專利名稱：農林廢棄物核桃殼中酪氨酸酶抑制活性成分的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于樹木次生代謝活性成分提取分離技術領域，具體涉及一種以農林廢棄物核桃殼為原料制備酪氨酸酶抑制活性成分的方法及以本方法所制備的核桃殼成分的酪氨酸酶抑制活性的應用。
背景技術：
酪氨酸酶(EC I. 14. 18. I, Tyrosinase)廣泛存在于植物、動物、微生物及人體內，是一種結構復雜的多亞基的含銅氧化還原酶。酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關鍵酶，它既具有單酚酶活性，可以將酪氨酸羥化形成L-多巴(L-Dopa)，也具有二酚酶活力，將L-多巴氧化成多巴醌,繼而生成一系列色素物質(Piao L. Z.,等.Mushroom tyrosinaseinhibition activity of some chromones. Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2002,50(3) :309 311)。酪氨酸酶的活性與人體皮膚黑色素生成、果蔬的褐變等密切相關，酪氨酸酶的異常表達可引起各種各樣的皮膚病、黑色素瘤、神經退行性病變等。因此，合 適的酪氨酸酶抑制劑對防治以上疾病的發生及果蔬保鮮具有重要的意義(涂增清，等.姜黃素多酚類似物對酪氨酸酶抑制活性的研究.日用化學工業，2011,41(1) :27 31)。而且，目前化妝品市場上的美白產品幾乎絕大多數以酪氨酸酶抑制劑為主。與合成的酪氨酸酶抑制活性化合物相比，植物源酪氨酸酶抑制活性成分因為高效、天然、低毒等優勢而具有更好的開發前景，因此從植物中分離提取酪氨酸酶抑制活性成分愈加受到重視(陳清西，等.毛西番蓮提取物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用.廈門大學學報(自然科學版)，2008，47(S2)104 106)。核桃(或胡桃)是胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)落葉喬木果實的統稱。核桃殼是核桃取仁后的農林廢棄物，一直以來，核桃在被深加工利用時所產生的大量集中的核桃殼被丟棄或焚燒，利用價值極低，造成資源的極大浪費而且污染了環境。因此，加強對農林廢棄物核桃殼的綜合利用，研發高附加值的產品，避免核桃殼資源的浪費，不僅可以有效地處理農林固體廢棄物，而且能夠變廢為寶，提高經濟收入，進而產生良好的經濟效益、生態效益和社會效益。據《中華本草》記載，核桃殼味苦、澀，性平，具有止血、止痢、散結消癰、殺蟲止癢等功效，中醫多用其治療婦女崩漏、痛經、久痢、瘧母、乳癰、疥癬、鵝掌風等癥(李寅珊，等.GC-MS法鑒定漾濞泡核桃殼中揮發性化學成分.安徽農業科學，2011，39(25) :15277 15278)?，F代藥理學研究表明核桃殼具有較好的抗氧化、抑菌等生物活性，可用于治療或緩解白內障、急性心肌缺血及近視等(王維亭，等.核桃殼提取物對大鼠急性心肌缺血作用的影響.中國醫院藥學雜志，2010,30(5) :386 388)。但到目前為止，對核桃殼酪氨酸酶抑制活性成分的研究尚未見報導。

發明內容
本發明的目的在于提供一種操作工藝簡單、成本低、周期短、適合規模化生產、可減少農林廢棄物環境污染且能實現廢棄物高值化利用的酪氨酸酶抑制活性成分的制備方法。本發明的另一個目的是提供農林廢棄物核桃殼中的活性成分在作為酪氨酸酶抑制劑方面的應用。本發明的技術方案概述如下本發明提出的農林廢棄物核桃殼中酪氨酸酶抑制活性成分的制備方法，按順序包括如下步驟(I)以洗凈、陰干、粉碎至粒度為20 100目的核桃殼為原料，按質量比為I : I I 10加入體積百分濃度為5% 99%的丙酮水溶液，在加熱或常溫下以浸提或索氏提取或超臨界流體提取或以微波或超聲波輔助提取I 6次，每次IOmin 72h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1% 10%，得到核桃殼粗提物的濃縮液；·
(2)加入濃縮液質量I 8倍的水，攪拌，加入濃縮液質量I 8倍的正己烷萃取I 8次，分離得正己烷萃取剩余相，向正己烷萃取剩余相加入濃縮液質量I 8倍的二氯甲烷萃取I 8次，分離得二氯甲烷萃取剩余相，向二氯甲烷萃取剩余相加入濃縮液質量I 8倍的乙酸乙酯萃取I 8次，分離得乙酸乙酯萃取剩余相，向乙酸乙酯萃取剩余相加入濃縮液質量I 8倍的正丁醇萃取I 8次，分離，得到正丁醇萃取相，將正丁醇萃取相減壓濃縮、冷凍干燥，得到核桃殼正丁醇萃取相粉末；(3)將核桃殼正丁醇萃取相粉末以甲醇溶樣后過常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，以體積比為4 : I 2 : I的甲醇水溶液為流動相得到BI B5五個流分；流分B2以體積比為6 : I 3 : I的二氯甲烷丙酮溶液溶樣，采用常壓硅膠柱層析，體積比起始濃度為8 : I 6 : I中止濃度為4 : I 2 : I的二氯甲烷丙酮溶液梯度洗脫，得到B21 B23三個流分；以體積比為2 I I : 6的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液對B22流分連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析得到化合物I ;流分B3以體積比為I : I I : 3的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓Sephadex LH-20凝膠柱層析，得到B31 B34四個流分；流分B33以體積比為I : 3 I : 5的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓Sephadex LH-20凝膠柱層析，得到流分B331、B333及化合物4 ;流分B333以體積比為2 : I I : 4的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓S印hadexLH-20凝膠柱層析，得到化合物3;流分B4以體積比為7 2 I的二氯甲烷甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓硅膠柱層析，得到流分B42、B43及化合物5 ;流分B42以體積比為2 : I I : 2的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得B421 B423三個流分；流分B422以體積比為I : 3 3 : I的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓Sephadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物2。以上制備方案路線如附圖I所示。用本發明制備的化合物I為1，2，6_三沒食子酰葡萄糖(l,2,6-tri-O-galloyl-0 -D-glucopyranoside),化合物 2 為 3,4,6-三沒食子酰葡萄糖(3,4,6-tri-O-galloyl-0 -D-glucopyranoside),化合物 3 為 2, 3,4,6_ 四沒食子酰葡萄糖(2, 3,4,6-tetra-0-galIoyI- β -D-glucopyranoside)，化合物 4 為 1,2, 3,4,6_ 五沒食子酰葡萄糖(l,2,3,4,6-penta-O-galloyl-0 -D-glucopyranoside),化合物 5 為單寧酸(tannic acid),這五個成分的化學結構如附圖2所示。本發明制備的以上五個化學成分均顏色淺、純度高(經HPLC測定，純度均彡 95% )。
從農林廢棄物核桃殼制備的上述五個成分在制備酪氨酸酶抑制劑中的應用。采用分光光度法評價核桃殼中所制備成分的酪氨酸酶抑制活性，結果顯示核桃殼中制備的五個單體化學成分，即化合物I 5抑制蘑菇酪氨酸酶的半數濃度IC5tl值分別為74. 76±5· 28,76. 37±3· 24,57. 89±4· 26,47. 63±8· 52 及 35. 27±3· 78 μ M，而陽性對照組曲酸(Kojic acid)抑制蘑菇酪氨酸酶的半數濃度IC5tl值為342. 14±23.43μΜ。這充分表明，核桃殼中制備的化合物I 5對蘑菇酪氨酸酶具有顯著的抑制活性，可用于制備酪氨酸酶抑制劑。


圖I為核桃殼中的酪氨酸酶抑制活性成分I 5的制備流程圖。圖2為核桃殼中制備的酪氨酸酶抑制活性成分I 5的結構圖 。
具體實施例方式參考下列實施例將更容易、更全面地理解本發明，給出實施例是為了闡明本發明，而不是以任何方式限制本發明。本發明是從胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)任何一種核桃樹的核桃殼中制備酪氨酸酶抑制活性成分。實施例I普通核桃樹核桃殼中的酪氨酸酶抑制活性成分的制備(I)以3. Okg洗凈、陰干、粉碎至粒度為40目的普通核桃樹(Juglans regia Linn,又名核桃、中國核桃、胡桃等)的核桃殼為原料，按質量比為I : 5加入體積百分濃度為70%的丙酮水溶液，在40°C以索氏提取3次，每次24h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的4%，得到核桃殼粗提物的濃縮液；(2)加入濃縮液質量3倍的水，攪拌，加入濃縮液質量3倍的正己烷萃取3次，分離得正己烷萃取剩余相，向正己烷萃取剩余相加入濃縮液質量3倍的二氯甲烷萃取3次，分離得二氯甲烷萃取剩余相，向二氯甲烷萃取剩余相加入濃縮液質量3倍的乙酸乙酯萃取3次，分離得乙酸乙酯萃取剩余相，向乙酸乙酯萃取剩余相加入濃縮液質量3倍的正丁醇萃取3次，分離，得到正丁醇萃取相，將正丁醇萃取相減壓濃縮、冷凍干燥，得到核桃殼正丁醇萃取相粉末；(3)將核桃殼正丁醇萃取相粉末以甲醇溶樣后過常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，以體積比為4 I的甲醇水溶液為流動相得到BI B5五個流分；流分B2以體積比為6 I的二氯甲烷丙酮溶液溶樣，采用常壓硅膠柱層析，體積比起始濃度為8 I中止濃度為4 I的二氯甲烷丙酮溶液梯度洗脫，得到B21 B23三個流分；以體積比為2 I及I : 2的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液對B22流分連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析得到化合物I;流分B3以體積比為I : I的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到B31 B34四個流分；流分B33以體積比為I : 3的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到流分B331、B333及化合物4 ;流分B333以體積比為2 I及I : 2的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物3;流分B4以體積比為7 2 I的二氯甲烷甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓硅膠柱層析，得到流分B42、B43及化合物5 ;流分B42以體積比為2 I的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadexLH-20凝膠柱層析，得B421 B423三個流分；流分B422以體積比為I : I及3 I的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物2。實施例2核桃楸樹核桃殼中的酪氨酸酶抑制活性成分的制備(I)以4. 5kg洗凈、陰干、粉碎至粒度為60目的核桃楸樹(Juglans mandshuricaMaxim，又名胡桃楸等)的核桃殼為原料，按質量比為I : 4加入體積百分濃度為80%的丙酮水溶液，常溫下浸提4次，每次72h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的5%，得到核桃殼粗提物的濃縮液；(2)加入濃縮液質量2倍的水，攪拌，加入濃縮液質量2倍的正己烷萃取2次，分離得正己烷萃取剩余相，向正己烷萃取剩余相加入濃縮液質量2倍的二氯甲烷萃取2次，分離得二氯甲烷萃取剩余相，向二氯甲烷萃取剩余相加入濃縮液質量2倍的乙酸乙酯萃取2次，分離得乙酸乙酯萃取剩余相，向乙酸乙酯萃取剩余相加入濃縮液質量2倍的正丁醇萃取2 次，分離，得到正丁醇萃取相，將正丁醇萃取相減壓濃縮、冷凍干燥，得到核桃殼正丁醇萃取相粉末；(3)將核桃殼正丁醇萃取相粉末以甲醇溶樣后過常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，以體積比為3 I的甲醇水溶液為流動相得到BI B5五個流分；流分B2以體積比為5 I的二氯甲烷丙酮溶液溶樣，采用常壓硅膠柱層析，體積比起始濃度為7 I中止濃度為3 : I的二氯甲烷丙酮溶液梯度洗脫，得到B21 B23三個流分；以體積比為I : I及I : 3的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液對B22流分連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析得到化合物I;流分B3以體積比為I : 2的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到B31 B34四個流分；流分B33以體積比為I : 4的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到流分B331、B333及化合物4 ;流分B333以體積比為I : I及I : 3的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物3;流分B4以體積比為7 2 I的二氯甲烷甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓硅膠柱層析，得到流分B42、B43及化合物5 ;流分B42以體積比為I : I的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadexLH-20凝膠柱層析，得B421 B423三個流分；流分B422以體積比為I : 2及2 I的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物2。實施例3漾濞泡核桃樹核桃殼中的酪氨酸酶抑制活性成分的制備(I)以6. Okg洗凈、陰干、粉碎至粒度為80目的漾擤泡核桃樹(Juglans sigillataDode,又名三臺泡核桃、鐵核桃、深刻紋泡核桃、茶泡核桃等)的核桃殼為原料,按質量比為I 6加入體積百分濃度為60%的丙酮水溶液，超聲波輔助提取2次，每次12h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的3%，得到核桃殼粗提物的濃縮液；(2)加入濃縮液質量4倍的水，攪拌，加入濃縮液質量4倍的正己烷萃取4次，分離得正己烷萃取剩余相，向正己烷萃取剩余相加入濃縮液質量4倍的二氯甲烷萃取4次，分離得二氯甲烷萃取剩余相，向二氯甲烷萃取剩余相加入濃縮液質量4倍的乙酸乙酯萃取4次，分離得乙酸乙酯萃取剩余相，向乙酸乙酯萃取剩余相加入濃縮液質量4倍的正丁醇萃取4次，分離，得到正丁醇萃取相，將正丁醇萃取相減壓濃縮、冷凍干燥，得到核桃殼正丁醇萃取相粉末；(3)將核桃殼正丁醇萃取相粉末以甲醇溶樣后過常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，以體積比為2 I的甲醇水溶液為流動相得到BI B5五個流分；流分B2以體積比為4 I的二氯甲烷丙酮溶液溶樣，采用常壓硅膠柱層析，體積比起始濃度為6 I中止濃度為2 : I的二氯甲烷丙酮溶液梯度洗脫，得到B21 B23三個流分；以體積比為I : 2及I : 4的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液對B22流分連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析得到化合物I;流分B3以體積比為I : 3的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到B31 B34四個流分；流分B33以體積比為I : 5的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到流分B331、B333及化合物4 ;流分B333以體積比為I : 2及I : 4的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液
連續進行常壓Sephadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物3 ;流分B4以體積比為7 2 I的二氯甲烷甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓硅膠柱層析，得到流分B42、B43及化合物5 ;流分B42以體積比為I : 2的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadexLH-20凝膠柱層析，得B421 B423三個流分；流分B422以體積比為I : 3及I : I的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物2。實施例4制備的核桃殼成分的酪氨酸酶抑制活性對從核桃殼中制備成分的酪氨酸酶抑制活性采用分光光度法測定(Yu L. L.，等· Gusanlungionosides A-D, potential tyrosinase inhibitors from Arcangelisiagusanlung. Journal of Natural Products, 2011, 74 1009 1014)。將 80ul 的憐酸鹽緩沖液(pH值6. 8)、40ul的L-多巴(25mM)及40ul的待測成分加入96孔收集板中混合，然后加入40ul的蘑菇酪氨酸酶(500U/ml)，在25°C下培育lOmin。多巴色素含量以分光光度計在490nm下測定其吸光度值確定。試驗對照組采用酪氨酸酶抑制活性很強的曲酸(Kojicacid)。核桃殼中制備的各成分的酪氨酸酶抑制活性試驗在獨立測定3次后以IC5tl的平均值表不。試驗結果表明核桃殼中制備的五個單體化學成分I 5的抑制蘑燕酪氨酸酶活性的半數濃度 IC50 值分別為 74. 76±5· 28,76. 37±3· 24,57. 89±4· 26,47. 63±8· 52 及35. 27±3. 78μΜ，而抑制蘑菇酪氨酸酶活性顯著的正對照組曲酸的抑制蘑菇酪氨酸酶的半數濃度IC5tl值為342. 14±23. 43 μ Μ。這充分表明，核桃殼中制備的化合物I 5對蘑菇酪氨酸酶具有顯著的抑制活性，可用于制備酪氨酸酶抑制劑。
權利要求
1.一種以農林廢棄物核桃殼制備具有酪氨酸酶抑制活性成分的方法，其特征按順序包括如下步驟 (1)以洗凈、陰干、粉碎至粒度為20 100目的核桃殼為原料，按質量比為I: I 1 10加入體積百分濃度為5% 99%的丙酮水溶液，在加熱或常溫下以浸提或索氏提取或超臨界流體提取或以微波或超聲波輔助提取I 6次，每次IOmin 72h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1% 10%，得到核桃殼粗提物的濃縮液； (2)加入濃縮液質量I 8倍的水，攪拌，加入濃縮液質量I 8倍的正己烷萃取I 8次，分離得正己烷萃取剩余相，向正己烷萃取剩余相加入濃縮液質量I 8倍的二氯甲烷萃取I 8次，分離得二氯甲烷萃取剩余相，向二氯甲烷萃取剩余相加入濃縮液質量I 8倍的乙酸乙酯萃取I 8次，分離得乙酸乙酯萃取剩余相，向乙酸乙酯萃取剩余相加入濃縮液質量I 8倍的正丁醇萃取I 8次，分離，得到正丁醇萃取相，將正丁醇萃取相減壓濃縮、冷凍干燥，得到核桃殼正丁醇萃取相粉末； (3)將核桃殼正丁醇萃取相粉末以甲醇溶樣后過常壓S^hadexLH-20凝膠柱層析，以體積比為4 : I 2 : I的甲醇水溶液為流動相得到BI B5五個流分；流分B2以體積比為6 : I 3 : I的二氯甲烷丙酮溶液溶樣，采用常壓硅膠柱層析，體積比起始濃度為8 : I 6 : I中止濃度為4 : I 2 : I的二氯甲烷丙酮溶液梯度洗脫，得到B21 B23三個流分；以體積比為2 : I I : 6的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液對B22流分連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析得到化合物I;流分B3以體積比為I : I I : 3的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到B31 B34四個流分；流分B33以體積比為I : 3 I : 5的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到流分B331、B333及化合物4 ;流分B333以體積比為2: I I : 4的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物3;流分B4以體積比為7 2 I的二氯甲烷甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓硅膠柱層析，得到流分B42、B43及化合物5 ;流分B42以體積比為2: I I : 2的甲醇水溶液為溶樣劑和洗脫液進行常壓Sephadex LH-20凝膠柱層析，得B421 B423三個流分；流分B422以體積比為I : 3 3 I的乙醇正己烷溶液為溶樣劑和洗脫液連續進行常壓Sephadex LH-20凝膠柱層析，得到化合物2。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征是所述的核桃殼為胡桃科胡桃屬中任何一種核桃樹的核桃殼。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征是所述化合物I 5分別是I，2，6-三沒食子酰葡萄糖、3，4，6-三沒食子酰葡萄糖、2，3,4,6-四沒食子酰葡萄糖、1，2，3,4,6-五沒食子酰葡萄糖及單寧酸。
4.根據權利要求I所述方法制備的核桃殼成分I 5在制備酪氨酸酶抑制劑中的應用。
全文摘要
本發明屬于樹木次生代謝活性成分提取分離技術領域，具體涉及一種以農林廢棄物核桃殼為原料制備酪氨酸酶抑制活性成分的方法及以本方法所制備成分的酪氨酸酶抑制活性應用。本發明以核桃殼為原料，經提取、萃取、分離得到5個成分1，2，6-三沒食子酰葡萄糖、3，4，6-三沒食子酰葡萄糖、2，3，4，6-四沒食子酰葡萄糖、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖及單寧酸。以本發明制備的5個成分的顏色淺、純度高，制備方法具有操作工藝簡單、成本低、周期短、適合規?；a、可減少農林廢棄物環境污染且能實現廢棄物高值化利用的特點。本發明所制備的核桃殼的5個成分對蘑菇酪氨酸酶具有顯著抑制作用，可用于制備酪氨酸酶抑制劑。
文檔編號A61P25/00GK102887924SQ201210409038
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者司傳領, 劉羽 申請人:天津科技大學