專利名稱：原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物藥學領域，涉及中藥肉桂水提物中的原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應用。
背景技術：
近年來中國已成為全球糖尿病發病率高速增長的地區之一，糖尿病患者總人數位居世界第一。根據國際糖尿病聯盟估計，我國2007年糖尿病患病人數約為3980萬，2025年時將達到5930萬。糖尿病已經成為嚴重威脅我國國民健康和生活質量的重大慢性疾病。糖尿病分為I型和2型，其中2型糖尿病(T2DM)人數占糖尿病患者總數的90%以上，2型糖尿病的病理特征之一為由胰島β細胞分泌的胰島淀粉樣多肽(human isletamyloid polypeptide, hIAPP)的錯誤折疊和形成淀粉樣聚集。這種淀粉樣多肽聚集會破壞膜島 β 細胞膜的結構(參見 L. Haataja, T. Gurlo, C. J. Huang, and P. C. Butler,Islet amyloid in type 2 diabetes, and the toxic oligomer hypothesis. EndocrRev 2008; 29 (3) : 303-316.)，誘導β細胞凋亡，損傷β細胞的功能，被認為是2型糖尿病的重要致病原因之一(參見 Westermark P, Wernstedt C，O’Brien TD, Hayden Dff,Johnson KH. Islet amyloid in type 2 human diabetes mellitus and adult diabeticcats contains a novel putative polypeptide hormone. Am J Pathol 1987; 127 (3):414-417.)。此外，在2型糖尿病中晚期患者中，hIAPP的聚合物還可能通過打斷β細胞間的耦合、誘導β細胞的凋亡等機理，導致β細胞功能的損傷，加重糖尿病的病情。肉桂作為一種傳統中藥，已列入中國藥典。在抗菌抗炎、抗腫瘤和治療糖尿病中有廣泛應用。研究表明肉桂水提物可以抑制阿爾茲海默病中聚集蛋白A-beta的聚集。本發明研究了肉桂水提物對2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽聚集性的影響，并且鑒定了其活性成分。

發明內容
肉桂作為一種傳統中藥在抗菌抗炎、抗腫瘤和治療糖尿病中有廣泛應用。本發明發現中藥肉桂水提物能夠有效抑制2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽的聚集，降低其聚集過程中對β細胞產生的毒性，并且鑒定出其中的有效成分為原花青素。為肉桂或者肉桂原花青素在制備治療2型糖尿病藥物中奠定了基礎。所以本發明提供了原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應用。同時本發明還提供了一種治療糖尿病的藥物，其中含有原花青素作為活性成分。該治療糖尿病的藥物可以按醫藥行業現有技術來制備，比如，取原花青素適量，以乳糖、淀粉和糊精為稀釋劑，羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)為崩解劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑經過篩，混勻，壓片制成原花青素片劑。


圖1，實施例I用反相高效液相色譜鑒定肉桂水提物成分。圖2，實施例2 hIAPP和肉桂水提物、原花青素共浴的硫磺素熒光光譜實驗。圖3，實施例2 hIAPP和肉桂酸、肉桂醛、香豆素共浴的硫磺素熒光光譜實驗 圖4，hIAPP和化合物共浴孵育12小時后在透射電鏡下觀察到的形態。圖5,光催化交聯實驗,用20%的Tricine-Urea凝膠電泳分離并用銀染方法分析結果O圖6，各種肉桂水提物對羧基熒光素泄露的影響。圖7，肉桂水提物或原花青素對紅細胞溶血率的影響。圖8，肉桂水提物或原花青素對細胞存活率的影響。
具體實施例方式下面結合具體實驗，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版);D. L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。本發明所用的肉桂酸(C9H8O2)、肉桂醛(C9H8O )、香豆素(C9H6O2)和原花青素(C3tlH26O12)均訂購于阿拉丁試劑有限公司(中國)；胰島淀粉樣多肽訂購于金絲瑞公司(美國)，其它本發明所涉及到試劑均訂購于奧德里奇-西格瑪公司(美國)。實施例I.反相高效液相色譜(reverse phase high performance liquidchromatography)鑒定肉桂水提物。具體操作采用Apollo C18色譜柱(250X4.6 mm, 5 μ m)，柱溫為40°C。流動相為60%乙腈，等梯度洗脫，流速為lml/min。檢測波長為280 nm。結果如圖I所示，原花青素，肉桂酸，香豆素，肉桂醛標準品的保留時間分別為2.09 min, 3.87 min, 4.56 min 和 5. 77 min (見圖 1A，1B，IC 和 1D)，通過和肉桂水提物的各個峰的半保留時間對比得知，肉桂水提物中的主要成分為原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素(見圖1E)。實施例2.硫磺素突光光譜實驗(Thioflavin-T fluorescence assay)
具體操作將胰島淀粉樣多肽(hIAPP)溶解于六氟異丙醇(HFIP)并超聲2分鐘，用25 mM PBS (50 mM NaCl，pH7. 4)將其溶解稀釋為含1% HFIP終濃度為13 μ M的溶液。在25°C下分別與肉桂水提物、原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素共水浴，每兩小時取點，用日立2700熒光分析儀進行分析，檢測體系包含25 mM PBS (50 mM NaCl, pH 7.4)和26 μ M硫磺素(Thioflavin-T),激發和發射波長分別為450 nm和482 nm,波長掃描60 s,記錄數據分析。結果如圖2、圖3所示，hIAPP隨著孵育的時間增加逐漸開始聚集，同時熒光信號強度隨著hIAPP的聚集而增強。當加入肉桂水提物后，熒光信號強度隨著肉桂水提物濃度的上升而下降(見圖2)。相同地，加入原花青素后，熒光信號強度隨著原花青素的濃度升高而降低，當原花青素與hIAPP的摩爾濃度達到2:1時，熒光信號強度幾乎完全被抑制(見圖
2)。然而當加入近飽和濃度的肉桂酸、肉桂醛和香豆素時，熒光信號強度與只有hIAPP時相似(見圖3)。該實驗說明肉桂水提物和原花青素均能有效地抑制hIAPP的聚集，而肉桂酸、肉桂醛和香豆素不能抑制hIAPP的聚集。實施例3.透射電鏡實驗(Transmission electronic microscopy)
具體操作取實施例2中孵育12小時的樣品在透射電鏡下觀察其形態。結果如圖4所示，hIAPP單獨孵育12小時后呈現細長的纖維狀形態(見圖4A)。當hIAPP分別和O. 26 μ g/ml的肉桂水提物、I. 3 μ M的原花青素共同孵育12小時后呈現短小的纖維狀形態(見圖4B，4D)，當hIAPP和分別和26 μ g/ml的肉桂水提物、26 μ M的原花青素共同孵育12小時后沒有觀察到典型的纖維狀形態(見圖4C，4E)。說明肉桂水提物和原花青素對hIAPP的聚集有抑制作用，且呈現劑量依賴性。當hIAPP分別和近飽和濃度的肉桂 酸、肉桂醛、香豆素共同孵育時，仍可以觀察到大量的細長的纖維狀形態(見圖4F-H)，說明肉桂酸、肉桂醛和香豆素不能抑制hIAPP的聚集。
實施例4.未修飾蛋白的光催化交聯實驗(Photo-induced cross-linking ofunmodified proteins assay)
具體操作將hIAPP溶解于HFIP并超聲2分鐘，用25 mM PBS (50 mM NaCl, pH7. 4)將其溶解稀釋為含1% HFIP終濃度為41 μ M的溶液，分別和肉桂水提物、原花青素在交聯劑的作用下在暗箱中用白熾光照射5 s促進交聯，加入上樣緩沖液97°C變性10分鐘，用20%的Tricine-Urea凝膠電泳分離并用銀染方法分析結果。結果如圖5所示，hIAPP在光處理5 s后形成了較多的多聚體(見圖5第2條帶)。在加入了肉桂水提物多聚物呈現劑量依賴性地減少(見圖5第3、4、5條帶，肉桂水提物濃度分別為0.82 Pg/ml、8. 2 Pg/ml和82 Pg/ml);同樣地，在加入原花青素后多聚物也呈現劑量依賴性地減少(見圖5第6、7、8條帶，原花青素的濃度分別為4. I μΜ、41 μΜ和82 μΜ)。該實驗說明肉桂水提物和原花青素對hIAPP的毒性聚集有抑制作用。實施例5.羧基突光素泄露實驗(dye leakage assay)
具體操作利用 2-01eoyl-l-palmitoyl-sn-glycerol-3-phospho-rac (1-glycerol)sodium salt (POPG)制作包裹有羧基熒光素的POPG脂質膜(模擬生物膜)，加入hIAPP和肉桂水提物或原花青素以檢測其對hIAPP毒性的影響。結果如圖6所示，0. 5 μ M的hIAPP能夠顯著地破壞模擬生物膜，造成了 95%的POPG脂質膜熒光泄露，當肉桂水提物或原花青素存在時，破膜率顯著性地降低。實施例6.紅細胞溶血實驗(Hemolysis assay)
具體操作hIAPP和肉桂水提物或原花青素與人紅細胞共同在37°C下孵育5小時，上清在540 nm下測吸光度值，計算溶血率，通過比較溶血率得出肉桂水提物和原花青素對hIAPP毒性的影響。結果如圖7所示，單獨15 μ M的hIAPP存在時紅細胞溶血率達到94%，加入肉桂水提物或原花青素后，紅細胞溶血率呈現劑量依賴性地降低。實施例7.細胞毒性實驗(MTT assay)
具體操作將大鼠胰腺腫瘤β-細胞(INS-1細胞)以5Χ105 cells/ml的密度平鋪在培養皿上，37°C和5% CO2的培養箱中孵育24小時，換含15 μ M的hIAPP和肉桂水提物或原花青素的培養基，再孵育24小時。加入塞唑藍(MTT)進一步孵育4 h后在570nm下的吸光度。結果如圖8所示，加入15 μ M的hIAPP后細胞存活率與對照組相比顯著降低。加入肉桂水提物或原花青素后，細胞存活率呈現劑量依賴性地上升。前期研究表明，胰島淀粉樣多肽在體內的聚集與2型糖尿病的發生和發展有密切關系。這一聚集過程會破壞胰島β細胞膜的結構(參見L. Haataja, T. Gurlo, C. J.Huang, and P. C. Butler, Islet amyloid in type 2 diabetes, and the toxic oligomerhypothesis. Endocr Rev 2008; 29 (3): 303-316·),誘導 β 細胞凋亡，損傷 β 細胞的功能。本發明通過以上實驗發現肉桂水提物可以有效抑制hIAPP的聚集，其四種主要成分為原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素，其中原花青素可以有效抑制hIAPP的聚集。認為肉桂水提物中抑制hIAPP聚集的有效活性成分為原花青素。hIAPP的毒性實驗證實肉桂水提物和原花青素可以有效地降低hIAPP在聚集過程中產生的毒性，并有效提高大鼠胰腺腫瘤β-細胞(INS-1細胞)在hIAPP存在條件下的存活率。這些結果表明肉桂水提物中的原花青素以抑制胰島淀粉樣多肽聚集為靶點，在制備治療2型糖尿病藥物中具有極大地應用價值。人體內的胰島淀粉樣多肽的濃度在pM級別(參見Young A. Tissue expressionand secretion of amyl in. Adv Pharmacol 2005; 52:19-45.),原花青素在體內的濃度可以達到 MM 級別(R. R. Holt, S. A. Lazarus, M. C. Sullards, Q. Y. Zhu, D. D.Schramm, J. F. Hammer stone, C. G. Fraga, Η. H. Schmitz, and C. L. Keen, Procyanidin dimer B2 [epicatechin-(4beta-8)-epicatechin] in human plasma after theconsumption of a flavanol-rich cocoa. Am J Clin Nutr 2002; 76 (4): 798-804.；R. Rajbhandar i, N. Peng, R. Moore, A. Arab shah i, J. M. ffyss, S. Barnes, and J. K.Prasain, Determination of cranberry phenolic metabolites in rats by liquidchromatography-tandem mass spectrometry. J Agric Food Chem 2011; 59 (12):6682-6688)，在實驗中原花青素和胰島淀粉樣多肽的摩爾濃度達到2:1時可以抑制該多肽的聚集。因此，以原花青素為抗糖尿病藥物的主要成分，在體內僅僅需要PM級別就能達到很好的治療效果。所以本發明不僅提供了原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應用，同時還提供了一種治療糖尿病的藥物，其中以原花青素作為活性成分，藥學上可接受的輔料作為載體，t匕如以乳糖、淀粉和糊精為稀釋劑，羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)為崩解劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑。
權利要求
1.原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應用。
2.一種用于治療糖尿病的藥物，其中含有原花青素。
3.根據權利要求2所述的藥物，其中還含有乳糖、淀粉和糊精為稀釋劑，羧甲基淀粉鈉為崩解劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑。
全文摘要
本發明涉及中藥肉桂水提物中的原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應用。胰島淀粉樣多肽在體內發生聚集，這一聚集過程會破壞胰島β細胞膜的結構，誘導β細胞凋亡，損傷β細胞的功能，被認為是2型糖尿病的重要致病原因之一。本發明發現中藥肉桂水提物中的原花青素能夠有效抑制2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽的聚集，同時逆轉其聚集過程中對β細胞產生的毒性，從而保護β細胞。本發明發現肉桂原花青素能夠以抗胰島淀粉樣多肽聚集為靶點，在制備治療2型糖尿病藥物中具有極大的應用價值。
文檔編號A61K31/353GK102940624SQ20121050244
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者黃昆, 焦麗華, 朱俊銘, 鄭凌 申請人:武漢百奧京生物醫藥有限公司, 武漢生物技術研究院