皮膚美白物質篩選系統的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種包括含有纖維原細胞、角化細胞及黑素細胞中的一種以上細胞的層的皮膚美白物質篩選系統，其中所述層多于或等于一層，以及利用所述系統的皮膚美白物質篩選方法。另外，本發明公開了一種含有由皮膚美白物質篩選方法篩選出的物質作為有效成分的皮膚美白用組合物。
【專利說明】皮膚美白物質篩選系統
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種皮膚美白物質篩選系統及皮膚美白物質篩選方法。
【背景技術】
[0002]迄今為止，在開發新的皮膚美白物質時，使用下述方法，即，將候選物質對黑色素生成細胞即黑素細胞(melanocyte)進行直接處理后，確認是否抑制黑色素生成，或者對黑素細胞照射紫外線，確認候選物質是否屏蔽了此時產生的黑色素生成信號。但是，實際上在皮膚中，黑素細胞并不是單獨存在的，而是直接或間接地受到其它的周邊細胞或微生境的物理或化學影響而生成黑色素，如果僅有黑素細胞則無法再現上述的實際皮膚組織的狀態。
[0003]另外，雀斑、斑點、黑痣這些皮膚色素沉著癥的產生要因或機理與由于紫外線導致黑色素生成增加不同，雖然存在由于紫外線照射而該癥狀會惡化的趨勢，但即使不存在紫外線等產生的刺激，黑色素的生成和分散也會繼續增加。由此，在基于現有的紫外線照射方法開發出的皮膚美白物質的情況下，在實際臨床上，大多無法展現出抑制人的皮膚色素沉著癥的效果。此外，如果為了研究皮膚色素沉著癥而對被檢測者的色素沉著部位處的皮膚進行活檢并使用，則費用和花費的精力非常大，并且很難得到人的皮膚組織，除此之外，與紫外線照射樣本不同，得到皮膚色素沉著癥的動物樣本也是很困難的。
[0004]因此，存在不僅與人的皮膚組織構造、特別是存在皮膚色素沉著癥的人的皮膚組織的構造非常近似、且可以簡單地篩選皮膚美白物質的系統及篩選方法的需求。
[0005]專利文獻1:韓國注冊專利第10 — 0840144號(2008年6月16日注冊)說明書。·
【發明內容】

[0006]本發明的一個方面在于，提供可以高效且簡單地篩選臨床上有用的皮膚美白物質的皮膚美白物質篩選系統及利用該系統的皮膚美白物質篩選方法。
[0007]本發明的另一方面在于，提供含有由所述皮膚美白物質篩選方法篩選出來的物質作為有效成分且示出優異的美白效果的皮膚美白用組合物。
[0008]另外，本發明的另一方面在于，提供含有與皮膚的黑色素生成相關的基因自身作為有效成分的皮膚美白用組合物或皮膚外用藥劑組合物。
[0009]本發明的一個方案在于，提供包括含有成纖維細胞(fibroblast)、角質形成細胞(keratinocyte)及黑素細胞(melanocyte)中的一種以上細胞的層的皮膚美白物質篩選系統，其中所述層多于或等于一層。
[0010]本發明的另一個方案在于，提供一種皮膚美白物質篩選方法，其在對候選物質進行處理后，還包括確認在成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上細胞中的WIFl、WNTl、WNT5a&NFATC2中的一種以上的表達的程度或磷酸化程度的步驟。
[0011 ] 本發明的另一個方案在于,提供含有由所述皮膚美白物質篩選方法篩選出來的物質作為有效成分的皮膚美白用組合物，或者含有WIFl自身作為有效成分的皮膚美白用組合物及皮膚外用藥劑組合物。
[0012]發明的效果
本發明所涉及的皮膚美白物質篩選系統由于設計為接近實際的皮膚組織，因此即使在離體(in vitro)狀態下，也可以以較少的時間和費用而簡單地篩選臨床上具有美白效果的物質。特別地，與將候選物質對黑素細胞進行處理后通過照射紫外線而篩選美白物質的現有方法不同，本發明所涉及的皮膚美白物質篩選系統具有與示出色素沉著癥的實際皮膚組織的基因表達程度及信息傳遞物質的磷酸化程度相類似的條件，因此，在利用本發明所涉及的系統的情況下，可以簡單地篩選出皮膚美白物質、特別是有效改善色素沉著癥的物質。從很難得到用于色素沉著癥研究的人及動物樣本這一點來說，本發明所涉及的系統能夠成為用于開發新的皮膚美白物質、具體地說開發色素沉著癥改善物質的系統或工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是對被檢測者的正常皮膚(N)和皮膚色素沉著部位(L)之間的WIFl基因的表達程度之差進行比較的圖。
[0014]圖2是對被檢測者的正常皮膚(N)和皮膚色素沉著部位(L)之間的WNTl及WNT5a的表達程度之差進行比較的圖。
[0015]圖3是對黑素細胞(MC)、角質形成細胞(KC)及成纖維細胞(FB)中的WIFl基因的表達程度之差進行比較的圖。
[0016]圖4表不在含有抑制WIFl表達的成纖維細胞的美白篩選系統中，酪氨酸酶(tyrosinase)的表達增加的情況。
[0017]圖5表示在含有抑制WIFl表達的成纖維細胞的美白篩選系統中，黑色素體的移動增加的情況。·
[0018]圖6表示在含有抑制WIFl表達的成纖維細胞的美白篩選系統中，NFATC2脫磷酸化的情況。
[0019]圖7是表示在含有抑制WIFl表達的角質形成細胞的美白篩選系統中，酪氨酸酶的表達增加的情況的實驗結果。
[0020]圖8表示在含有抑制WIFl表達的角質形成細胞的美白篩選系統中，黑色素體的移動增加的情況。
[0021]圖9表示在含有抑制WIFl表達的角質形成細胞的美白篩選系統中，NFATC2脫磷酸化的情況。
[0022]圖10表示對通過基因重組技術制造的人WIFl在黑素細胞中進行處理后，黑素細胞的WIFl表達增加的情況。
[0023]圖11表示在如圖10所示誘發了 WIFl表達的黑素細胞中，酪氨酸酶的表達減少的情況。
[0024]圖12表示在將通過基因重組技術制造的人WIFl在含有黑素細胞的美白篩選系統中進行處理后，黑色素體的移動減少的情況。
[0025]圖13表示在如圖10所示誘發了 WIFl表達的黑素細胞中，NFATC2發生磷酸化的情況。【具體實施方式】
[0026]在本說明書中，“皮膚”是指覆蓋動物體表的組織，不僅是指覆蓋面部或身體等體表的組織，是還包括頭皮及毛發在內的最廣義的概念。
[0027]皮膚的黑素細胞(melanocyte)是制造決定皮膚顏色的黑色素(melanin)的細胞，位于作為皮膚的真皮和表皮的邊界線起作用的基底膜上。從胚胎學角度可知，黑素細胞是如下所述分化而成的，即，從神經嵴細胞(neural-crest cells)起源，經由黑素細胞干細胞(Melanocyte stem cell)、作為前體細胞的成黑素細胞(melanoblast)而向皮膚移動，并最終分化為可以生成黑色素的色素細胞即黑素細胞。
[0028]如上所述分化后的黑素細胞并非在皮膚內單獨存在，而是受到與位于其上方的角質形成細胞即角質形成細胞的結合、以及位于下方的真皮中存在的成纖維細胞的影響而生成黑色素。由黑素細胞制造的黑色素，經由細胞樹突(dendrite)而向周邊的角質形成細胞移動，廣泛地分散在皮膚表面，從而保護皮膚不受到紫外線等有害因素影響，呈現皮膚顏色。正常皮膚在發生紫外線這種刺激時，與正常情況相比生成更多的黑色素，并增加黑色素的分散，然后，如果該刺激消失，則黑色素的生成和分散再次恢復較低水平。
[0029]如上述所示，通過現有方法開發出的美白物質，其中特別是基于紫外線照射方法開發出的皮膚美白物質，由于并沒有反應出實際皮膚條件，即黑素細胞在皮膚內受其它細胞們或周圍的微生境的物理化學因素的綜合影響而生成黑色素這一實際皮膚條件，所以在改善皮膚的色素沉著癥這一方面，大多展示出在臨床上較差的效果。由于皮膚色素沉著癥具有多種產生原因并由于特殊的機理而使皮膚黑化的，所以，為了開發可以有效改善皮膚色素沉著癥的美白物質，需要制作與實際皮膚類似的實驗模型，并利用該模型開發美白物質。
[0030]下面，詳細說明本發明。
[0031]本發明的一個方案在于，提供包括含有成纖維細胞(fibroblast)、角質形成細胞(keratinocyte)及黑素細胞(m·elanocyte)中的一種以上細胞的層的皮膚美白物質篩選系統，所述層多于或等于一層。本發明的另一個方案在于，提供一種包括含有成纖維細胞的成纖維細胞層、含有角質形成細胞的角質形成細胞層、及含有黑素細胞的黑素細胞層的皮膚美白物質篩選系統。此時，優選為了與實際皮膚條件類似而將成纖維細胞層層疊在最下層，在其上方層疊黑素細胞層，在黑素細胞層上方層疊角質形成細胞層。本發明的另一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選系統，包括含有成纖維細胞的成纖維細胞層、以及含有角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上細胞的層，可以在同一層中含有角質形成細胞及黑素細胞。此時，可以將成纖維細胞層層疊在下層，在其上方層疊含有黑素細胞和角質形成細胞的層。所述皮膚美白物質篩選系統是層疊有皮膚細胞層的三維立體構造的系統，不僅具有黑素細胞，還具有周邊的細胞，由此，可以正確反映實際的皮膚狀態。本發明的另一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選系統也可以去除成纖維細胞層，而包括含有已知對黑色素生成具有重要作用的黑素細胞和角質形成細胞在內的層。
[0032]本發明的一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選系統的成纖維細胞層，是用于再現真皮層的層，包括在膠原蛋白中含有成纖維細胞的層。具體地說，所述成纖維細胞層可以是在膠原蛋白液中放入成纖維細胞，進行凝結而制造成的層。在本發明的另一個方案中，所述膠原蛋白可以占皮膚美白物質篩選系統的整體重量中的0.001重量％~30重量％，優選0.01重量％~20重量％,更優選為0.1重量％~10重量％。在所述范圍內含有膠原蛋白的情況下，適于展示出本發明所希望的效果，從費用/效果比這一方面來說，在所述范圍中使用比較適當。
[0033]在本發明的一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選系統中，成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上的細胞包括從人、鼠、天竺鼠、雞等鳥類及豬中選擇的一種以上的動物中的細胞。
[0034]本發明的一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選系統，也可以不僅選擇具有皮膚美白效果的物質、具體地說具有改善由于紫外線導致皮膚黑化的效果的物質，還可以有效地篩選特別對雀斑、斑點、黑痣等皮膚色素沉著癥具有改善效果的物質。
[0035]本申請的發明人們發現，在出現色素沉著癥的皮膚中，與胚發育調節相關的細胞外信號傳遞因子即 WIFl (Wnt inhibitory factor I, ACCESSION NP _ 009122, VERSIONNP _ 009122.2 G1: 111125011)基因的表達減少，具體地說，WIFl基因的表達，在皮膚細胞中，并非在作為黑色素生成細胞的黑素細胞中減少，而是在角質形成細胞和成纖維細胞中減少，由此對黑素細胞的黑色素生成有影響。另外，在WIFl基因的表達減少的皮膚中，與黑色素生成相關的酪氨酸酶的表達增加的同時，黑色素向角質形成細胞的擴散增加，因此，確認了 WIFl與皮膚色素沉著癥之間存在密切關系。此時，確認到WIFl基因的表達干涉GSK-3 β (Glycogen synthasekinase-3 β )和 β -連環蛋白(β-catenin)的憐酸化、以及MITF (microphthalmia-associated transcription factor)的表達,對皮膚色素沉著有影響。
[0036]因此，本發明的一個方案提供抑制成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上細胞的WIFl表達的皮膚美白物質篩選系統，具體地說，提供抑制角質形成細胞或成纖維細胞的WIFl表達的皮膚美白物質篩選系統。在本發明的另一個方案中，所述皮膚美白物質篩選系統含有利用siRNA以抑制WIFl表達的細胞。所述篩選系統反映角質形成細胞或成纖維細胞中WIFl表達減少的色素沉著癥的皮膚狀態，能夠與實際情況大致類似地再現有色素沉著癥的皮膚狀態。·由此，在利用所述篩選系統的情況下，可以有效地選出具有皮膚美白功能的物質，特別可以選出具有改善皮膚色素沉著癥的功能的物質。
[0037]另外，本申請的發明人們確認到在出現色素沉著癥的皮膚中，原癌基因(proto-oncogene) 前體 WNTl (Wingless-type MMTV integration site family,member I, ACCESSION NP _ 005421, VERSION NP _ 005421.1 G1:4885655)及蛋白質 WNT5a (Wingless-type MMTV integration site family, member 5a, ACCESSIONNP _ 001243034, VERSION NP _ 001243034.1 G1: 371502087)基因的表達增加，作為信息傳遞物質的 NFATC2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic,calcineurin-dependent 2)脫磷酸化，因此，本發明的一個方案提供成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中一種以上的細胞為WNTl及WNT5a的表達增加了的細胞或NFATC2脫磷酸化了的細胞的皮膚美白物質篩選系統。所述篩選系統由于可以非常接近實際地再現出現色素沉著癥的皮膚狀態，所以可以有效地選出具有皮膚美白功能的物質，特別可以選出具有改善皮膚色素沉著癥的功能的物質。
[0038]在此之前，通過將天然物質、其提取物或化學合成物質等所謂候選物質僅對黑素細胞進行處理，從而評價是否存在美白效果。基于上述現有方法的情況下，必須將稀釋在細胞培養液中的候選物質對細胞進行直接處理，另外，在將候選物質制成霜或乳液這種實際使用的劑型的狀態下，無法對黑素細胞進行處理。由此，在現有的方法中，以實施臨床試驗后才能確認含有候選美白物質的劑型中是否具有臨床上的實際美白效果。與此相對，本發明所涉及的皮膚美白物質篩選系統當然可以如現有方法那樣，將候選物質稀釋在培養液中使用而評價其有無美白效果，也可以使用含有候選物質的霜或乳液等劑型評價其有無美白效果。此時，用于對劑型評價有無美白效果的皮膚美白物質篩選系統，可以是將含有成纖維細胞、黑素細胞及角質形成細胞中的一種以上的多個層進行層疊后，暴露在空氣中而制造成為人工皮膚。如上所述，本發明所涉及的皮膚美白篩選系統，由于具有與實際的皮膚類似的生理、化學特征，即使用實際使用的劑型也可以對其美白效果進行評價，因此，能夠在更短時間內，以較少的費用高效且簡單地選出在實際臨床上具有美白效果的物質。
[0039]本發明的一個方案提供一種皮膚美白物質篩選方法，其在對候選物質進行了處理的所述皮膚美白物質篩選系統中，包括確認在成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上細胞中的WIFl、WNTl、WNT5a&NFATC2中的一種以上的表達的程度或磷酸化程度的步驟。如前面所述，WIFl、WNTl、WNT5a及NFATC2都與皮膚的黑色素表達及擴散的程度有關。具體地說，WIFl的表達減少、WNTl或WNT5a的表達增加、或者NFATC2的脫磷酸化程度增加，意味著與黑色素生成有關的酶即酪氨酸酶的表達增加，黑色素向角質形成細胞的擴散增加。由此，通過確認候選物質對WIFl、WNT1、WNT5a及NFATC2中的一種以上的表達的程度或磷酸化的程度產生何種影響，可以評價所述候選物質是否具有皮膚美白效果。
[0040]本發明的一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選方法，也可以在確認WIFl表達的程度的步驟之后，還含有將使得WIFl表達的程度增加的物質判斷為皮膚美白物質的步驟。本發明的另一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選方法，也可以在確認WNTl或WNT5a表達的程度的步驟之后，還含有將使得WNTl或WNT5a表達的程度減少的物質判斷為皮膚美白物質的步驟。本發明的另一個方案所涉及的皮膚美白物質篩選方法，也可以在確認NFATC2的磷酸化程度的步驟之后，還含有將使得NFATC2的磷酸化程度增加的物質判斷為皮膚美白物質的步驟。特別地，由于含有WIFl的表達減少、或者WNTl或WNT5a的表達增加、或者NFATC2進行了脫磷酸化的成纖維細胞、黑素細胞及角質形成細胞中的一種以上細胞的皮膚美白物質篩選系統，再現了皮膚黑化·的實際皮膚條件，所以通過對候選物質使所述調整后的系統的WIFl、WNTl或WNT5a基因的表達程度或信息傳遞物質NFATC2的磷酸化程度以何種方式變化進行評價，可以確認候選物質是否為具有美白效果的物質，特別可以確認候選物質是否為可以改善皮膚色素沉著癥的物質。
[0041]本發明的一個方案提供作為有效成分而含有通過所述皮膚美白物質篩選方法篩選出的物質的皮膚美白用組合物。如前面所述，由于可以將使得成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上細胞中的WIFl的表達增加、或者WNTl或WNT5a的表達減少、或NFATC2的脫磷酸化的程度增加的物質，判斷為具有皮膚美白效果、具體地說具有皮膚色素沉著癥改善效果的物質，所以作為有效成分而含有該物質的組合物，能夠獲得皮膚美白效果、具體地說是皮膚色素沉著癥改善效果。
[0042]本發明的另一個方案，通過提供含有所述的本發明所涉及的基因即WIFl自身的美白用組合物或皮膚外用藥劑組合物，從而抑制WIFl的酪氨酸酶表達，抑制黑色素向角質形成細胞的擴散，從而能夠獲得皮膚美白及皮膚色素沉著癥改善效果。[0043]本發明的另一個方案所涉及的美白用組合物包括化妝品組合物、藥劑組合物及食品組合物。
[0044]對于本發明的一個方案所涉及的組合物的劑型例，在下面進行說明，但也可以應用其它各種劑型，這些例子并不限定本發明，僅用于進行具體說明。
[0045][制劑例I]營養化妝水
根據下述表1所記載的組成，使用通常方法制造營養化妝水。
[0046]【表1】
【權利要求】
1.一種皮膚美白物質篩選系統，其特征在于，包括含有成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上細胞的層，所述層多于或等于一層。
2.根據權利要求1所述的皮膚美白物質篩選系統，其特征在于，該皮膚美白物質篩選系統包括: 含有所述成纖維細胞的成纖維細胞層；以及 含有所述角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上的層。
3.根據權利要求2所述的皮膚美白物質篩選系統，其特征在于，所述成纖維細胞層是在膠原蛋白中含有成纖維細胞的層。
4.根據權利要求3所述的皮膚美白物質篩選系統，其特征在于，所述膠原蛋白占所述皮膚美白物質篩選系統的整體重量的0.0Ol重量％~30重量％。
5.根據權利要求1所述的皮膚美白物質篩選系統，其特征在于，所述成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上的細胞是WIFl (Wnt inhibitory factor I)的表達被抑制的細胞。
6.根據權利要求1所述的皮膚美白物質篩選系統，其特征在于，所述成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上的細胞是WNTl或WNT5a的表達增加后的細胞。
7.根據權利要求1所述的皮膚美白物質篩選系統，其特征在于，所述成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上的細胞是使NFATC2 (nuclear factor of activated Tcells, cytoplasmic 2)脫磷酸化后的細胞。
8.根據權利要求1所述的皮膚美白物質篩選系統，其中，所述成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上的細胞是來自于人、鼠、天竺鼠、雞等鳥類及豬中的一種以上的動物的細胞。
9.根據權利要求1所述的皮膚 美白物質篩選系統，其特征在于，皮膚美白物質含有改善皮膚的色素沉著癥的皮膚美白物質。
10.一種皮膚美白物質篩選方法，其特征在于，包括:在對候選物質進行處理后的權利要求I~9中任意一項所涉及的皮膚美白物質篩選系統中，對所述成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞中的一種以上的細胞中的WIFl、WNTl、WNT5a及NFATC2中的一種以上的表達的程度或磷酸化程度進行確認的步驟。
11.根據權利要求10所述的皮膚美白物質篩選方法，其特征在于，在確認表達程度或磷酸化程度的步驟之后，還含有將使得WIFl的表達程度增加的物質判斷為皮膚美白物質的步驟。
12.根據權利要求10所述的皮膚美白物質篩選方法，其特征在于，在確認表達程度或磷酸化程度的步驟之后，還含有將使得WNTl或WNT5a的表達程度減少的物質判斷為皮膚美白物質的步驟。
13.根據權利要求10所述的皮膚美白物質篩選方法，其特征在于，在確認表達程度或磷酸化程度的步驟之后，還含有將使得NFATC2的磷酸化程度增加的物質判斷為皮膚美白物質的步驟。
14.一種皮膚美白用組合物,其特征在于,含有由權利要求10所記載的篩選方法篩選出的物質作為有效成分。
15.一種皮膚美白用組合物，其特征在于，作為有效成分而含有WIFl。
16.一種皮膚外用藥劑組合物，其特征在于，作為有效成分而含有WIFl。
17.根據權利要求15·或16所述的組合物，其特征在于，所述組合物為化妝品組合物。
【文檔編號】A61K31/7088GK103857802SQ201280051510
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年10月18日 優先權日:2011年10月18日
【發明者】李愛榮, 李泰龍, 崔賢貞 申請人:株式會社愛茉莉太平洋, 東國大學校產學協力團