專利名稱：一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法
一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法技術領域
本發明屬于藥物載體的制備領域，特別涉及一種含糖溫度響應性蛋白類藥物載體的制備方法。
背景技術：
糖是一類多羥基化合物，具有極強的親水性。因此，糖經常被用來改善材料的親水性及抑制蛋白質等物質在材料表面的非特異性吸附。糖的重要生物功能之一就是特異性識別蛋白質。將糖固定在材料表面，可模擬細胞膜表面的糖基，開展糖基選擇性識別、多價識別及識別影響因素等多方面的研究。根據固定的糖基類型，糖基化材料可用于目標蛋白質的識別及分離。凝集素就是一類能被糖所識別的蛋白質，是診斷和治療等研究領域的重要媒介。例如，枷寄生凝集素在臨床上是一種抗癌試劑。
微凝膠是一種高度交聯的三維網絡結構聚合物膠體顆粒，能夠吸收水分或其他溶劑呈現為凝膠狀態，顆粒尺寸大約在50 5000nm之間，根據分類系統的不同可以有多種分類方法，如按其側基的性質可分為中性或者離子型凝膠，按其制備方法可分為均聚物或共聚物網狀凝膠，按照其網絡的物理結構又可分為無定形結構、半晶質結構、氫鍵鍵合、超分子結構和水狀膠體聚集體等，根據來源可分為天然和合成凝膠，根據凝膠形成機制可分為物理和化學凝膠。微凝膠具有良好的生物相容性，吸水率高，保水率強，可用于接觸性鏡片、 生物傳感器、人造組織器官材料與藥物輸送系統等。
環境響應性微凝膠是指因外部環境如溫度、pH值、離子強度、磁場強度等的變化， 微凝膠內部發生溶劑的滲入而溶脹或者擠出而退溶脹，從而引起微凝膠的性能變化。在各類環境響應性微凝膠中研究最為集中的是以聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)為基本組成的微凝膠，由于PNIPAAm凝膠在體溫附近存在相轉移溫度，當溫度從低于其相轉移溫度逐漸升高時，PNIPAAm溶液會發生溶膠-凝膠(sol-gel)轉變，因此該凝膠在生物醫藥載體、 組織工程、化妝品、涂料及工業工藝中廣泛采用微凝膠來改善流變性能、實現緩釋、保持水份及實現其它多種功能。
另外，通過感應病原體或熱原(如發熱、腫瘤)存在下人體溫度的變化來改變自身膨脹/收縮狀態，因此可將其作為藥物釋放的骨架材料，控釋膜設計靶向釋藥和脈沖式釋藥。它的釋藥模式為，在低于其VPTT時水凝膠在藥物溶液中溶脹以吸附藥物，而在高于 LCST時收縮而釋放藥物；或者是在聚合物中引入疏水基團后的“on-off’釋放模式。但是溫敏性凝膠PNIPAAm及其衍生物的臨床應用還有一些局限性，如合成水凝膠的單體和交聯物不具有生物相容，即可能有毒勝、致癌性，盡管NIPAAm及其衍生物不能生物降解，但其聚合物卻有比較好的生物相容性。
鑒于有研究者利用糖基與凝集素之間的親和作用，制備了具有糖響應性的智能水凝膠，用于蛋白質等分子的可控釋放，本發明采用簡易可行的化學反應，旨在建立一種簡單的高密度糖基化PNIPAAm微凝膠，探究膜表面糖基與蛋白質相互作用規律，構建蛋白質高效識別與純化系統，豐富膜分離、表面與界面、糖生物學等應用領域。
目前的研究文獻以及專利，刺激響應性聚合物存在制備過程復雜，實驗條件過高， 工業化困難等不足等缺點。發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，該方法合成路線簡潔，工藝流程短，反應條件溫和，毒性低，易于工業化，進一步降低了成本；通過控制兩共聚單體的投料比得到一系列不同相轉變溫度含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體。本發明制備方法簡單，反應條件溫和，設備簡單易控，操作簡便易行，所得納米微凝膠尺寸可控、均勻，穩定性好，易于工業化；可應用于藥物靶向輸送和蛋白質分離提取等領域。
本發明的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，包括
(I)將脂肪族二酸與醋酸乙烯酯混合，加入催化劑，于60 75°C反應得到脂肪族二酸二乙烯酯；
(2)將脂肪族二酸二乙烯酯和葡萄糖溶于有機溶劑中，再加入枯草桿菌堿性蛋白酶(無錫雪梅科技有限公司)或脂肪酶LipaseAY30 (無錫雪梅科技有限公司)，50°C反應4飛天，合成可聚合含糖親水單體；其中脂肪族二酸二乙烯酯與葡萄糖摩爾比為3:1-15:1 ;枯草桿菌堿性蛋白酶或脂肪酶LipaseAY30與葡萄糖的質量比為1:2-1:10 ;
(3)將上述可聚合含糖親水單體、N-異丙基丙烯酰胺單體、交聯劑、乳化劑完全溶于水中；其中N-異丙基丙烯酰胺與可聚合含糖親水單體的摩爾比例為3:1 15:1 ;交聯劑及乳化劑投料量占聚合單體物質的量百分比為1% 10%。
(4)將上述溶液加熱到3(T80°C穩定l(T60min，同時通入氮氣除氧，加入引發劑， 氮氣保護下，攪拌，3(T80°C下反應O. 5 10h，加入蛋白質類大分子藥物，透析，即得含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體，其中引發劑與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1:1-1:100。
所述步驟(I)中的脂肪族二酸為丁二酸、己二酸、壬二酸、癸二酸中的一種。
所述步驟(I)中的催化劑為為硫酸銅或醋酸汞。
所述步驟(2)中有機溶劑為吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、丙酮、N，N-二甲基乙酰胺中的一種。
所述步驟(3)中的交聯劑為N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、N，N'-雙(羥甲基)尿素、乙二胺、聚乙二醇、乙二醇、二環氧甘油醚、甘油中的一種。
所述步驟(3 )中的乳化劑為十_■燒基苯橫酸納、十_■燒基硫酸納、聚氧化乙稀燒基芳基醚、司盤80、司盤60、硬脂酸鈉中的一種。
所述步驟(4)中引發劑為過硫酸鉀、過硫酸銨、偶氮二異丁腈、過氧化苯甲酰、四氯化鈦中的一種。
所述步驟(4)中蛋白質類大分子藥物為牛血清蛋白、抗體或胰島素。
所述步驟(4)中的透析時間為2 7天，透析袋截留分子量為3000 14000。
所述步驟(4)中制備的蛋白類藥物載體流體力學直徑5(T500nm，制備的乳液冷凍干燥后蛋白類藥物載體。
所述步驟(4)中制備的含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體相轉變溫度為34°C 45 O。
為了研究證實含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的藥物緩釋效果，我們將載藥量為10wt%的含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體試樣置于pH為7. 4的PBS緩沖溶液中，分別在溫度為25°C (低于LCST)和37°C (高于LCST)的條件下實施體外緩釋實驗。
本發明的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，將N-異丙基丙烯酰胺、可聚合含糖親水單體，交聯劑，乳化劑以一定比例混合，并完全溶于去離子水中，加熱反應單體溶液至一定溫度，并保持一定時間，通入氮氣除氧，加入引發劑，在氮氣保護下，于 30 80°C下反應若干小時得到聚合物乳液，最后將上述聚合物乳液置于傾入透析袋內，加入一定量的蛋白類大分子，去離子水透析2 7天，即可得到粒徑均勻的含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體。
有益效果
(I)本發明所用聚合單體來源豐富，價格低廉，成本較低；
(2)本發明本方法合成路線簡潔，工藝流程短，反應條件溫和，毒性低，易于工業化，進一步降低了成本；
(3)本發明通過控制兩共聚單體的投料比得到一系列不同相轉變溫度含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體；
(4)本發明制備的含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體可應用于藥物靶向輸送和蛋白質分離提取等領域。


圖I是本發明含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體掃描電鏡圖2是實施例I中含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的儲能模量隨溫度變化示意圖3是實施例I所得的含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體以BSA為模型藥物的緩釋圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例I
(I)己二酸二乙烯酯的合成
將己二酸14g與醋酸乙烯酯80mL混合，加入催化劑硫酸銅O. 2g，于70°C反應得到己二酸二乙烯酯16g，收率81% ；
(2)可聚合葡萄糖己二酸二乙烯酯的酶促合成
將13. 14g己二酸二乙烯酯(O. 066mol)、3. 96g葡萄糖、I. Og枯草桿菌蛋白酶和 IOOmL無水吡啶加入250mL錐形瓶中，放入50°C恒溫振蕩培養箱中反應4d，轉速為210rpm。 反應過程用薄層層析(TLC)定性監測，展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水(體積比為17:3:1)，用 I2顯色。反應結束后，過濾除去枯草桿菌蛋白酶并減壓蒸餾除去大部分吡啶，粗產物用柱層析法提純，洗脫劑為純乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水(體積比為17:3:1)，用I2顯色。最后經旋轉蒸發除去洗脫劑得到白色固體產物。
(3)N_異丙基丙烯酰胺11. 3g、葡萄糖己二酸二乙烯酯5. 3g，交聯劑N，N'-雙(羥甲基)尿素O. 7g，乳化劑十二烷基苯磺酸鈉I. Og混合，并完全溶于去離子水中；將上述反應單體溶液加熱至50°C，并保持30分鐘，同時通入氮氣除氧，加入過二硫酸鉀O. 6g，在氮氣氣氛保護下，磁力攪拌，于50°C下反應6小時得到聚合物乳液；將上述聚合物乳液置于傾入截留分子量為8000的透析袋內，加入一定量的蛋白質類藥物，去離子水透析4天，即可得到粒徑均勻的含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體。
為了研究證實Poly (VAGA-CO-NIPAAm)微凝膠的藥物緩釋效果，我們將載藥量為 10wt%的Poly(VAGA-C0-NIPAAm)微凝膠試樣置于pH為7. 4的PBS緩沖溶液中，分別在溫度為25°C (低于LCST)和37°C (高于LCST)的條件下實施體外緩釋實驗。取出直接放入盛有400mL蒸懼水的三角瓶中，搖床控溫,每隔一定時間取出3mL水溶液,再補加3mL蒸懼水以使溶液總體積始終保持不變。用紫外可見分光光度計(Lambda Bio35, Perkin-Elmer) 測定不同溫度下280nm處取出溶液的吸光度，并根據藥物濃度_吸光度的標準工作曲線換算c (yg/mL) =(A-0. 02481) / O. 00682，其中A是280nm處的吸光度。累積釋藥量用以下關系計算累積釋藥量(％) =(Mt / M0) X 100%，式中Mt是t時刻的釋藥量，Mtl是 Poly(VAGA-co-NIPAAm)微凝膠中所包載的總藥量，通過從初始投藥量(30mg)中扣除未包進去的藥量得到Mtl，而未包進去的藥量則通過測定透析外液在280nm處的吸光度換算得到。 實驗和計算結果表明Mtl = 7. 89mg，包封率(EE)由以下公式計算為26. 3%。
(EE(%) =M0ZMoo, M00為 BSA 最初總的添加量)
實施例2
(I)己二酸二乙烯酯的合成
將己二酸14g與醋酸乙烯酯80mL混合，加入催化劑硫酸銅O. 2g，于70°C反應得到己二酸二乙烯酯16g，收率81% ；
(2)可聚合葡萄糖己二酸二乙烯酯的酶促合成
將13. 14g己二酸二乙烯酯(O. 066mol)、3. 96g葡萄糖、I. Og枯草桿菌蛋白酶和 IOOmL無水吡啶加入250mL錐形瓶中，放入50°C恒溫振蕩培養箱中反應4d，轉速為210rpm。 反應過程用薄層層析(TLC)定性監測，展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水(體積比為17:3:1)，用 I2顯色。反應結束后，過濾除去枯草桿菌蛋白酶并減壓蒸餾除去大部分吡啶，粗產物用柱層析法提純，洗脫劑為純乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水(體積比為17:3:1)，用I2顯色。最后經旋轉蒸發除去洗脫劑得到白色固體產物。
(3)N_異丙基丙烯酰胺11. 3g、葡萄糖己二酸二乙烯酯2. 4g，交聯劑N，N'-雙(羥甲基)尿素O. 4g，乳化劑十二烷基苯磺酸鈉O. 7g混合，并完全溶于去離子水中；將上述反應單體溶液加熱至50°C，并保持10分鐘，同時通入氮氣除氧，加入過二硫酸鉀O. 5g，在氮氣氣氛保護下，磁力攪拌，于50°C下反應O. 5小時得到聚合物乳液；將上述聚合物乳液置于傾入截留分子量為8000的透析袋內，加入一定量的蛋白質類藥物，去離子水透析7天，即可得到粒徑均勻的含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體。
實施例3
(I)己二酸二乙烯酯的合成
將己二酸14g與醋酸乙烯酯80mL混合，加入催化劑硫酸銅O. 2g，于70°C反應得到己二酸二乙烯酯16g，收率81% ；
(2)可聚合葡萄糖己二酸二乙烯酯的酶促合成
將13. 14g己二酸二乙烯酯(O. 066mol)、3. 96g葡萄糖、I. Og枯草桿菌蛋白酶和 IOOmL無水吡啶加入250mL錐形瓶中，放入50°C恒溫振蕩培養箱中反應4d，轉速為210rpm。 反應過程用薄層層析(TLC)定性監測，展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水(體積比為17:3:1)，用 I2顯色。反應結束后，過濾除去枯草桿菌蛋白酶并減壓蒸餾除去大部分吡啶，粗產物用柱層析法提純，洗脫劑為純乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水(體積比為17:3:1)，用I2顯色。最后經旋轉蒸發除去洗脫劑得到白色固體產物。
(3)N_異丙基丙烯酰胺11. 3g、葡萄糖己二酸二乙烯酯1.28，交聯劑1^ -亞甲基雙丙烯酰胺O. 8g,乳化劑十二燒基苯磺酸鈉O. 6g,混合,并完全溶于去離子水中；將上述反應單體溶液加熱至65 °C，并保持50分鐘，同時通入氮氣除氧，加入過二硫酸鉀O. 4g，在氮氣氣氛保護下，磁力攪拌，于65°C下反應5小時得到聚合物乳液；將上述聚合物乳液置于傾入截留分子量為8000的透析袋內，加入一定量的蛋白質類藥物，去離子水透析4天，即可得到含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體。
權利要求
1.一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，包括 (1)將脂肪族二酸與醋酸乙烯酯混合，加入催化劑，于60 75°C反應得到脂肪族二酸二乙烯酯； (2)將脂肪族二酸二乙烯酯和葡萄糖溶于有機溶劑中，再加入枯草桿菌堿性蛋白酶或脂肪酶LipaseAY30, 50°C反應4飛天,合成可聚合含糖親水單體；其中脂肪族二酸二乙烯酯與葡萄糖摩爾比為3:1-15:1 ;枯草桿菌堿性蛋白酶或脂肪酶LipaseAY30與葡萄糖的質量比為 1:2-1:10 ； (3)將上述可聚合含糖親水單體、N-異丙基丙烯酰胺單體、交聯劑、乳化劑溶于水中；其中N-異丙基丙烯酰胺與可聚合含糖親水單體的摩爾比例為3:1 15:1 ;交聯劑及乳化劑投料量占聚合單體物質的量百分比為1% 10% ； (4)將上述溶液加熱到3(T80°C穩定l(T60min，同時通入氮氣除氧，加入引發劑，氮氣保護下，攪拌，3(T80°C下反應O. 5 10h，加入蛋白質類大分子藥物，透析，即得含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體，其中引發劑與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1:1-1:100。
2.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的脂肪族二酸為丁二酸、己二酸、壬二酸、癸二酸中的一種。
3.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的催化劑為為硫酸銅或醋酸汞。
4.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中有機溶劑為吡唆、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、丙酮、N，N-二甲基乙酰胺中的一種。
5.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的交聯劑為N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、N，N'-雙(羥甲基)尿素、乙二胺、聚乙二醇、乙二醇、二環氧甘油醚、甘油中的一種。
6.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的乳化劑為十_■燒基苯橫酸納、十_■燒基硫酸納、聚氧化乙稀燒基芳基醚、司盤80、司盤60、硬脂酸鈉中的一種。
7.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中引發劑為過硫酸鉀、過硫酸銨、偶氮二異丁腈、過氧化苯甲酰、四氯化鈦中的一種。
8.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中蛋白質類大分子藥物為牛血清蛋白、抗體或胰島素。
9.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的透析時間為2 7天，透析袋截留分子量為3000 14000。
10.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中制備的蛋白類藥物載體流體力學直徑5(T500nm，制備的乳液冷凍干燥后蛋白類藥物載體。
11.根據權利要求I所述的一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中制備的含糖溫度響應性蛋白類藥物載體的相轉變溫度為34°C 45。。。
全文摘要
本發明涉及一種含糖溫度響應性蛋白質類藥物載體的制備方法，包括(1)將脂肪族二酸與醋酸乙烯酯混合，加入催化劑，反應得到脂肪族二酸二乙烯酯；(2)將脂肪族二酸二乙烯酯和葡萄糖溶于有機溶劑中，再加入枯草桿菌堿性蛋白酶或脂肪酶LipaseAY30，合成可聚合含糖親水單體；(3)將上述可聚合含糖親水單體、N-異丙基丙烯酰胺單體、交聯劑、乳化劑完全溶于水中；(4)將上述溶液加熱穩定，通入氮氣除氧，加入引發劑，氮氣保護下，攪拌，反應；(5)加入蛋白質類大分子藥物，透析，即得。本發明制備方法簡單，反應條件溫和，設備簡單易控，操作簡便易行，所得蛋白質類藥物載體尺寸可控、均勻，穩定性好；可應用于藥物靶向輸送以及緩釋、蛋白質分離提取等領域。
文檔編號A61K39/395GK102973944SQ20121050695
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者朱利民, 婁少峰, 權靜, 張婳 申請人:東華大學