專利名稱：一種永久性大腦中動脈閉塞模型的制備方法
技術領域：
本發明涉及動物模型領域，具體地說，是一種在自發性高血壓大鼠基礎上進行永久性大腦中動脈閉塞模型制備的方法。
背景技術：
腦卒中是急性起病的危重急癥。全世界每年有1600萬人因腦卒中而飽受痛苦，到2030年這一數字將增加2倍。缺血性腦卒中占腦卒中病人總數的60%-70%。因此缺血性腦卒中的基礎和臨床研究始終是重要的醫學研究課題。目前針對缺血性腦卒中藥物治療的動物實驗很多，但試驗有效的藥物一旦轉移到臨床上很少能夠觀察到顯著的療效。分析原因可能與以往的動物實驗多采用普通血壓大鼠有關。眾所周知高血壓是腦血管病的最重要的危險因子。臨床上大部分腦卒中病人有高血壓所致的嚴重的腦血管動脈硬化。這種血管的病理改變影響病人腦血流自我調節能力，腦組織受損后的損傷程度，以及病人對治療措施的反應。中國專利文獻CN101056535A公開了一種動脈閉塞性疾病動物模型的構建，通過特定部位的結扎或自體凝血塊使動脈閉塞。中國專利文獻CN101023864A公開了一種建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，采用兩步法建立出血性腦梗死動物模型，即梗塞模型和出血模型的結合，梗塞模型采用線栓法，出血模型采用尾動脈字體血注入法。但是關于一種更接近于臨床的缺血性腦卒中動物模型目前還未見報道。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種永久性大腦中動脈閉塞模型的制備方法。本發明的再一的目的是，提供一種永久性大腦中動脈閉塞模型。本發明的另一的目的是，提供一種永久性大腦中動脈閉塞模型的應用。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是一種永久性大腦中動脈閉塞模型的制備方法，包括以下步驟a、選用自發性高血壓大鼠，b、線栓法建立永久性大腦中動脈閉塞模型。所述的線栓法包括以下步驟麻醉大鼠，頸部正中切口，分離CCA、ICA，ECA與伴行神經后，在ECA穿兩根5-0號線備用；分離并結扎頸外動脈分支甲狀腺上動脈；結扎ECA遠心端，近心端打一個活結備用；用動脈夾暫時夾閉CCA與ICA ;在ECA兩線結之間剪以斜行切口 ；將線栓圓頭向上插入切口后系緊備用的活結防止出血；打開置于CCA與ICA的血管夾；在兩線結之間離斷ECA，將線栓退至ICA與ECA分叉口，然后折返ECA斷端，使之與ICA成直線關系；沿血管走行小心將栓線送入ICA ;微遇阻力時停止送線，測量從分叉口到線栓圓頭端的距離，再次系緊ECA殘端的活結防止出血；剪斷外露的栓線，保留殘端；分層縫合切口。所述的線栓插入距離為18±0· 5mm。
所述的大鼠體重220-270g。所述的線栓的線身直徑24nm,線頭直徑32nm。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是一種永久性大腦中動脈閉塞 模型，根據以上所述的方法制備得到。為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是所述的模型在缺血性腦卒中動物實驗中的應用。本發明優點在于
1、線栓法與顱骨鉆孔手術相比操作簡單；
2、方案操作可行，重復性好，成功率高；
3、更加符合臨床實際。


圖I. MCAO制作示意圖，A :MCA0手術前頸部和大腦血管；B :MCA0手術后頸部和大腦的血管；ACA :大腦前動脈；BA :基底動脈；CCA :頸總動脈；ECA :頸外動脈；ICA :頸內動脈;MCA :大腦中動脈；PCA :大腦后動脈。圖2.實驗腦梗死程度與文獻腦梗死程度比較圖。圖3.手術組與假手術組NeuN染色比較(Bar=50 μ m)。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例I一、實驗方法
I、實驗動物
SPF級雄性自發性高血壓大鼠，體重22(T270g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，大鼠飼養于22 25°C的環境，12h晝夜節律，自由進食與飲水。 2、主要儀器、顯微器械及栓線
電熱恒溫培養箱上海醫學院生理教研室研制；
無創鼠尾動脈測量系統(BPmesure I. O):上海醫學院生理教研室研制；
MCAO線栓北京沙東生物技術有限公司。3、線栓選取
選取北京沙東生物技術有限公司大鼠用2432型號(線身直徑24nm;線頭直徑32nm)的線栓。4、術前血壓測量
術前24h將各組大鼠依次放入電熱恒溫培養箱(由上海醫學院生理教研室提供)15min后溫度達到在40°C左右。將大鼠尾巴放進大鼠無創血壓儀(由上海醫學院生理教研室研制)的尾套中，測收縮壓。5、MCAO模型制備
改良線栓法建立大鼠局灶腦缺血再灌注損傷模型，如圖I所示。具體操作如下按體重比例以10%的水合氯醛腹腔注射(0.4ml/100g)麻醉大鼠。用鑷子鉗夾下肢，大鼠無疼痛反
4應，表示麻醉成功。固定大鼠四肢，擺正頭部，將舌拉向口角一側，棉棒吸痰，利于大鼠麻醉狀態下的呼吸。將電子溫度計探頭涂石蠟油后插入大鼠肛門，持續監測肛溫。術中通過調整照射到大鼠腹部的保溫燈的距離保持肛溫在(37. (TC )。去毛，安而碘消毒后，用剪刀在頸部正中剪I. 5cm長的切口。鈍性分離二腹肌、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌?？梢钥吹诫S心跳波動的頸總動脈(CCA)，以及頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)分叉處。換用纖維解剖顳小心分離CCA、ICA, ECA與伴行神經后在ECA穿2根5-0號線備用。分離并結扎頸外動脈分支甲狀腺上動脈。結扎ECA遠心端，近心端打一個活結備用。用動脈夾暫時夾閉CCA與ICA。用纖維解剖剪在ECA兩線結之間剪以斜行切口，可見少量血液流出。將準備好的線栓圓頭向上插入切口后系緊備用的活結防止出血。打開置于CCA與ICA的血管夾。在兩線結之間離斷ECA，將線栓退至ICA與ECA分叉口，然后折返ECA斷端，使之與ICA成直線關系。沿血管走行小心將栓線送入ICA。微遇阻力時停止送線，測量從分叉口到線栓圓頭端的距離約18±0· 5mm，再次系緊ECA殘端的活結防止出血。剪斷外露的栓線，保留約3_5mm殘端。分層縫合切口后，將大鼠放置在干凈保溫毯上，維持肛溫在37°C，直至動物清醒。術中出現大出血，術后未給予處理即死亡，無神經功能缺損表現且解剖后未發現梗死者以及解剖后發現有蛛網膜下腔出血者給予剔除。6、神經行為學的Longa評分
參照Longa等確立的5級評分法，O分-無神經功能缺失癥狀，活動正常，提起鼠尾，大鼠向地面伸展兩前肢；1分-輕微的神經功能缺損，提起鼠尾時腦缺血病灶對側前肢不能完全伸展，呈持續屈曲狀態，提尾實驗陽性；2分-中度局灶性神經功能缺損，爬行時不能直線行走，向腦缺血病灶對側旋轉；3分-重度局灶性神經功能缺損，向腦缺血病灶對側跌倒，行走時身體向偏癱側傾倒者；4分-無自發活動，不能自發行走，意識障礙。分別于缺血后5h ；24h ;36h (灌注取腦前)對所有大鼠進行評分。7、經心灌流取腦、多聚甲醛后固定及蔗糖脫水
術后36h，將所有大鼠，按O. 8ml/100g的體重比例用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉。剪開胸腔暴露心臟，將灌注針從心尖插入到升主動脈，剪開右心耳。依次快速灌入生理鹽水100ml;4°C 4%多聚甲醛(4%PA) 150ml。然后調節輸液閥維持4%PA20min。迅速取腦，在40C 4%PA中后固定6-8h.然后取出鼠腦，濾紙吸干表面液體，浸入20%蔗糖，待沉底后再次吸干表面液體浸入30%蔗糖。30%蔗糖內沉底后，吸干鼠腦表面附著的液體將其放入鋁箔小帽內，用戊二醛作為傳溫媒介，液氮速凍，備用。8、冰凍組織切片制備
從額極開始，切大鼠冠狀位腦片。將左右腦片開始連在一起的平面作為第I片；每隔8片取I片；每片30 μ m，共取40個層面，將腦片貼在涂硅膠的防脫玻片上，備CV染色用。在視交叉水平開始連續切片，片厚10 μ m，共取20個平面，將腦片貼在涂硅膠的防脫玻片上，備免疫熒光染色用。9、CV染色計算梗死面積用于模型成功的直接評價9. I CV染色步驟
75% 乙醇5min
85% 乙醇5min
95% 乙醇5min100% 乙醇 5min100% 乙醇 3min95% 乙醇3min
85% 乙醇3min
75% 乙醇3min
50% 乙醇3min
ddH20 IminCV 染液 15min75%乙醇 2s85%乙醇2s
95%乙醇I 2s95%乙醇II (O. 3%冰醋酸)2s2s
.甲苯(1:1)5min5min
2s
100%乙醇I100%乙醇II
無水乙醇二甲苯(I: I) 5min二甲苯I二甲苯II中性樹膠封片避光風干保存
9.2腦梗塞體積檢測
CV染色為尼氏染色的一種，正常腦組織可以染成藍色，缺血腦組織因為尼氏體數量減少或消失而呈白色。應用Leica Qwin500圖像采集系統，采集每只大鼠40個層面的CV染色圖像信息(連續切片后每隔8張取I片，每片30 μ m)，然后應用Leica Qwin500圖像分析系統根據腦片著色深淺自動生成閾值分割圖像，測量直接梗塞區面積Sd，正常側大腦半球面積Sc，梗死側大腦半球的面積Si。利用梯形法則計算直接梗塞體積Vd，正常側大腦半球體積Vc,梗死側大腦半球體積Vi。公式為A= Σ (Ai+ A(i+1))/2Xh，公式中A代表所求體積，Ai代表第i層斷面面積，A(i+1)代表第i+Ι層斷面面積，h代表間隔腦片厚度，本實驗為30 μ mX 8=240 μ m。根據Swanson公式計算間接測量梗死區體積,糾正腦水腫對梗死體積的影響V=Vc-(Vi-Vd)，其中V代表矯正腦水腫后的間接梗死體積，Vc代表健側半球體積，Vi代表患側半球的體積，Vd代表未矯正腦水腫的直接梗死體積，Vi-Vd代表梗死半球未梗死的腦組織的體積。最后確定間接腦梗死體積百分比來消除不同大鼠腦體積變化帶來的偏差V%= V/Vc, V%代表腦梗死百分比，V代表間接腦梗死體積，Vc代表健側腦半球體積。二、實驗結果
I、手術成功率
本實驗共重復3次，對27只大鼠采用該方法制作永久性大腦中動脈閉塞模型。結果第I組有I只在MCAO術中因大出血死亡(剔除)，第2組有I只，術后神經功能學評分為O分，在實驗結束后解剖未發現梗塞灶(剔除)，所有大鼠入組與剔除情況見表I。本實驗缺血模型總體成功率為92. 59%。另取8只大鼠作為假手術組，除術中不插入線栓外，其它步驟均與手術組相同。
權利要求
1.一種永久性大腦中動脈閉塞模型的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a、選用自發性高血壓大鼠，b、線栓法建立永久性大腦中動脈閉塞模型。
2.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述的線栓法包括以下步驟麻醉大鼠，頸部正中切口，分離CCA、ICA, ECA與伴行神經后，在ECA穿兩根5-0號線備用；分離并結扎頸外動脈分支甲狀腺上動脈；結扎ECA遠心端，近心端打一個活結備用；用動脈夾暫時夾閉CCA與ICA ;在ECA兩線結之間剪以斜行切口 ；將線栓圓頭向上插入切口后系緊備用的活結防止出血；打開置于CCA與ICA的血管夾；在兩線結之間離斷ECA，將線栓退至ICA與ECA分叉口，然后折返ECA斷端，使之與ICA成直線關系；沿血管走行小心將栓線送入ICA ；微遇阻力時停止送線，測量從分叉口到線栓圓頭端的距離，再次系緊ECA殘端的活結防止出血；剪斷外露的栓線，保留殘端；分層縫合切口。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的線栓插入距離為18±0.5mm。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的大鼠體重220-270g。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的線栓的線身直徑24nm，線頭直徑 32nm。
6.—種永久性大腦中動脈閉塞模型,其特征在于,根據權利要求1-5任一所述的方法制備得到。
7.根據權利要求6所述的模型在缺血性腦卒中動物實驗中的應用。
全文摘要
一種永久性大腦中動脈閉塞模型的制備方法，包括以下步驟a、選用自發性高血壓大鼠，b、線栓法建立永久性大腦中動脈閉塞模型。本發明優點在于線栓法與顱骨鉆孔手術相比操作簡單；方案操作可行，重復性好，成功率高；更加符合臨床實際。
文檔編號A61K49/00GK102908205SQ20121047301
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者范薇 申請人:復旦大學附屬中山醫院