脫,洗脫流速為3倍柱體積/小時，洗脫至無色；30%乙醇洗脫，洗脫流速為3倍柱體積/小時，洗脫至無色。
[0043]收集30%乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空度-0.8MPa，溫度50°C，濃縮得到密度為
1.25g/ml的浸膏液，加入浸膏液5倍體積的95%乙醇溶液，靜置15小時沉淀析出，過濾，取沉淀物即得獼猴桃素。將所得沉淀物進行洗滌，真空干燥后得到TLG30-1I (命名為獼猴桃素-D)。所述獼猴桃素的提取工藝流程如圖1所示。
[0044]實施例2用不同濃度乙醇作為洗脫劑提取獼猴桃素
[0045]1.獼猴桃根水提物制備
[0046]取Ikg獼猴桃根，加入9L/JC, 100°C水煎時間3小時。離心收集上清即得獼猴桃根水提物。
[0047]2.獼猴桃根水提物大孔樹脂層析分離
[0048]取上述獼猴桃根水提物，過大孔樹脂柱層析，所用樹脂型號為D-201，柱體積3L，柱徑6cm，流速為I倍柱體積/小時上樣,首先以去離子水洗脫，洗脫流速為3倍柱體積/小時，洗脫至無色；分別使用10%，30%, 50%, 70%和95%的乙醇水溶液進行洗脫，所述百分比為體積百分比，洗脫流速為3倍柱體積/小時，洗脫至無色，保留各洗脫流份。
[0049]實施例3提取獼猴桃素
[0050]1.獼猴桃根水提物制備
[0051]取Ikg獼猴桃根，加入8L水，95°C水煎時間I小時。離心收集上清即得獼猴桃根水提物。
[0052]2.獼猴桃根水提物大孔樹脂層析分離
[0053]取上述獼猴桃根水提物，過大孔樹脂柱層析，所用樹脂型號為D-302，柱體積3L，柱徑6cm，流速為I倍柱體積/小時上樣，以去離子水洗脫,洗脫流速為3倍柱體積/小時，洗脫至無色；30%丙酮洗脫·，洗脫流速為2倍柱體積/小時，洗脫至無色。
[0054]收集30%丙酮洗脫液，減壓濃縮，真空度1.0MPa，溫度40°C，濃縮得到密度1.5g/ml的浸膏液，加入浸膏液的3倍體積的30%乙醇溶液，靜置18小時沉淀析出，過濾，將所得沉淀物進行洗滌，真空干燥后即得獼猴桃素。
[0055]實施例4提取獼猴桃素
[0056]1.獼猴桃根水提物制備
[0057]取Ikg獼猴桃根，加入8L水，95°C水煎時間I小時。離心收集上清即得獼猴桃根水提物。
[0058]2.獼猴桃根水提物大孔樹脂層析分離
[0059]取上述獼猴桃根水提物，過大孔樹脂柱層析，所用樹脂型號為D-202，柱體積3L，柱徑6cm，流速為I倍柱體積/小時上樣，以去離子水洗脫,洗脫流速為3倍柱體積/小時，洗脫至無色;15%丙酮洗脫，洗脫流速為2倍柱體積/小時，洗脫至無色。
[0060]收集15%丙酮洗脫液，減壓濃縮，真空度1.0MPa，溫度40°C，濃縮得到密度1.5g/ml的浸膏液，加入浸膏液的3倍體積的30%乙醇溶液，靜置18小時沉淀析出，過濾，將所得沉淀物進行洗滌，真空干燥后即得獼猴桃素。
[0061]實施例5腫瘤細胞MTT法篩選獼猴桃根水提物的有效部位
[0062]其中所述獼猴桃根的水提物及其30%乙醇流份的沉淀物為實施例1制備所得，獼猴桃根水提物不同濃度乙醇溶液洗脫物為實施例2制備所得。
[0063]體外分別按照常規方法培養腫瘤細胞株，腫瘤細胞株包括:K562人慢性髓原白血病細胞，Η460人大細胞肺癌細胞，Α431人表皮癌細胞，BGC-823人低分化胃腺癌細胞，KB人口腔表皮癌細胞，QGY人肝癌細胞，取對數生長期細胞，胰酶消化并洗滌后懸浮于DMEM培養基中，調節細胞懸浮液密度并計數。[0064]根據樣品(包括水提物、乙醇洗脫物以及所得干燥沉淀物)整體的質量，在各洗脫所得成分中分別加入不同體積細胞培養液，配制成具有梯度藥物濃度的培養液，將上述所得各腫瘤細胞分別接種其中，每種細胞樣品在每個藥物濃度點分別作3~6個平行測試。
[0065]將上述所得細胞繼續置于CO2培養箱37°C培養48小時后，每孔加入20 μ 15mg/ml的MTT溶液，繼續在培養箱中保溫3~4小時。再加入100 μ I溶解液，培養箱中保溫過夜，使生成的甲臜晶體充分溶解。測定570nm光吸收值。通過軟件計算樣品對各腫瘤細胞的IC50，其結果如表1所示。
【權利要求】
1.一種獼猴桃素，其特征在于，所述獼猴桃素由包括以下步驟的方法制備而得:將獼猴桃根的水提物用大孔樹脂層析柱分離，將所得分離產物進行醇沉淀，收集沉淀即得。
2.一種獼猴桃素的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟:將獼猴桃根的水提物用大孔樹脂層析柱分離，將所得分離產物進行醇沉淀，收集沉淀即得。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂為極性大孔樹脂，大孔樹脂粒徑為0.3-1.25_，大孔樹脂孔徑力IUO -200A,
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述極性大孔樹脂包括強堿性大孔樹脂或弱堿性大孔樹脂。
5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，將所得分離產物濃縮得到浸膏液，將浸膏液進行醇沉淀后，即得獼猴桃素。
6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂層析柱分離的方法包括:將所述獼猴桃根的水提物的上清液以廣1.5倍柱體積/小時的速度上樣，用洗脫劑以2~3倍柱體積/小時的速度洗脫，收集洗脫液即得。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述洗脫劑包括10%~95%乙醇溶液或15%~30%丙酮溶液，所述百分比為體積百分比。
8.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的醇沉淀包括:加入所得浸膏液的3~5倍體積的90-95%乙醇水溶液，固液分離，取固體即得，所述百分比為體積百分比。
9.如權利要求1所述的獼猴桃素在制備抗腫瘤藥物中的用途。
10.如權利要 求9所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括:白血病，肝癌，肺癌，皮膚癌，胃癌，肝癌，腸癌，口腔癌或淋巴瘤。
【文檔編號】A61P35/00GK103705550SQ201210379662
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年10月8日 優先權日:2012年10月8日
【發明者】沈龍海, 安泳潼, 尹蓓珮, 劉暢, 吳彤, 劉 英 申請人:上海醫藥工業研究院, 中國醫藥工業研究總院