專利名稱：一種大花羅布麻葉總黃酮的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種大花羅布麻葉總黃酮的制備方法和用途，特別是從大花羅布麻葉中提取分離獲得的總黃酮在制備防治阿爾茲海默癥藥物中的應用。
背景技術：
阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)亦稱老年癡呆是一種多見于中老年人的漸進性的中樞神經系統退行性疾病，以進行性的認知障礙、智力減退和人格改變為臨床主要表現。目前在老年人群中已成為僅次于心臟病、惡性腫瘤和中風的第4位死亡原因。目前關于AD的發病機制尚未明確，也尚無有效的治療手段，西醫主要采用膽堿酯酶抑制劑、谷氨酸受體拮抗劑、抗氧化劑、神經保護劑等藥物治療，但這些藥物只能起到緩解某些癥狀的作用，無法補充腦組織中大量丟失的神終元、神經突觸和神經遞質，不能有效的延緩、終止或逆轉病情進展，且有的藥物毒副作用較大。大量的臨床報道以及臨床實踐表明中醫藥在AD治療中顯示出較好的療效和臨床應用前景，特別是在延緩病情進展方面具有潛在的優勢。實驗數據表明，許多中藥具有拮抗AD細胞和動物模型神經元損傷和凋亡的作用。隨著研究的深入和臨床用藥經驗的積累我們將研究重點放在新疆特有中藥大花羅布麻上。野生的大花白麻國內主要分布在新疆伊犁、庫爾勒、阿勒泰等地，是生長在鹽堿、沙荒地區及戈壁灘上的多年生宿根植物資源，獨特的生長環境使其具有十分特異的藥用保健功效。新疆大花羅布麻入藥已有千年歷史，其部分藥理作用很早就被人們發現并用于臨床，據《本草綱目》、《救荒本草》記載，其羅布麻葉有清熱利尿、平肝、安神等功效，臨床用于治療高血壓、冠心病、頸椎病、腎炎浮腫、神經衰弱、更年期綜合征等疾病，1977年正式錄入《中華人民共和國藥典》。現代藥理學研究證明大花羅布麻葉營養豐富，富含羽扇豆醇、金絲桃苷、三葉豆苷、多種氨基酸、多糖、維生素等成分。其中黃酮類物質為羅布麻葉主要的有效部位，近幾年研究表明大花羅布麻葉總黃酮具有抗氧化、抗衰老、抗血栓、增強機體免疫等作用，但大花羅布麻葉總黃酮在阿爾茲海默癥的防治中的應用未見有報道，同時該總黃酮作為制備防治阿爾茲海默癥藥物應用也未見報道。有關羅布麻葉總黃酮的提取分離目前已有報道，主要有①水提醇沉，樹脂分離純化有機溶劑萃取，大孔樹脂分離純化。這些方法均不同程度地存在提取率較低，有機溶劑用量大、處理時間長、環境污染嚴重、不利于人體健康等缺點。因此研究綠色環保、簡單方便的中藥成分提取分離方法已成為當今生物醫藥的前沿課題之一。膜分離技術根據分子相對分子質量的大小，通過膜孔的篩分、吸附等作用，對體系中的不同組分實現選擇性的分離，達到分子水平上的分離和純化，其屬于一種物理分離方法。膜分離技術尤其對中藥的分離有極大的優勢，它不需要添加化學試劑，無二次污染，分離溫度要求不高，對中藥中活性成分破壞小，同時又具有一定脫色作用。膜分離可以有效去除微粒、熱原、微生物和其他無效成分，能大幅提高產物的質量及其穩定性、安全性。該技術具有活性損失小、分離步驟少、操作條件溫和，易于工藝放大和連續操作等優點。

發明內容
本發明的目的是提供一種大花羅布麻葉總黃酮的制備方法和用途，該方法采用膜分離技術對大花羅布麻葉提取物進行了提取分離，得到大花羅布麻葉總黃酮，通過該方法獲得的大花羅布麻葉總黃酮經動物試驗證實了大花羅布麻葉總黃酮對阿爾茲海默癥有良好的防治作用，有效的解決了防治阿爾茲海默癥的藥物問題，開拓了大花羅布麻葉總黃酮新的醫用價值。本發明所述的一種大花羅布麻葉總黃酮的制備方法，按下列步驟進行
a、將干燥的大花羅布麻葉粉碎過20-50目篩成藥粉，用8-10倍量的濃度為60-80%的乙醇加熱回流1-2小時，提取2-3次，合并提取液，濾過，回收乙醇，并濃縮至在溫度50°C時測定相對密度為I. 10-1. 20，得到濃縮液； b、將步驟a濃縮液用水按體積比I:I稀釋的溶液靜置，過濾，濾液以15000轉/分離心分離，取離心后所得上清液，用孔徑O. 02-0. I μ m的微濾膜除沉過濾，跨膜壓力為
O.5Mpa-l. OMpa，料液溫度30_50°C，得到透過液；
C、將步驟b的透過液進行中空纖維超濾膜分離，跨膜壓力O. 5Mpa-1.0Mpa，料液溫度30-50°C，得到超濾液；
d、將步驟c的超濾液再進行中空纖維納濾膜分離，跨膜壓力I.OMpa-2. OMpa，料液溫度30-50°C，得濃縮液；
e、將步驟d所得濃縮液減壓濃縮，干燥即得大花羅布麻有效成分總黃酮。步驟b中空纖維超濾膜的截留分子量為2000-8000。步驟c中空纖維納濾膜的截留分子量為200-600。一種大花羅布麻葉總黃酮的用途，該大花羅布麻葉總黃酮用于在制備防治阿爾茲海默癥中的藥物。本發明所述的一種大花羅布麻葉總黃酮的制備方法和用途，其優點是本發明克服了現有提取分離技術的不足，采用膜分離技術對大花羅布麻葉提取物進行了提取分離，膜分離技術屬于一種物理分離方法，根據物質分子量選擇不同的孔徑截留，既不破壞物質成分，又有選擇性，是一種低能耗，低污染的分離方法。該方法提高了目標成分-總黃酮的含量，去除了大部分無效成分，產品的活性成分得到了有效富集。本發明因為對分離目標有較高的選擇性，所以可根據實際對產品的需要，改變微濾膜、超濾膜和納濾膜規格和操作條件，從而方便的控制所得目標產物的組成。用本發明提供的方法從大花羅布麻葉中分離純化總黃酮，有效成分富集率高，損失少，產物中總黃酮含量達到90%以上，在不改變有效成分結構的前提下，縮短了生產周期，降低了能耗，產品質量得到了大幅提高。本發明所提供的方法具有分離步驟少、操作條件溫和易于工藝放大和連續操作等優點，是一種綠色環保型萃取技術。下面結合具體實施方式
進一步說明本發明，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。
具體實施例方式實施例I
取干燥大花羅布麻葉藥材粉碎，過20目篩，取2kg藥粉，加入10倍量濃度為60%乙醇溶液加熱回流I小時提取2次，合并提取液，濾過，回收乙醇，并濃縮至在50°C時測定相對密度為I. 10-1. 20，得到濃縮液；
將濃縮液用水稀釋為藥材藥液=1:1的溶液(指將濃縮液用水稀釋成與藥材重量體積相等的溶液，即IOOg藥材，將濃縮液稀釋成IOOml )，靜置，過濾，濾液以15000轉/分離心分離，取離心后所得上清液，采用孔徑O. 02 μ m的微濾膜除沉過濾，跨膜壓力為O. 5Mpa，料液溫度30°C，得到透過液；
將所得透過液用截留分子量為2000的超濾膜超濾，跨膜壓力O. 5Mpa，料液溫度30°C，得到超濾液；
將超濾液再進行截留分子為200中空纖維納濾膜分離，跨膜壓力l.OMpa，料液溫度30°C，得到濃縮液；
將所得濃縮液減壓濃縮，干燥即得大花羅布麻葉有效成分總黃酮256g，含量檢測采用高效液相色譜法測定(詳細操作參見《中華人民共和國藥典》2010版一部P196)，本品含總黃酮(以金絲桃苷記)為92. 6%。實施例2
取干燥大花羅布麻葉藥材粉碎，過30目篩，取2kg藥粉，加入8倍量濃度為70%乙醇溶液加熱回流2小時提取2次，合并提取液，濾過，回收乙醇，并濃縮至在50°C時測定相對密度為I. 10-1. 20，得到濃縮液；
將濃縮液用水稀釋為藥材藥液=1 I的溶液，靜置，過濾，濾液以15000轉/分離心分離，取離心后所得上清液，以孔徑O. 04μ m的微濾膜除沉過濾，跨膜壓力為I. OMpa，料液溫度40°C，得到透過液；
將所得透過液用截留分子量為4000的超濾膜超濾，跨膜壓力I. OMpa，料液溫度40°C，得到超濾液；
將超濾液再進行截留分子量為400的中空纖維納濾膜分離，跨膜壓力2. OMpa，料液溫度40°C，得濃縮液；
取所得濃縮液減壓濃縮，干燥即得大花羅布麻葉有效成分總黃酮279g，含量檢測，本品含總黃酮(以金絲桃苷記)為93. 4%。實施例3
取干燥大花羅布麻葉藥材粉碎，過40目篩，取2kg藥粉，加入9倍量濃度為70%乙醇溶液加熱回流I小時提取3次，合并提取液，濾過，回收乙醇，并濃縮至在50°C時測定相對密度為I. 10 I. 20，得到濃縮液；
將濃縮液用水稀釋為藥材藥液=1 I的溶液，靜置，過濾，濾液以15000轉/分離心分離，取離心后所得上清液，以孔徑O. 08 μ m的微濾膜除沉過濾，跨膜壓力為I. OMpa,料液溫度40°C，得到透過液；
將所得透過液用截留分子量為8000的超濾膜超濾，跨膜壓力I. OMpa，料液溫度40°C，得到超濾液；
將超濾液再進行截留分子量為600的中空纖維納濾膜分離，跨膜壓力I. OMpa，料液溫度40°C，得濃縮液；
取所得濃縮液減壓濃縮，干燥即得大花羅布麻葉有效成分總黃酮304g，含量檢測，本品含總黃酮(以金絲桃苷記)為94. 9%。·
實施例4
取干燥大花羅布麻葉藥材粉碎，過50目篩，取2kg藥粉，加入8倍量濃度為80%乙醇溶液加熱回流2小時提取2次，合并提取液，濾過，回收乙醇，并濃縮至在50°C時測定相對密度為I. 10 I. 20，得到濃縮液；
將濃縮液用水稀釋為藥材藥液=1 I的溶液，靜置，過濾，濾液以15000轉/分離心分離，取離心后所得上清液，以孔徑O. I μ m的微濾膜除沉過濾，跨膜壓力為O. 5Mpa，料液溫度50°C，得到透過液；
將所得透過液用截留分子量為8000的超濾膜超濾，跨膜壓力O. 5Mpa，料液溫度50°C，得到超濾液；
將超濾液再進行截留分子量為600的中空纖維納濾膜分離，跨膜壓力2. OMpa，料液溫度50°C，得濃縮液；
取所得濃縮液減壓濃縮，干燥即得大花羅布麻葉有效成分總黃酮293g，含量檢測，本品含總黃酮(以金絲桃苷記)為93. 3%。實施例5
通過本發明所述方法獲得的大花羅布麻葉總黃酮在制備防治阿爾茲海默癥的藥物中的用途，經過動物試驗，證明大花羅布麻葉總黃酮對阿爾茲海默病具有良好的防治效果，有關實驗資料如下
I材料
I. I實驗動物選用健康SD大鼠60只，雌雄各半，體重250±20g，動物證號SCXK(軍)2002006，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，清潔級。隨機分為手術對照組、模型組、總黃酮組(高、中和低劑量)和西藥組，每組各10只；
I. 2試劑Αβ25_35購自Sigma公司，HPLC彡98%，大花羅布麻葉總黃酮自制(純度〉90. 0%)，其它試劑為分析純。鹽酸多奈哌齊(法國PFIZER PGM公司制造，產品批號5136903);
1.3主要儀器大鼠立體定位儀(西安西北光電儀器廠生產)；M0rris水迷宮系統(第四軍醫大學防原教研室提供)=Morris水迷宮為內壁黑色的不銹鋼圓柱形儲水池(d=100cm, h=50 cm),內置一個高度可調位置可移動的黑色圓臺，圓臺頂部直徑為10 cm.在水池上緣等距離設置東南西北四個標記點，以這四個入水點在水面和水桶底部的投影點，將水面和水池均分為四個象限，圓臺設置于某一象限中間.實驗時，使水深淹沒圓臺頂部2 cm,調節水溫至22 24°C之間.整個實驗周期之內室內物品擺設和實驗人員站立位置相對固定，并嚴格控制噪聲干擾。Morris水迷宮系統以圖像采集卡、攝像機、圖像監視器等為主要擴展硬件，利用圖像軟件包提供的各層次庫函數完成數據采集和統計處理；
2方法
2.I試劑的配制Αβ25_35 1.0 11^溶于50(^1無菌生理鹽水(28/1)，-201保存，臨用前置于37°C孵育7天成凝膠態，大花羅布麻葉總黃酮溶于蒸餾水中，現用現配，用前置室溫，搖勻；
2.2動物處理方法及造模手術對照組和模型對照組灌胃給予10 ml/kg生理鹽水，日一次，連續20天，總黃酮高中低劑量組分別灌胃80mg/kg，40mg/kg，20mg/kg，日一次，連續20天，西藥組大鼠每日灌胃給予鹽酸多奈哌齊0.33 mg/kg，每天一次，20天，于灌胃第8天手術對照組雙側海馬各注射5μ I的無菌生理鹽水，其它五組雙側海馬各注射A β25_35 5 μ I(10 μ g)，繼續灌胃，所有動物于灌胃第15天，即海馬注射A β 25_357天后做水迷宮實驗，連續測6天，行大鼠的定位航行實驗，即分別從四個不同方向象限觀察各組大鼠游到平臺所需要的時間及路程，于第20天取組織進行大鼠海馬部位的病理檢查(常規HE染色制片)；
3結果
3.1行為學實驗結果與手術對照組相比，模型對照組大鼠在Morris水迷宮實驗中各個象限的潛伏期(指大鼠在水中不游動，即其失去方向感所消耗的時間)均延長(/Y0. 05)，游泳路程在第二、第四象限明顯縮短(/Y0. 05)，說明模型對照組大鼠的定位能力下降。總黃酮灌胃組(高、中劑量)、西藥組與模型對照組比較在多數象限內潛伏期都明顯縮短(P<0. 05)，游泳路程在第二、第四象限明顯縮短(/Y0. 05)，說明防治有一定效果；總黃酮灌胃組(高、中劑量)與西藥組大鼠無論是潛伏期或是游程均無明顯的變化G°>0. 05)，見表I、表2
權利要求
1.一種大花羅布麻葉總黃酮的制備方法，其特征在于按下列步驟進行 a、將干燥的大花羅布麻葉粉碎過20-50目篩成藥粉，用8-10倍量的濃度為60-80%的乙醇加熱回流1-2小時，提取2-3次，合并提取液，濾過，回收乙醇，并濃縮至在溫度50°C時測定相對密度為I. 10-1. 20，得到濃縮液； b、將步驟a濃縮液用水按體積比I:I稀釋的溶液靜置，過濾，濾液以15000轉/分離心分離，取離心后所得上清液，用孔徑O. 02-0. I μ m的微濾膜除沉過濾，跨膜壓力為O.5Mpa-l. OMpa，料液溫度30_50°C，得到透過液； C、將步驟b的透過液進行中空纖維超濾膜分離，跨膜壓力O. 5Mpa-1.0Mpa，料液溫度30-50°C，得到超濾液； d、將步驟c的超濾液再進行中空纖維納濾膜分離，跨膜壓力I.OMpa-2. OMpa，料液溫度30-50°C，得濃縮液； e、將步驟d所得濃縮液減壓濃縮，干燥即得大花羅布麻有效成分總黃酮。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟b中空纖維超濾膜的截留分子量為2000-8000。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟c中空纖維納濾膜的截留分子量為200-600。
4.一種大花羅布麻葉總黃酮的用途，其特征在于該大花羅布麻葉總黃酮用于在制備防治阿爾茲海默癥中的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種大花羅布麻葉總黃酮的制備方法和用途，該方法采用膜分離技術對大花羅布麻葉提取物進行了提取分離，得到大花羅布麻葉總黃酮，通過該方法獲得的大花羅布麻葉總黃酮經動物試驗證實了大花羅布麻葉總黃酮對阿爾茲海默癥有良好的防治作用，有效的解決了防治阿爾茲海默癥的藥物問題，實現對阿爾茲海默癥的防治，開拓了大花羅布麻葉總黃酮新的醫用價值。
文檔編號A61P25/28GK102935100SQ20121050232
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者周軍, 張瓊, 孫江兵, 雷權, 曾平, 盧靜 申請人:中國人民解放軍蘭州軍區烏魯木齊總醫院