藥物制劑和其用于治療花生過敏的用途
【專利摘要】本發明涉及可以用于免疫治療的組合物，且特別涉及可用于經受花生過敏的哺乳類，例如人類哺乳類的免疫治療的組合物。本發明還涉及本組合物用于通過免疫治療使經受過敏的哺乳類的免疫系統脫敏的治療性治療的用途，和本組合物用于在對發展某種過敏有高度傾向的哺乳類中的預防性治療的用途。特別地，本發明涉及包括改性的完整全花生提取物和藥學上可接受的稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物，其中所述改性的全花生提取物是還原且隨后烷基化的全花生提取物，優選包括可溶性花生仁蛋白質如Ara?h1、Ara?h2和Ara?h6的脫脂全花生提取物。
【專利說明】藥物制劑和其用于治療花生過敏的用途
[0001] 本發明涉及藥物制劑、或組合物，其可以在免疫治療中使用，并特別涉及可用于對 經受花生過敏的哺乳類，例如人類哺乳類的免疫治療的制劑或組合物。本發明還涉及本制 劑或組合物用于通過免疫治療使經受過敏的哺乳類的免疫系統脫敏的治療性治療的用途， 和本制劑或組合物用于在對發展某種過敏有高度傾向的哺乳類的預防性治療的用途。
[0002] 過敏原免疫治療，也稱為低敏治療、免疫脫敏、低敏（hyposensibilization)、或過 敏原特異性免疫治療，是用于過敏疾患的一種免疫治療形式，其中患者被接種越來越大劑 量的過敏原，即他們對其過敏的物質或多種物質，旨在誘導免疫耐受性。
[0003] 過敏原特異性免疫治療是治療過敏疾患的根本原因的唯一治療策略。這是極具成 本效益的治療策略，并導致改善的生活質量。
[0004] 免疫治療已被證明產生過敏癥狀的長期緩解、減少相關的過敏應答的嚴重程度、 以及減少對過敏原的新的致敏的發展機會。免疫治療旨在調節免疫系統對過敏原的應答。
[0005] 免疫治療通常涵蓋經由例如舌下或皮下途徑重復暴露于特定過敏原，從而提供過 敏患者對過敏原的脫敏，并因此減少過敏癥狀和用于基于癥狀的治療。
[0006] 免疫治療潛在的確切機制不完全清楚，但被接受的是免疫治療導致對過敏原的免 疫應答的改變。改變至少包括IgE合成的變化，和減少免疫系統對特定過敏原的過敏應答 的IgE阻斷抗體的產生。還觀察到Th2向Thl/T調節細胞轉化的增加。在分子水平上，部分 潛在機制依賴于過敏原特異性IgG的優先誘導以中和過敏原及過敏原特異性IgE的減少。
[0007] 免疫治療通常涉及使過敏患者暴露至低劑量的過敏原。劑量定期例如每周逐漸增 力口，直到達到"維持"劑量。這相當于在約4個月中每周一次注射以達到維持劑量。一旦達 到維持劑量，施用注射較少，例如每月一次持續幾年。通常，治療越長和劑量越高，治療收益 越大。
[0008] 成功完成免疫治療后，可以預期3至5年或更長時間段的長期保護。如果癥狀開 始復發，或如果個體發生暴露于未包括在先前治療方案中的新的過敏原，治療可重復進行。
[0009] 花生是造成食物誘導的過敏的最常見的食物之一。花生過敏的根治性治療尚未獲 得。使用花生水提取物（aqueous peanut extract)的特異性免疫治療（SIT)顯示對經口攝 入的花生的增加的耐受性。然而，如由Nelson等人（J. Allergy Clin. Immunol. 1997June ; 99 (6Ptl) :744-51)報道的，花生水提取物導致不可接受的全身反應，甚至在維持注射期。因 此，Nelson等人得出結論："對于這種治療方法的臨床應用，需要改性的花生提取物。"
[0010] 花生過敏的主要過敏原是花生種子C藏蛋白Ara hi (豌豆球蛋白）和Ara h2 (羽扇 豆球蛋白）。在最近的研究（Mov6rare 等人，Int Arch Allergy Immunol ;2011 ;第 282-290 頁）中，患有疑似花生過敏的大部分年輕的成年人具有針對Ara hi和Ara h2的IgE抗體。 除了這些主要過敏原，還報道了 IgE針對其它花生仁蛋白質例如Arah6的反應性。
[0011] 已經描述花生過敏原Ara h2和Ara h6通過還原和烷基化的方法的改性提供這些 致敏蛋白質的低致敏形式。低致敏性可通過固相免疫測定中減少的IgE結合，或通過激活 效應細胞，如嗜堿性粒細胞顯示。然而，過敏原Ara h2和Ara h6不包括在花生中發現的所 有的過敏原，且僅基于Ara h2和Ara h6,因此沒有其它花生過敏原的免疫治療或免疫接種， 很可能不足以（預防地）治療花生過敏的個體或使其脫敏。
[0012] 還原和烷基化不可逆地裂解蛋白質中的二硫鍵。Ara h2具有4個二硫鍵且Ara h6 具有6個二硫鍵。已表明，還原和烷基化引起Ara h2和Ara h6的二級結構的重大變化，導 致IgE結合損失和效應細胞的激活。然而，考慮到Ara h2以及在較小程度上的Ara h6僅形 成花生過敏致病因素的一部分，僅有Ara h2和Ara h6可能不足以治療花生過敏的個體。
[0013] 除了其它目標以外，本發明的一個目標是提供藥物組合物或制劑，用于花生過敏 的治療性或預防性治療。換言之，除了其它目標以外，本發明的一個目標是提供藥物組合物 或制劑，用于使患者對花生，或更具體地花生過敏原的脫敏。
[0014] 除了其它目標以外，這些目標通過如所附權利要求中限定的藥物組合物實現。
[0015] 具體地，根據第一方面，除了其它目標以外，這些目標，通過包括改性的全花生提 取物（modified whole peanut extract)和藥學上可接受的稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合 物實現，其中所述改性的全花生提取物是還原且隨后烷基化的全花生提取物。
[0016] 在本發明的上下文中，過敏原被定義為能夠通過免疫球蛋白E(IgE)的應答刺激 特應性哺乳類中的超敏反應的抗原。大多數哺乳類僅作為針對寄生蟲感染的防御發動顯著 免疫球蛋白E應答。然而，一些哺乳類可以對許多普通的環境抗原響應。此遺傳傾向也被命 名為特應性。在特應性哺乳類中，非寄生蟲抗原刺激不希望的IgE產生，導致超敏或過敏。
[0017] 在本發明的上下文中，全花生提取物是指包括花生中發現的基本上所有的種仁蛋 白質的花生提取物。換句話說，根據本發明的全花生提取物代表花生中發現的蛋白質，并從 而代表花生過敏的致病因素（過敏原）。因此，除了 Ara h2和Ara h6,根據本發明的全花生 提取物還包括其它花生過敏原，其中主要的花生過敏原是Ara h 1。
[0018] 根據本發明，本全花生提取物通過還原與烷基化來改性，因此存在于全花生提取 物的蛋白質中的二硫鍵斷裂，隨后為烷基化，導致包括二硫鍵的蛋白質的二級結構中的不 可逆變化，并從而破壞這些蛋白質中引起IgE過敏反應的表位。
[0019] 還原二硫鍵的合適的劑（agent)是已知的且可以是，例如，2-巰基乙醇（β -ME)、 二硫蘇糖醇（DTT)、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、高半胱氨酸、三丁基膦、亞硫酸鹽、三（2-羧乙 基）膦（TCEP)、（氰基）硼氫化鈉、堿液、谷胱甘肽、E-巰基乙胺、巰基乙酸、甲硫醚或乙硫 醚。
[0020] 烷基化還原的半胱氨酸殘基的合適的劑是已知的且可以是，例如，是N-乙基馬來 酰亞胺、胱胺、碘乙酰胺、碘乙酸、烷基鹵化物、烷基硫酸鹽（alkylsulfate)、烯烴、或酶。
[0021] 考慮到相比Ara h2和Ara h6，Ara hi不包括二硫鍵，只有單一 Cys殘基，使包括主 要過敏蛋白質Ara hi的全花生提取物經受還原和甲基化從而減少其致敏性是令人驚訝的。 因此，Ara hi的還原和烷基化預期不會導致二級結構的變化和伴隨全花生提取物的IgE結 合損失和效應細胞的激活。盡管這樣，特別是考慮到Ara hi是主要的花生過敏原，本發明人 驚奇地發現，還原和烷基化對Ara hi有作用，且從而對改性的花生提取物的致敏性有作用。
[0022] 根據本發明該第一方面的優選的實施方案，本全花生提取物在使花生提取物經受 還原和烷基化之前被脫脂。除去脂類和其它脂肪物質增加了提取物中的蛋白質含量，并從 而增加了免疫原性IgE表位的相對數量，且從而增加了提取物的致敏性。
[0023] 根據本發明該第一方面的又另一個優選的實施方案，本全花生提取物包括可溶性 花生仁蛋白質，更優選包括至少Ara hi、Ara h2和Ara h6。可溶性花生仁蛋白質代表花生蛋 白質Ara hl、Ara h2和Ara h6的大多數，即便不是全部過敏原原因表位（allergen causing epitope)〇
[0024] 根據本發明該第一方面的特別優選的實施方案，本全花生提取物是通過以下可獲 得的：
[0025] a)研磨花生以提供花生粉；
[0026] b)使用每50ml丙酮5克花生粉在丙酮中孵育所述花生30分鐘，以提供脫脂的花 生粉；
[0027] c)干燥所述脫脂的花生粉；
[0028] d)在具有在7和9之間的pH的緩沖液中懸浮所述干燥的花生粉；及
[0029] e)分離步驟（d)得到的上清液，從而提供全花生提取物。
[0030] 上述方法提供了可溶性花生過敏原蛋白質的純化提取物，即富集可溶性花生仁蛋 白質的提取物，其可以容易地經受隨后的還原和烷基化。
[0031] 根據本發明該第一方面的另一個特別優選的實施方案，本藥物組合物還包括鋁。 出人意料的是，發現添加鋁至本組合物進一步減少本改性的全花生提取物的致敏性。
[0032] 因為顯著減少的IgE結合，或IgE表位，本藥物組合物特別適合被用于對患者進行 花生過敏脫敏的治療性治療中，優選地，通過免疫治療或免疫接種。
[0033] 根據本發明，免疫治療包括以足夠的量且持續足夠的時間向經受過敏的哺乳類， 優選人類哺乳類施用本組合物，以減少、或消除所述哺乳類對所述過敏原的過敏應答。
[0034] 典型的足夠的量將是以本組合物相對于其施用的個體體重計從約0. lng/kg至 10mg/kg、10ng/kg至約100μ g/kg、或0· 1 μ g/kg至1 μ g/kg。通常，治療將包括以在這些范 圍的下端的劑量的施用起始，并隨著治療的進展增加劑量。
[0035] 對于脫敏治療，它通常需要患者接受頻繁的施用，例如，最初地每一、兩或三天，逐 漸減少到每兩或三周一次。其它合適的脫敏方案包括皮下注射，每2-4周一次，注射的劑量 可在3-6個月的時期逐漸增加，且然后以每2-4周一次繼續注射，持續長達約5年的時期。 給予每日施用也是可能的，特別是用于舌下施用。
[0036] 脫敏的方案還可以包括在各種等價替代形式中常規地被稱為快速脫敏、快速過敏 原免疫治療、快速過敏原接種、及快速或急速免疫治療的治療形式。從廣義上講，這個過程 旨在通過以頻繁（例如每小時）間隔，施用增加劑量的過敏原的一系列注射（或經由另一 種合適的載體），以使過敏患者提前達到提取物（即，過敏原）的免疫或維持劑量。如果成 功的話，患者將會表現出對過敏原改善的抵抗，甚至可能呈現出對任何隨后的過敏原暴露 的完全無反應性。
[0037] 各種脫敏方案是本領域已知的，并且可例如包括治療對過敏原具有速發型超敏反 應的患者的方法，使用加速的快速免疫治療安排，與在接受加速的免疫治療之前用潑尼松 和組胺拮抗劑預治療這些患者的方法組合。
[0038] 本發明將在本發明的優選實施方案的下述實施例中進一步詳細說明。在實施例 中，參考了附圖，其中：
[0039] 圖1 :顯示了個體花生過敏原和西班牙（Spanish)品種的提取物的rp-HPLC圖譜。 圖A (個體花生過敏原）：在7. 3ml處的峰：Ara h2 ;在9-9. 5ml處的峰：Ara h6 ;在11ml處 的峰：Ara hi。圖B(西班牙品種的提取物）：空白（MQ水）；在7. 3ml處的峰：Ara h2 ;在 9-9. 5ml 處的峰：Ara h6 ;在 11ml 處的峰：Ara hi ;
[0040] 圖2 :顯示了個體花生過敏原改性之前和之后的rp-HPLC圖譜。上圖：Ara hl，箭 頭指示改性之前（天然）和之后（RA)。中圖：Ara h2,箭頭指示改性之前（天然）和之后 (RA)。下圖：Arah6,箭頭指示改性之前（天然）和之后（RA);
[0041] 圖3 :顯示了個體花生過敏原改性之前和之后的遠UV⑶光譜。上圖：Ara hl，箭 頭指示改性之前（天然）和之后（RA)。中圖：Ara h2,箭頭指示改性之前（天然）和之后 (RA)。下圖：Arah6,箭頭指示改性之前（天然）和之后（RA);
[0042] 圖4 :顯示了花生過敏小鼠激發后的體溫。上圖：以天然花生提取物（0. 1、0. 6、和 3mg/小鼠）激發。下圖：以改性的花生提取物（0. 1、0. 6、和3mg/小鼠）激發；
[0043] 圖5 :顯示了實施例6(A)中使用的致敏、脫敏和激發方案的時間線，和實施例7(B) 中使用的致敏、脫敏和激發方案的時間線；
[0044] 圖6:顯示了在第91天激發的小鼠的溫度（A)，與在第85天的肥大細胞激活（B; mMCP-1)；
[0045] 圖7 :顯示了在第112天激發的小鼠的溫度；
[0046] 圖8 :顯示了在第99天測試的所有組的血清中mMCP-1的水平；
[0047] 圖9 :顯示了在第99天測試的所有組的血清中IgE㈧、IgGl (B)
[0048] 和 IgG2a(C)的水平。 實施例
[0049] 實施例1.樣品采集和提取物的制備
[0050] I2 種花生樣品由 Maleki 博士（US Department of Agriculture, New Orleans, USA) 慷慨地提供，包括四種不同的品種（蘭納（Runner)、西班牙（Spanish)、巴倫西亞 (Valencia)和弗吉尼亞（Virginia))。這些品種通常在西歐和美國消費。部分花生被烘烤 (在預熱的循環熱空氣烘箱中140°C持續15分鐘）。
[0051] 手工研磨花生并用丙酮脫脂（5克花生使用50mL丙酮脫脂30分鐘），并留在室 溫（RT)干燥過夜。以10mL50mM Tris HC1 pH8. 0(10% w/v)懸浮lg脫脂的花生粉，并在 RT攪拌1小時。隨后將樣品離心，并將上清液通過0. 2 μ m的纖維素膜過濾器（Whatman FP30/0, 2CA-S, Whatman GmbH, Dassel, Germany)過濾并用于進一步的研究。
[0052] 提取物以等分試樣儲存在_20°C用于單次使用。蛋白質濃度使用Bradford分 析測定。以牛血清白蛋白（BSA2mg/mL來自Pierce,IL,USA)制備標準曲線，并稀釋至 50-500 μ g/mL的范圍。將粗花生提取物（CPE)以50mM Tris HC1 pH8. 0稀釋40x。將來自 Bio-Rad, USA的蛋白測定試劑以水稀釋5x。將20 μ L標準品和樣品與lmL5x稀釋的試劑 混合，且將250 μ L的每個樣品和標準品置于有平面的平底平板（F型）（flat bottom plate withflat(F-type))的孔中。50mMTrisHClpH8.0被用作空白。結果總結于表1中。
[0053] 表1 :花生樣品和其提取物中的蛋白質濃度。
[0054]
【權利要求】
1. 藥物組合物，所述藥物組合物包括改性的全花生提取物和藥學上可接受的稀釋劑和 /或賦形劑，其中所述改性的全花生提取物是還原且隨后烷基化的全花生提取物。
2. 根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物是脫脂的。
3. 根據權利要求1或權利要求2所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物包括可溶 性花生仁蛋白質。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物包括Ara h 1、Ara h2 和 Ara h6。
5. 根據權利要求1至4中任一項所述的藥物組合物，其中所述全花生提取物是通過以 下可獲得的： a) 研磨花生以提供花生粉； b) 使用每50ml丙酮5克花生粉在丙酮中孵育所述花生30分鐘，以提供脫脂的花生粉； c) 干燥所述脫脂的花生粉； d) 在具有在7和9之間的pH的緩沖液中懸浮所述干燥的花生粉；及 e) 分離步驟（d)得到的上清液，從而提供全花生提取物。
6. 根據權利要求1至5中任一項所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包括鋁。
7. 根據權利要求1至6中任一項所述的組合物，用于通過免疫治療來治療經受過敏的 哺乳類。
8. 根據權利要求7所述的用途，其中所述哺乳類是人類哺乳類。
9. 根據權利要求1至6中任一項所述的組合物，用于針對所述過敏原使哺乳類的免疫 系統脫敏的治療性治療，或用于在與所述過敏原接觸后有發展過敏的高度傾向的哺乳類的 預防性治療。
10. 根據權利要求9所述的用途，其中所述哺乳類是人類哺乳類。
11. 根據權利要求1至6中任一項所述的組合物，用于藥物。
12. 用于免疫治療的方法，所述方法包括以足夠的量且持續足夠的時間向經受過敏的 哺乳類、或處于發展過敏的風險的哺乳類施用根據權利要求1至6中任一項所述的組合物， 以減少、或消除所述哺乳類對所述過敏原的過敏應答。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述哺乳類是人類哺乳類。
【文檔編號】A61K36/48GK104066433SQ201280061902
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年12月14日 優先權日:2011年12月16日
【發明者】斯特凡·約翰·科佩爾曼, 喬安娜·寶琳娜·瑪麗亞·范德克雷杰 申請人:哈爾過敏控股有限公司