專利名稱：一株犬源地衣芽孢桿菌Y₁₀及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株經分離而獲得的耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好且能較顯著改善犬腸道環境，促進微生態平衡從而降低腹瀉率的地衣芽孢桿菌(BaciIluslicheniformi) Yltl及其在防治犬腹瀉病方面的應用，屬于預防獸醫技術領域。
背景技術：
自上世紀八十年代以來，微生態制劑作為生物獸藥和飼料添加劑已廣泛用于仔豬、犢牛、羔羊、家禽等動物腸炎、腹瀉病的預防和治療上。目前專門用于寵物犬的國產微生態制劑還沒有問世，臨床上常使用人用微生態制劑如整腸生、益菌生等來調節犬的腸道菌群平衡，但效果并不理想。國外已出現了犬用微生態產品，但由于目前微生態制劑作為食品添加劑的相關標準尚不完善，生產質量控制薄弱，一些產品達不到包裝上所標示的活菌數 量，有的產品根本就不含有活菌(任普軍.2006.新獸醫，6 :48-50)，從而導致產品達不到治病、防病的作用，寵物用微生態制劑整體質量水平比較低，完全不能滿足寵物市場快速發展的需要。從2006年I月開始，歐盟已全面禁止在動物飼料中添加抗生素(劉興海.2007.現代畜牧獸醫，5 :35-36)。隨著抗生素在我國的限用，甚至禁用，該病在我國養犬業中將越來越嚴重。因此，開發犬用微生態制劑，不僅對生態養犬和環境治理有重要意義，而且給生物獸藥業和飼料工業帶來巨大的經濟效益。目前許多國外學者對乳酸桿菌應用于犬的研究較多，而對芽孢桿菌應用于犬的研究不足(劉昆.2008.飼料工業，15 54-55)。益生菌(又叫微生態制劑，或微生物制劑，或微生物飼料添加劑)是最先被提出的抗生素替代品，它的作用主要在于扶植正常微生物菌群，調節生態平衡(李長強.2010.江西飼料，2 21-24)。迄今為止尚未見到有關地衣芽孢桿菌Yltl的篩選及其在防治犬腹瀉病中的應用的報道。

發明內容
針對目前抗生素的濫用及禁用導致疾病很難治愈的情況以及犬感染細菌導致腹瀉病后難以治愈或無法治療等問題，本發明的目的是提供一株具有耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl;同時也提供該地衣芽孢桿菌Yltl在獸藥或飼料中的應用，可用以預防和治療犬腹瀉病并調整犬腸道微生態平衡，提高腸道微生物多樣性。本發明參考益生菌可用于臨床上預防和治療動物疾病的思維，從健康犬糞樣中篩選出耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl及菌劑，然后利用該菌劑在獸藥或犬日糧中的應用，證明添加本發明菌劑Yltl后，可以預防和治療犬腹瀉病；同時發現菌劑Yltl的應用能顯著提高犬腸道微生物的多樣性，調整犬腸道微生態平衡，改善犬生長性能。具體講，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是本發明獲得具有耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl的方法是(見圖1)采集健康犬糞樣，用蒸餾水稀釋后，用不同篩選培養基進行分離培養和鑒定，得到一株對葡萄球菌、大腸桿菌CVCC2060、綠膿桿菌、大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌339有顯著抑制作用的菌株Yltl，然后進行耐酸、耐膽鹽試驗。通過PCR擴增出菌株112的163 rDNA片段，經測序獲得目的基因序列。用美國生物信息學中心(NCBI)的BLAST程序對所初步獲得的菌株H2 的 16S rDNA 序列進行登錄，獲得登錄號為 FJ549021 (GenBank(Http://www. ncb1. nlm.nih. gov/blast/),與已收錄的序列進行核苷酸同源性比較。經過微生物學分類鑒定,確定該分離的菌株Ylt!為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) Yltl,該菌株已于2011年4月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為:CCTCC NO M2011134o本發明地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformi)Yltl(以下簡稱為“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”或“地衣芽孢桿菌Y1(l”)按照常規甘油冷凍方法保藏。本發明也提供本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”在獸藥或飼料中的應用。采用農業微生物常規操作方法將本發明制備成含“地衣芽孢桿菌CCTCC2011134”活菌含量不低于1.0X109cfu/g范圍的微生物制劑(以下簡稱“菌劑”)，以不低于0. 1%比例添加在犬日糧中，使其在犬日糧中活菌含量不低于1. OX 106cfu/g，可以預防和治療犬腹瀉病，促進其腸道內正常生理性厭氧菌的生長，調整腸道菌群失調，恢復腸道功能，提高犬腸道 微生物多樣性，增強機體免疫器官指數，改善犬的生長性能。本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC2011134”菌劑還可參照北京順達四海生物藥業有限公司公開的發明專利(公開號為CN102120972A，發明名稱地衣芽孢桿菌菌粉及微生態制劑的制備方法)所介紹的方法生產，應用后同樣能獲得相同效果。本發明具有以下效果(I)本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”具有耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好，可用于治療由大腸桿菌、沙門氏菌等引起的犬腹瀉病并提高犬腸道微生物多樣性。(2)本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”可直接在獸藥或飼料中應用；也可制成微生態制劑，作為生物獸藥和犬食品添加劑使用，比如添加于犬日糧中使用，可有效預防和治療由大腸桿菌、沙門氏菌等引起的腹瀉病，促進其腸道內正常生理性厭氧菌的生長，調整腸道菌群失調，恢復腸道功能，提高犬腸道微生物多樣性及免疫器官指數，改善犬生長性能。這會給生物獸藥業和飼料工業帶來良好的經濟效益。本發明適用于飼料廠和規模化養犬場。


圖1為本發明的技術流程圖。圖2為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”的抑菌試驗結果圖，其中A，B，C，D，E分別為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對大腸桿菌CVCC2060、ATCC25922，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌和沙門氏菌抑菌效果。圖3為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”總DNA的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。圖4為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134” 16S rRNAPCR產物的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。圖5為從Genbank里搜索出芽孢桿菌屬內12個不同種的16S rRNA序列建立芽孢桿菌屬系統發育樹圖。
圖6為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”治療感染腹瀉病幼犬糞樣細菌總DNA的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖。該圖中，Marker為入-1lldigest，樣品在23kb處都有條帶。圖7為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”治療感染腹瀉病犬糞樣細菌16SrRNA V3區PCR擴增結果。該圖中，Marker為D2000，PCR擴增得到200bp左右的16S rRNAV3區片段。圖8-圖9為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對各組幼犬處理0日糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類分析圖。圖10-圖11為本發明“地衣 芽孢桿菌CCTCC 2011134”對各組幼犬處理9日糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類分析圖。圖12-圖13為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對試驗組3幼犬糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類分析圖。圖14-圖15為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對試驗組4幼犬糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類分析圖。圖16為本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對試驗幼犬糞樣微生物群落多樣性的影響圖。
具體實施例方式實施例1:本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”的獲取與鑒定，見圖11、本發明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134” (即地衣芽孢桿菌Yltl)的分離、獲取1.1菌株Yltl的分離采集位于中國四川省雅安市內常見的、家養的健康寵物犬的新鮮糞樣，立即送實驗室檢測。取新鮮糞樣0. 5g，放入加有49. 5ml生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，搖床37°C震蕩20min，然后60°C恒溫水浴20min。取0. 5ml稀釋糞液做十倍遞減稀釋到10_5。從10_3 10_5各稀釋度取100 U L涂布于普通營養瓊脂培養基，37°C恒溫培養12h。鏡檢培養基上的單個菌落。挑取芽孢桿菌單菌落在普通營養瓊脂平板上畫線培養，每個單菌落重復平板畫線2 3次，直到得到純的菌株Yltl即本發明地衣芽孢桿菌Y1(l。將得到的菌株Yltl接種于營養瓊脂斜面，保存備用。1. 2耐酸試驗將篩選到的菌株Yltl培養過夜，離心收集菌體(4000r/min，10min,4°C ) ；0. 25%生理鹽水漂洗一次后離心；懸浮于0. OSM磷酸緩沖液_pH2. 0中，37°C培養I 3h，檢測培養期間活菌數的變化。試驗結果顯示，pH2. 0的緩沖液中3小時后存活率達到80. 32% (見表I)。表明本發明菌株Yltl具有較強的耐酸性。表I菌株Yltl耐酸實驗結果 LogltlCFUAiL
1 OhIh2h3h 存活率(%)
Y10 8.99 7.68 7.43 7.22 80.321. 3耐膽鹽試驗
將篩選到的菌株Yltl培養過夜，離心收集菌體(4000r/min，10min,4°C ) ；0. 25%生理鹽水漂洗一次后離心；懸浮于與初培養基等體積的含1%膽鹽的生理鹽水中，37°C作用6h ;檢測活菌數的變化率。試驗結果顯示，菌株Yltl在6小時后存活率達94. 11% (見表2)。這表明本發明菌株Yltl具有較強的膽鹽耐受性。表2菌株Yltl的膽鹽耐受結果 Log1(lCFU/mL
權利要求
1.一株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yltl,其特征在于該菌株耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好，且能較顯著改善犬腸道環境，促進微生態平衡從而降低腹瀉率。該菌株已于2011年4月20日由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO M2011134。
2.權利要求1所述的菌株或含有該菌株的微生物制劑在防治犬腹瀉病方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一株耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Y10及其在防治犬腸炎、腹瀉病方面的應用。該菌株通過分離、篩選和鑒定而獲得，保藏編號為CCTCC NOM2011134；該地衣芽孢桿菌Y10可制成微生態制劑，作為獸藥和犬食品添加劑使用，調整腸道菌群失調，提高犬腸道微生物多樣性及免疫器官指數，改善犬生長性能，有效防治犬腹瀉病，為預防犬腸道細菌性疾病提供新的思路，同時也為犬源微生態制劑的發展提供可行的備用菌種。本發明適用于飼料廠和規模化養犬場。
文檔編號A61P1/12GK102994416SQ20121038762
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者倪學勤, 曾東, 李潔萍, 曾燕, 舒剛, 景波, 彭煥偉 申請人:四川農業大學