用于改善重構后純化的因子viii的穩定性的方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期間自始至終防止將因子VIII分子經蛋白酶剪切成基本上包含A1結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、C1結構域和C2結構域的第二片段。本發明還涉及用于改善靜脈內和非靜脈內注射后因子VIII的生物利用率的方法。
【專利說明】用于改善重構后純化的因子Vl I I的穩定性的方法
[0001]本發明涉及一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期間自始至終防止將因子VIII分子經蛋白酶剪切成基本上包含Al結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、Cl結構域和C2結構域的第二片段。本發明還涉及用于改善靜脈內和非靜脈內注射后因子VIII的生物利用率的方法。
【背景技術】
[0002]經典的血友病或血友病A是一種遺傳性出血障礙。它因染色體X連鎖的凝血因子VIII缺陷所致，并且幾乎排他地侵襲男性，發病率為每10，000人在一位和兩位個體之間。X-染色體缺陷由本身不是血友病患者的女性攜帶者傳遞。血友病A的臨床表現是增加的出血傾向性。在引入因子VIII濃縮物治療之前，患有嚴重血友病的人的平均壽命短于20年。使用來自血漿的因子VIII的濃縮物已經明顯地改善血友病患者的狀況，廣泛地增加平均壽命，給予大部分患者過上或多或少正常生活的可能性。然而，伴隨血漿衍生的濃縮物和它們的使用，存在某些問題，其中最嚴重的問題是傳播病毒。迄今，造成AIDS、乙型肝炎和非甲非乙肝炎的病毒已經嚴重襲擊該群體。從那時起，已經新近開發了不同的病毒滅活方法和新的高度純化的因子VIII濃縮物，它們還對血漿衍生的因子VIII建立了極高的安全性標準。
[0003]幾種重組和血漿衍生的治療性多肽，例如凝血因子，可商業獲得用于人類中的治療性和預防性使用。FVIII是一種在哺乳動物肝臟中產生的分子量直到約280kDa的血漿糖蛋白。它是導致凝血的凝血反應級聯的關鍵組分。在這個級聯內部存在其中因子IXa(FIXa)連同激活的因子VIII (FVIIIa) —起使因子X(FX)轉化成激活形式FXa的步驟。FVIIIa在這個步驟充當輔因子，與鈣離子和磷脂是最大化FIXa活性所要求的。
[0004]治療血友病A方面的一項重要進展是分離了編碼2，351個氨基酸的人FVIII完整序列的cDNA克隆(美國專利號4，757, 006)和提供人FVIII基因DNA序列及用于其生產的重組方法。
[0005]將因子VIII合成為具有分子量約280kDa的單條多肽鏈。當因子VIII轉運入內質網時，移除氨基端信號肽，并且成熟(即切除信號肽后)天然因子VIII分子隨后在其分泌過程中在第1313和1648位氨基酸殘基后以蛋白酶解方式被切割。這導致釋放異二聚體，所述異二聚體由按金屬離子依賴性方式與約160-200kDa N端重鏈片段締合的約80kDaC 端輕鏈組成。(綜述見 Kaufman, Transfusion Med.Revs.6:235 (1992)) ?
[0006]通過凝血酶對蛋白質鏈的蛋白酶切割，該異二聚體的生理激活發生。凝血酶將重鏈切割成90kDa蛋白質并隨后切割成54kDa和44kDa片段。凝血酶還將80kDa輕鏈切割成72kDa蛋白質。正是后一種蛋白質和由鈣離子結合在一起的兩個重鏈片段(上文54kDa和44kDa片段)才構成活性FVIII。當44kDa A2重鏈片段從該分子解離或當72kDa和54kDa蛋白質由凝血酶、活化的蛋白C或FXa進一步切割時，失活發生。在血漿中，FVIII通過與50倍摩爾過量的VWF蛋白(“VWF”)締合穩定，所述VWF蛋白似乎抑制蛋白酶解性破壞如上文所述的FVIII。
[0007]FVIII的氨基酸序列組織成三個結構域:330個氨基酸的三重A結構域、980個氨基酸的單個B結構域和150個氨基酸的重復C結構域。B結構域與其他蛋白質沒有同源性并且提供這種蛋白質的25個潛在天冬酰胺(N)聯糖基化位點中的18個。B結構域在凝血中明顯沒有功能并且可以缺失，而B-結構域缺失的FVIII分子仍具有促凝血活性。
[0008]市場上的因子VIII產品目前作為因子VIII凍干制劑提供或者通過重組技術產生或從匯集的血漿純化。凍干產品在施用之前重構。一旦重構，因子VIII的貨架期相對短暫。因子VIII是相對不穩定的蛋白質，特別在水溶液中。已經描述在制造和儲存期間通過與其他血漿蛋白復合、特別與血管性血友病因子(VWF)和白蛋白復合的穩定化作用見，例如，美國專利號6，228，613。美國專利號5，565，427公開了包含一個氨基酸的因子VIII或其鹽或同源物之一及去垢劑或有機聚合物如聚乙二醇的穩定化制劑。美國專利號5，605，884公開了在氯化鈣和高濃度氯化鈉或氯化鉀存在的情況下因子VIII在基于組氨酸緩沖液的高離子強度介質中的穩定化制劑。這類組合物顯示顯著地改善重構后含水形式的因子VIII的穩定性。通常認可了鈣離子在因子VIII制劑中的重要性。根據美國專利號6，599，724，其他二價陽離子即Cu2+和Zn2+的存在，任選地在Ca2+離子或Mn2+離子存在的情況下，改善因子VIII的穩定性。W02011/027152A1還描述了包含各種添加物的穩定的含水因子VIII組合物。
[0009]考慮到凍干物重構后因子VIII的短貨架期，需要增加重構的因子VIII在水溶液中穩定性的方法。出于不同原因，提供在液相具有增加的穩定性的純化FVIII制備物是合乎需要的。首先，優點是在環境溫度具有支持在環境溫度制造純化FVIII產物的足夠時間跨度。具體而言，填充步驟需要儲存某種液體散貨以增加制造靈活性。其次，如果產品不能在重構后直接施加，液態的純化FVIII的穩定性增加將對醫師和患者而言是有優勢的。并且最終，在連續輸注條 件下例如在住院患者中手術時使用FVIII取決于重構后優選高的產物穩定性(Takedani H.，HaemophiIia2010，16:740-746)。具有增加的穩定性的FVIII分子還將有利于開發適于液態條件下長期儲存的FVIII制備物。
[0010]本申請的發明人令人驚訝地發現凍干物重構后純化因子VIII的穩定性在單鏈因子VIII構建體中實質地增強。這類構建體可以通過阻止蛋白酶剪切獲得，所述蛋白酶剪切一般在因子VIII分泌之前出現在高爾基體區室中。單鏈構建體在純化后在溶液中顯示更好的穩定性/或當皮下施用時顯示更好的生物利用率。
[0011]發明簡述
[0012]在第一方面，本發明涉及一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括防止將因子VIII分子經蛋白酶剪切成基本上包含Al結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、Cl結構域和C2結構域的第二片段。
[0013]第一方面涵蓋一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期間自始至終防止將因子VIII分子經蛋白酶剪切成基本上包含Al結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、Cl結構域和C2結構域的第二片段。
[0014]第一方面進一步涵蓋一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括在純化因子VIII分子之前防止將因子VIII分子經蛋白酶剪切成基本上包含Al結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、Cl結構域和C2結構域的第二片段。
[0015]就本發明的這些方法而言，術語“在制造因子VIII分子期間自始至終”和“在純化因子VIII分子之前”意指本發明的方法防止將因子VIII切割成基本上包含Al結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、Cl結構域和C2結構域的第二片段，但是本發明的方法不阻止可以在施用重構的因子VIII分子后發生的因子VIII活化切割。通過本發明方法產生的因子VIII分子仍可以由凝血酶活化，所述凝血酶在Arg372、Arg740和Argl689后切割因子VIII分子。
[0016]在第二方面，本發明涉及一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括失活在表達因子VIII分子的宿主細胞分泌所述因子VIII分子期間被切割的蛋白酶剪切位點，例外是信號序列和成熟因子VIII之間的切割位點。一般，至少50%由宿主細胞表達并分泌的因子VIII分子是單鏈因子VIII分子。優選地，至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%由宿主細胞表達并分泌的因子VIII分子是單鏈因子VIII分子。[0017]優選地，該方法包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點并且如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點?？梢酝ㄟ^缺失蛋白酶識別序列的一個或多個殘基實現蛋白酶剪切位點的失活。例如，失活步驟可以包含從因子VIII序列缺失至少Argl648。在一個實施方案中，失活步驟包括從因子VI11序列缺失至少從Argl313至Argl648的氨基酸序列。
[0018]在本發明第一方面的另一個實施方案中，通過置換形成蛋白酶識別序列的一個或多個氨基酸殘基實現蛋白酶剪切位點的失活。
[0019]在又一個實施方案中(涉及保留包含Argl313的B-結構域部分的那些FVIII變體)，該方法進一步包括通過缺失或置換形成蛋白酶識別序列的一個或多個殘基失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。在一個特別優選的實施方案中，該方法包括缺失來自因子VIII氨基酸序列的在殘基Argl313和Argl648后包含兩個蛋白酶切割位點的至少部分。
[0020]進一步優選的是，選自因子VIII序列第741至1647位置處氨基酸的第一氨基酸與選自因子VIII序列第1649至1690位置處氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點和如果存在于FVIII分子中，Argl313和Alal314之間的切割位點失活。
[0021]在另一個優選實施方案中，根據本發明第一或第二方面穩定化的因子VIII分子顯示在水溶液中增加的穩定性。在水溶液中在25°C儲存7日后，修飾的因子VIII分子的活性喪失優選地是小于15%。
[0022]在另一個優選實施方案中，根據本發明第一或第二方面穩定化的因子VIII分子顯示重構后在水溶液中增加的穩定性。
[0023]在又一個優選的實施方案中，以相同劑量和以相同方式施用時，與人野生型因子VIII的生物利用率相比或與其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子相比，根據本發明第一或第二方面穩定化的因子VIII分子顯示非靜脈內注射后增加的生物利用率。在又一個優選的實施方案中，以相同劑量和以相同方式施用時，與其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，根據本發明第一或第二方面穩定化的因子VIII分子顯示非靜脈內注射后增加的生物利用率。分別以相同劑量和以相同方式施用時，與人野生型因子VIII的生物利用率或其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，修飾的FVIII的生物利用率優選地增加至少25%。在另一個優選實施方案中，非靜脈內注射是皮下、經皮或肌內注射。
[0024]另一個優選實施方案是一種方法，其中(i)相對于人野生型因子VIII，該因子VIII顯示出靜脈內施用后改善的血漿半壽期；優選地其中相對于人野生型因子VIII，血漿半壽期改善至少40%，或(ii)其中相對于人野生型因子VIII，該因子VIII顯示靜脈內施用后在血友病A小鼠中隨時間推移如凝血酶生成測定法中所測定的凝血酶峰水平降至50nM以下的更長時間段；優選地其中相對于人野生型因子VIII，這個時間段延長至少10個小時，或(iii)其中相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，因子VIII在已經在37°C于人血漿中溫育4日后保留如通過一步FVII1: C測定法所測定的更高活性；優選地其中相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII的活性，保留的因子VIII活性是至少10%更高。
[0025]該方法還可以包括步驟
[0026]⑴提供核酸，所述核酸編碼其中Argl648和Glul649之間以及Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點失活的修飾的因子VIII分子，
[0027](ii)用所述核酸轉化宿主細胞，
[0028](iii)在如此條件下培養轉化的宿主細胞，從而表達修飾的因子VIII分子，并且
[0029](iv)從宿主細胞或從培養基回收修飾的因子VIII分子。
[0030]在另一個方面，本發明涉及一種改善因子VIII分子在非靜脈內施用后的生物利用率的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之間的蛋白酶剪切位點，和如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。優選地，非靜脈內注射是皮下注射。分別以相同劑量和以相同方式施用時，與人野生型因子VIII的生物利用率或其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，皮下注射后的生物利用率優選地增加至少25%。
[0031]在另一個方面，本發明涉及一種相對于人野生型因子VIII，改善因子VIII分子在靜脈內施用后的血漿半壽期的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點，并且如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
[0032]在另一個方面，本發明涉及一種相對于人野生型因子VIII，延長靜脈內施用后在血友病A小鼠中隨時間推移如凝血酶生成測定法中所測定的凝血酶峰水平降至50nM以下的時間段的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之間的蛋白酶剪切位點，和如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
[0033]在另一個方面，本發明涉及一種相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，保留在已經在37°C于人血漿中溫育4日后如通過一步FVII1:C測定法所測定的因子VIII分子更高活性的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點，并且如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。[0034]上文所述方法的一個優選實施方案是這些方法，其中選自因子VIII序列第741至1647位置處氨基酸的第一氨基酸與選自因子VIII序列第1649至1690位置處氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點和如果存在于FVIII分子中，Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點失活。
[0035]已作必要修正的情況下，不同方面的優選實施方案是適用的。
[0036]在又一個方面，本發明涉及一種包含單鏈因子VIII分子的藥物制品，用于通過以下方式治療或預防出血障礙、優選地血友病A:(i)在一方面，非靜脈內施用，其中以相同劑量和以相同方式施用時，與人野生型因子VIII相比或與其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子相比，所述單鏈因子VIII分子的生物利用率增加至少25%，或(ii)在另一方面，靜脈內施用，其中(a)以相同劑量和以相同方式施用時，相對于人野生型因子VIII，所述單鏈因子VIII分子在靜脈內施用后的血漿半壽期增加至少40%、或(b)以相同劑量和以相同方式施用，相對于人野生型因子VIII，單鏈因子VIII分子顯示出靜脈內施用后在血友病A小鼠中隨時間推移如凝血酶生成測定法中所測定的凝血酶峰水平降至50nM以下的時間段延長至少10小時。
[0037]在又一個方面，本發明涉及一種包含單鏈因子VIII分子的藥物制品，用于治療或預防出血障礙、優選地血友病A，其中相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，單鏈因子VIII分子在已經在37°C于人血漿中溫育4日后保留如通過一步FVIIIiC測定法所測定的至少10%更高活性。
[0038]在又一個方面，本發明涉及一種包含單鏈因子VIII分子的藥物制品，用于通過非靜脈內施用治療或預防出血障礙、優選地血友病A，其中以相同劑量和以相同方式施用以實現血液中相同的止血 活性時，與其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子的劑量相比，所述FVIII分子的劑量可以降低至少25%。
[0039]在另一個方面，本發明涉及單鏈因子VIII分子用于實現重構后增加的穩定性或用于治療出血障礙的藥物制品的更長貨架期的用途，其中(i)在重構并且重構后室溫儲存7日之后，包含單鏈因子VIII分子的藥物制品的因子VIII活性高于包含相同量其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子的藥物制品至少10%，或(ii)其中相對于相同濃度的已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，單鏈因子VIII分子在37°C于人血漿中溫育4日時保留如通過一步FVII1: C測定法所測定的至少10%更高活性。
[0040]附圖簡述
[0041]圖1描述實施例1的結果。各種因子VIII分子已經作為水溶液提供，并且已經在
7日時間段范圍內監測它們的穩定性。與異二聚(雙鏈)全長因子viii分子(Beriate?:
和Hellxatee:)并與B-結構域缺失的異二聚(雙鏈)構建體(ReFacto?；)相比，對于單鏈因子VIII分子而言，儲存7日后的活性喪失小得多。
[0042]圖2描述實施例2的結果。將多種凍干的因子VIII制備物重構成水溶液，并且并且已經在7日時間段范圍內監測它們的穩定性。與異二聚(雙鏈)全長因子VIII分子
(Advate。)和B-結構域缺失的異_.聚(雙鏈)構建體(RePacto )相比，對于單鏈因子VIII分子而言，儲存7日后的活性喪失小得多。[0043]圖3描述實施例3的結果。三種不同的因子VIII分子已經在小鼠中皮下注射并且已經如實施例2中所述測定它們的生物利用率。單鏈因子VIII分子的生物利用率實
質地高于雙鏈和全長因子viii (Advatee)或B-結構域缺失的異二聚(雙鏈)構建體(ReFacto?；)。
[0044]圖4描述實施例4的結果。將本發明的因子VIII分子和二種商業可獲得的FVIII制品在純化、凍干和重構后在37°C溫育。將FVII1-樣品在37°C溫育不同的時間段(O、0.25、
1、2、4和8日)并且通過一步凝血測定法確定FVII1:C活性。顯示的值代表兩份樣品的均值和標準偏差(例外是0.25日，僅一份樣品)。
[0045]圖5描述實施例5的部分結果。在以劑量250IU/kg單次靜脈內注射至食蟹猴后，確定 scFVIII 和全長rFVIII (AdVilt't1' Baxter Healthcare)的藥物代謝動力學(PK)曲線。
[0046]圖6描述實施例5的部分結果。在以劑量100IU/kg單次靜脈內注射至血友病A小鼠后，確定全長rFVIII(AdYiUe?, Baxter Healthcare)的藥物代謝動力學(PK)曲線。
[0047]圖7描述實施例6的部分結果。在scFVIII或全長rFVIII ( Advated〗.)，BaxterHealthcare)以劑量250IU/kg施用至血友病A小鼠后確定從第I日-第8日的平均峰凝血酶水平。
[0048]圖8描述實施例7的結果。以劑量100IU/kg單次靜脈內注射至VWF缺陷小鼠后確定全長rFVIII ( Advate*? Baxter Healthcare)和B-結構域缺失的因子
VIIK RcractOi, Pfizer)的藥物代謝動力學(PK)曲線。
[0049]發明詳述
[0050]本發明涉及用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括防止將因子VIII分子經蛋白酶剪切成基本上包含Al結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、Cl結構域和C2結構域的第二片段。
[0051]本發明還涉及一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包含失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點和如果存在于因子VIII分子中，任選地失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
[0052]因子VIII
[0053]術語“凝血因子VIII) ”、“因子VIII”和“FVIII”在本文中互換地使用。成熟人因子VIII由布置在以下結構域結構中的2332個氨基酸組成:
[0054]
【權利要求】
1.一種用于增加因子VIII分子在純化、凍干和重構后的穩定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期間自始至終防止將因子VIII分子經蛋白酶剪切成基本上包含Al結構域和A2結構域的第一片段和基本上包含A3結構域、Cl結構域和C2結構域的第二片段。
2.根據權利要求1所述的方法，包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點，并且，如果存在于所述FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
3.根據權利要求2所述的方法，其中失活步驟包括從因子VIII序列缺失至少Argl6480
4.根據權利要求3所述的方法，其中失活步驟包括從因子VIII序列缺失至少從Argl313至Argl648的氨基酸序列。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中選自因子VIII序列第741至1647位置處氨基酸的第一氨基酸與選自因子VIII序列第1649至1690位置處氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點失活，并且，如果存在于所述FVIII分子中，Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點失活。
6.根據權利要求3至5中任一項所述的方法，其中將缺失的氨基酸替換為具有I至50個氨基酸長度的肽間隔序列。
7.根據權利要求2所述的方法，其中失活步驟包括將Argl648和如果存在于因子VIII分子中的Argl313置換為不同的氨基酸。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中在水溶液中重構并在25°C儲存7日后，所述因子VIII分子的活性喪失小于15%。
9.根據權利要求2至8中任一項所述的方法，其中在水溶液中重構后，所述因子VIII的體外穩定性因所述切割位點的失活而增加。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中以相同劑量和以相同方式施用時，相對于人野生型因子VIII或相對于其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的人因子VIII分子，所述因子VIII顯示出非靜脈內注射后改善的生物利用率；優選地其中以相同劑量和以相同方式施用時，相對于人野生型因子VIII或相對于其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的人因子VIII分子，非靜脈內注射后的生物利用率增加至少25%。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述非靜脈內注射是皮下、經皮或肌內注射。
12.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中 (i)相對于人野生型因子VIII，所述因子VIII顯示出靜脈內施用后改善的血漿半壽期；優選地其中相對于人野生型因子VIII，血漿半壽期改善至少40%， 或 (ii)其中相對于人野生型因子VIII，所述因子VIII顯示靜脈內施用后在血友病A小鼠中隨時間推移如凝血酶生成測定法中所測定的凝血酶峰水平降至50nM以下的更長時間段；優選地其中相對于人野生型因子VIII，這個時間段延長至少10個小時， 或 (iii)其中相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，所述因子VIII在已經在370C于人血漿中溫育4日后保留如通過一步FVII1: C測定法所測定的更高活性；優選地其中相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII的活性，所述因子VIII所保留的活性是至少10%更高。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，包括步驟 (i)提供核酸，所述核酸編碼其中使Argl648和Glul649之間以及Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點失活的修飾的因子VIII分子， (ii)用所述核酸轉化宿主細胞， (iii)在如此條件下培養轉化的宿主細胞，從而表達修飾的因子VIII分子，并且 (iv)從宿主細胞或從細胞培養基回收修飾的因子VIII分子。
14.一種相對于人野生型因子VIII或相對于其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子,改善因子VIII分子在非靜脈內施用后的生物利用率的方法,包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點，和如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述非靜脈內施用是皮下、經皮或肌內注射。
16.一種相對于人野生型因子VIII，改善因子VIII分子在靜脈內施用后的血漿半壽期的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
17.一種相對于人野生型因子VIII，延長靜脈內施用后在血友病A小鼠中隨時間推移如凝血酶生成測定法中所測定的凝血酶峰水平降至50nM以下的時間段的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
18.一種相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，保留在已經在37°C于人血漿中溫育4日后如通過一步FVIII = C測定法所測定的因子VIII分子更高活性的方法，所述方法包括失活Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點。
19.根據權利要求14至18所述的方法，其中選自因子VIII序列第741至1647位置處氨基酸的第一氨基酸與選自因子VIII序列第1649至1690位置處氨基酸的第二氨基酸融合，因而Argl648和Glul649之間的蛋白酶剪切位點失活，并且，如果存在于FVIII分子中，Argl313和Alal314之間的蛋白酶剪切位點失活。
20.一種包含單鏈因子VIII分子的藥物制品，用于通過以下方式治療或預防出血障礙、優選地血友病A， (i)非靜脈內施用，其中 以相同劑量和以相同方式施用時，與人野生型因子VIII相比或與其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的人因子VIII分子相比，所述單鏈因子VIII分子的生物利用率增加至少25%， 或 (ii)靜脈內施用，其中 (a)以相同劑量和以相同方式施用時，相對于人野生型因子VIII，所述單鏈因子VIII分子在靜脈內施用后的血漿半壽期增加至少40%， 或 (b)以相同劑量和以相同方式施用，相對于人野生型因子VIII，單鏈因子VIII分子顯示出靜脈內施用后在血友病A小鼠中隨時間推移如凝血酶生成測定法中所測定的凝血酶峰水平降至50nM以下的時間段延長至少10小時。
21.一種包含單鏈因子VIII分子的藥物制品，用于治療或預防出血障礙、優選地血友病A，其中相對于已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，單鏈因子VIII分子在已經在37°C于人血漿中溫育4日后保留如通過一步FVII1:C測定法所測定的至少10%更高活性。
22.一種包含單鏈因子VIII分子的藥物溶液，用于通過非靜脈內施用治療或預防出血障礙、優選地血友病A，其中以相同劑量和以相同方式施用以實現血液中相同的止血活性時，與其中Asn745與Pro 1640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子的劑量相比，所述FVIII分子的劑量可以降低至少25%。
23.單鏈因子VIII分子用于實現重構后增加的穩定性或用于治療出血障礙的藥物制品的更長貨架期的用途，其中 (i)在重構并且重構后室溫儲存7日之后，包含單鏈因子VIII分子的藥物制品的因子VIII活性高于包含相同量其中Asn745與Prol640融合的B-結構域缺失的因子VIII分子的藥物制品至少10%，或 (ii)其中相對于相同濃度的已經在37°C于人血漿中溫育4日后的人野生型因子VIII，單鏈因子VIII分子在37°C于人血漿中溫育4日時保留如通過一步FVIII = C測定法所測定的至少10%更高活性。
【文檔編號】A61K38/37GK103917554SQ201280051574
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年10月18日 優先權日:2011年10月18日
【發明者】C·霍恩, S·措爾納, H·梅茨納, S·舒爾特 申請人:Csl有限公司