一種惡性腫瘤治療性疫苗及其組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種惡性腫瘤治療性疫苗及其組合物。所述的惡性腫瘤治療性疫苗為腫瘤細(xì)胞系，所述的腫瘤細(xì)胞系包含人轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β2）反義核酸的質(zhì)粒；所述的惡性腫瘤治療性疫苗組合物，包括惡性腫瘤治療性疫苗和免疫增強(qiáng)劑，所述的免疫增強(qiáng)劑選自：短棒狀桿菌制劑，無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑，卡介菌多糖、核酸制劑，紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑，A群鏈球菌制劑，無細(xì)胞A群鏈球菌制劑，綠膿桿菌制劑，無細(xì)胞綠膿桿菌制劑，布氏菌制劑，無細(xì)胞布氏菌制劑，無細(xì)胞母牛分枝桿菌制劑，無細(xì)胞恥垢分支桿菌制劑，優(yōu)選無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑；所述的惡性腫瘤包括：肺癌、肝癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌或乳腺癌。
【專利說明】一種惡性腫瘤治療性疫苗及其組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種惡性腫瘤治療性疫苗及其組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，惡性腫瘤依然是威脅人類生存的頭號殺手，嚴(yán)重干擾患者的健康和影響生存質(zhì)量，其治療方法主要有手術(shù)、化療、放療與生物治療四種模式。雖然用手術(shù)、化療及療常規(guī)治療可以清除大部分腫瘤細(xì)胞并能使多數(shù)患者的病情得到緩解，但化療、放療大都對患者存在著嚴(yán)重的毒副作用。且這些治療方法達(dá)不到完全根除癌細(xì)胞的效果，大多數(shù)病人最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)。因此繼手術(shù)、化療、放療后，生物治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療的重要手段。當(dāng)前，腫瘤生物治療策略主要有細(xì)胞因子療法、細(xì)胞療法、基因治療、靶向治療等。但目前大多數(shù)生物治療的有效性還遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度，其主要原因是這些治療不能有效地激活免疫系統(tǒng)清除腫瘤細(xì)胞。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，腫瘤疫苗成為研究的熱點(diǎn)之一，其原理是通過激活患者自身免疫系統(tǒng)，以達(dá)到清除或控制腫瘤的目的?，F(xiàn)階段研究較多的腫瘤疫苗有腫瘤細(xì)胞疫苗、腫瘤抗原疫苗、以DC (樹突狀細(xì)胞)為基礎(chǔ)的疫苗以及核酸疫苗等。盡管現(xiàn)有疫苗表現(xiàn)出一定的抗腫瘤效應(yīng)，但存在療效不強(qiáng)、安全性差等缺點(diǎn)，因此，如何克服免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的免疫逃逸，研制出副作用小，臨床療效滿意的腫瘤疫苗是其能否取得成功的關(guān)鍵。
[0003]免疫增強(qiáng)劑(immunopotentiator)是通過不同方式,達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫力的一類免疫治療藥物。臨床上常用于治療與免疫功能低下有關(guān)的疾病及免疫缺陷病。目前針對免疫增強(qiáng)劑的研究很多。
[0004]現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥物加工到納米水平之后，可顯著提高吸收度、擴(kuò)散度，有利于降低藥物的某些副作用，提高藥效。通常微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)為機(jī)械法、非機(jī)械法兩種。機(jī)械法包括:高壓勻漿器、高速珠磨機(jī)、超聲波震蕩器，非機(jī)械法包括化學(xué)法、酶解法、滲透壓沖擊法、凍融法和干燥法。雖然細(xì)胞破碎的方法很多，但都難以將細(xì)胞破碎到粒度均一的納米水平。將藥物加工到其粒度絕大部分都小于500nm從技術(shù)角度講是難于實(shí)現(xiàn)的。
[0005]轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor- β , TGF- β )是一組具有多重作用的調(diào)節(jié)蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增長、協(xié)助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的作用。轉(zhuǎn)化生長因子β_2是TGF-β家族里最主要的亞型。通常情況下，癌癥病人的免疫抑制中多伴有TGF-β 2水平的提高，TGF-β 2水平與癌癥病人的預(yù)后也有密切關(guān)系。TGF-β 2對天然殺傷細(xì)胞、淋巴細(xì)胞激活細(xì)胞、樹突細(xì)胞具有拮抗作用。腫瘤細(xì)胞性疫苗有助于增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤相關(guān)抗原的提呈作用，加強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的清除。
[0006]RNA干擾現(xiàn)象是由FIRE等在1998年首先發(fā)現(xiàn)的，是指通過正、反義RNA片段形成雙鏈RNA，從而特異性地抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象。作為高效、特異的調(diào)芐基因表達(dá)的技術(shù)，RNA干擾已成為基因功能和信號傳遞系統(tǒng)上下游分子相互關(guān)系研究的有力工具。抑制TGF-β 2的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的免疫逃逸。
[0007]為此，本發(fā)明提出一種惡性腫瘤治療性疫苗及其組合物。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種惡性腫瘤治療性疫苗。
[0009]本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出了一種惡性腫瘤治療性疫苗組合物。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為:
[0011]一種惡性腫瘤治療性疫苗，所述的惡性腫瘤治療性疫苗為腫瘤細(xì)胞系，所述的腫瘤細(xì)胞系包含人TGF-β 2反義核酸的質(zhì)粒。
[0012]所述的腫瘤細(xì)胞系選自肺癌腫瘤細(xì)胞、肝癌腫瘤細(xì)胞、乳腺癌腫瘤細(xì)胞、胃癌腫瘤細(xì)胞、胰腺癌腫瘤細(xì)胞或結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞。
[0013]所述的肺癌腫瘤細(xì)胞選自:人肺腺癌細(xì)胞株SK-LU-1、人肺腺癌細(xì)胞株Rh-2，人大細(xì)胞肺癌NC1-H-460，人肺鱗癌細(xì)胞株NC1-H-520、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H358、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H1650、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H1299、人肺癌細(xì)胞株MST0-211H、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H1975、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H2087、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H2227、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H23、人肺腺鱗癌細(xì)胞NC1-H596、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H838、人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1 [SKMES-1 ;SKMES1]、人肺鱗癌細(xì)胞LTEP-s、人肺腺癌瘤株Calu_3、人肺鱗癌細(xì)胞NC1-H2170、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H2087、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H23、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H1975、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H838、人肺癌細(xì)胞H1299或人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NC1-H446、 [0014]所述的乳腺癌腫瘤細(xì)胞選:人乳腺髓樣癌細(xì)胞Bcap-37、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT474、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-157、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞MDA-MB-231、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3、人乳腺腺癌細(xì)胞MCF-7。
[0015]所述的肝癌腫瘤細(xì)胞選自:人肝細(xì)胞癌細(xì)胞BEL-7402、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞BEL-7405、人肝癌細(xì)胞H7402、人肝癌細(xì)胞HCC-9204、人肝癌細(xì)胞H印3B、人肝癌細(xì)胞H印G2、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肝癌細(xì)胞BEL-7404。
[0016]所述的胃癌腫瘤細(xì)胞選自:人胃腺癌細(xì)胞BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞MGC-803、人胃低分化腺癌細(xì)胞SGC7901、人胃腺癌細(xì)胞AGS。
[0017]所述的結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞選自:人結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0205、人結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0320DM、人回盲腸腺癌細(xì)胞HCT-8、人低分化結(jié)腸腺癌細(xì)胞HCT-116、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT-29、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS-174T、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco_2。
[0018]所述的胰腺癌細(xì)胞選自:人胰腺導(dǎo)管上皮癌細(xì)胞PANC-1、人胰腺腺癌細(xì)胞Pancl0.05、人胰腺腺癌細(xì)胞SW1990、人胰腺癌細(xì)胞JF305、人胰腺癌細(xì)胞PC-3、人胰腺癌細(xì)胞 Capan-2。
[0019]所述的白血病細(xì)胞選自:人白血病細(xì)胞CEM、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人細(xì)胞白血病細(xì)胞HPB-ALL T、人白血病細(xì)胞HL-60、人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937、人T細(xì)胞白血病細(xì)胞6T-CEM、人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞A3。
[0020]所述的淋巴瘤癌細(xì)胞選:人淋巴瘤細(xì)胞MJ、人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞Daudi B、人淋巴瘤細(xì)胞RajiBurkitt、人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞RAMOSB、人單核細(xì)胞型淋巴瘤細(xì)胞THPI。
[0021]所述的卵巢癌細(xì)胞選自:人卵巢癌細(xì)胞A2780、人卵巢癌細(xì)胞CoCl、人卵巢癌細(xì)胞CoC2、人卵巢癌細(xì)胞0VCAR-3、人卵巢癌細(xì)胞SK-0V-3、人卵巢癌細(xì)胞SK-0V-3/DDP。
[0022]其中，所述的惡性腫瘤包括:肺癌、肝癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌或乳腺癌。
[0023]所述的人TGF-β 2 的 cDNA 為:NCBI Reference Sequence:NM_003238.3，片段1369bp-2613bp。
[0024]本發(fā)明的腫瘤治療性疫苗可用于靜脈、皮下或皮內(nèi)注射，劑量為1X107~5X107細(xì)胞，用法為每10~60天注射一次。
[0025]本發(fā)明涉及一種惡性腫瘤治療性疫苗組合物，所述的組合物包括本發(fā)明所述的惡性腫瘤治療性疫苗和免疫增強(qiáng)劑，所述的免疫增強(qiáng)劑選自:短棒狀桿菌制劑，無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑，卡介菌多糖、核酸制劑，紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑，A群鏈球菌制劑,無細(xì)胞A群鏈球菌制劑，綠膿桿菌制劑，無細(xì)胞綠膿桿菌制劑，布氏菌制劑，無細(xì)胞布氏菌制劑，無細(xì)胞母牛分枝桿菌制劑，無細(xì)胞恥垢分支桿菌制劑，胸腺肽制劑，左旋咪唑制劑，霍亂霉素B亞單位制劑，白細(xì)胞介素IL-1制劑，白細(xì)胞介素IL-2制劑，白細(xì)胞介素IL-12制劑，白細(xì)胞介素IL-3制劑，白細(xì)胞介素IL-4制劑，白細(xì)胞介素IL-6制劑，白細(xì)胞介素IL-1l制劑、熱休克蛋白制劑、CpG寡脫氧核苷酸制劑(CpG-ODN)、凍干卡介苗胞壁勻漿制劑(BCG-CW)、滅活草分歧桿菌制劑、銅綠假單胞菌MSHA菌毛株菌苗(PA-MSHA菌苗)、烏苯美司(ubenimex)、必思添(biostim)、多價細(xì)菌溶解產(chǎn)物(bacteriallysates,泛福舒)、干擾素IFN- α制劑、干擾素IFN-β制劑、干擾素IFN-Y制劑、集落刺激因子制劑、粒細(xì)胞集落刺激因子制劑、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因 子制劑、轉(zhuǎn)移因子制劑(transfer factor, TF)0所述的轉(zhuǎn)移因子制劑包括正常人自細(xì)胞轉(zhuǎn)移因子和胎盤轉(zhuǎn)移因子(胎盤肽)。
[0026]本發(fā)明的惡性腫瘤治療性疫苗的組合物為惡性腫瘤治療性疫苗和免疫增強(qiáng)劑聯(lián)合使用。通過動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證實(shí)，惡性腫瘤治療性疫苗通過與免疫增強(qiáng)劑的聯(lián)合使用，其抗腫瘤作用大大增強(qiáng)。
[0027]在使用惡性腫瘤治療性疫苗的同時使用免疫增強(qiáng)劑，免疫增強(qiáng)劑可用于肌肉注射的方式。本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑的無細(xì)胞制劑，根據(jù)需要，可制成無菌生理鹽水的懸浮制劑，固體含量為1.0mg/ml或2.0mg/ml,也可以制成凍干粉針或適合藥用的其他劑型。本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑合適劑量范圍為0.001~0.2mg/Kg體重，優(yōu)選為0.01~0.08mg/Kg體重，I~7
天/次。
[0028]隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)理的深入認(rèn)識和分子免疫學(xué)理論的發(fā)展，非特異性免疫在抗腫瘤中的作用，越來越被人們所重視。巨噬細(xì)胞(ΜΦ )不但在機(jī)體非特異性免疫中起重要作用，而且在特異性免疫中也起著非常重要的作用。單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)除具有吞曬功能，還可發(fā)揮抗原遞呈(antigen presentation)作用，也屬于抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presentation cell, APC),可輔助T淋巴細(xì)胞活化,并與淋巴細(xì)胞相互刺激其功能，從而放大特異性免疫效應(yīng)。然而只有活化的ΜΦ才能發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，且活化的ΜΦ的抗腫瘤作用具有選擇性，即只殺傷腫瘤細(xì)胞而不殺傷正常細(xì)胞，其殺傷效應(yīng)與腫瘤的抗原結(jié)構(gòu)及瘤細(xì)胞增生周期無關(guān)，且可殺傷對化療、放療呈抗性的腫瘤細(xì)胞。
[0029]免疫增強(qiáng)劑如無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑抗腫瘤作用主要是通過對單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)強(qiáng)大而持久的刺激，引起巨噬細(xì)胞(Μφ)增生、活化、吞噬功能增強(qiáng)、誘導(dǎo)分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-y)、白細(xì)胞介素(IL-2)、活性氧(Η202、Ν0)等癌細(xì)胞殺傷因子及增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性，達(dá)到抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，且可通過促進(jìn)造血多能干細(xì)胞分化為單核巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)動機(jī)體免疫系統(tǒng)蘊(yùn)藏抗癌潛力。
[0030]由于小鼠的TGF_i3 2的基因序列與人TGF_i3 2的基因序列高度同源，所以本發(fā)明亦采用小鼠作為動物模型，進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)本發(fā)明的惡性腫瘤治療性疫苗具有良好的治療作用。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0031]圖1為pIRESpuro3質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。
[0032]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】僅限于進(jìn)一步解釋和說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1:肺癌疫苗的制備方法:
[0034]1.人TGF- β 2反義質(zhì)粒的制備:
[0035]將人TGF-P2 的 cDNA (NCBI Reference Sequence:NM_003238.3,片段1369bp-2613bp )反方向克隆至pIRESpuro3載體的多克隆位點(diǎn)MCS中，經(jīng)測序證實(shí)。由于pIRESpuro3載體含有CMV的啟動子和增強(qiáng)子，能在哺乳動物內(nèi)復(fù)制；含有腦炎心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES)和表達(dá)抗嘌呤霉素的基因，能使人TGF-β 2的反義mRNA在細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)表達(dá)，且在嘌呤霉素篩選下，只有表達(dá)人TGF-β 2的反義mRNA的細(xì)胞才能穩(wěn)定生長。pIRESpuro3質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如附圖1所示。
[0036]2.穩(wěn)定細(xì)胞株的制備
[0037]分別收集對數(shù)生長期的四個非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，肺腺癌細(xì)胞株SK-LU-1、肺腺癌細(xì)胞株Rh-2、大細(xì)胞肺癌NC1-H-460、肺鱗癌細(xì)胞株NC1-H-520，將TGF- β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到4種細(xì)胞內(nèi)；
[0038]將細(xì)胞室溫下離心(200g，5min)，在電穿孔緩沖液(10%甘油，lmMMgcl2)中重懸細(xì)胞，濃度調(diào)整至2X106/ml，加入人TGF- β 2反義質(zhì)粒25ug/ml，將800ul細(xì)胞懸液移至4mm電擊杯，電擊參數(shù)為電壓620v，持續(xù)時間60us，脈沖次數(shù)I次。
[0039]將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞株加入含10 μ g/ml的嘌呤霉素的新鮮RPMI1640/10%胎牛血清培養(yǎng)基，每2~3天更換一次新的篩選培養(yǎng)基，直到穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后，約轉(zhuǎn)染后15天左右，繼續(xù)培養(yǎng)5-10天后，分裝凍存。
[0040]3.穩(wěn)定細(xì)胞株人TGF-β 2表達(dá)水平的檢測
[0041 ] 收集人TGF- β 2反義穩(wěn)定細(xì)胞株，加入蛋白裂解液(ΡΗ8.0，20MmTri s-HCL常2%triton-X_100)裂解細(xì)胞,用抗人TGF- β 2抗體進(jìn)行western blot檢測，人TGF- β 2表達(dá)水平應(yīng)比未轉(zhuǎn)入人TGF-β 2反義質(zhì)粒的正常肺癌細(xì)胞株下降超過40%。
[0042]4.腫瘤疫苗的制備
[0043]將上述經(jīng)過鑒定的穩(wěn)定表達(dá)人TGF-β 2反義核酸的四個肺癌細(xì)胞株，繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用IOOGy照射后，取IXlO7細(xì)胞/毫升，分裝凍存。
[0044]5.病人入組指標(biāo):
[0045]非小細(xì)胞肺癌ΙΙΙΑ、IIIB或IV期病人，中性粒細(xì)胞大于1500/ml，血小板大于100，000/ml，肝腎功能正常。
[0046]劑量在2.5 X IO7細(xì)胞/每種細(xì)胞，靜脈注射，四種細(xì)胞合用，每個月一次。
[0047]6.反應(yīng)性和有效性:
[0048]在第24周時，有15%的病人部分緩解，59%的病人疾病未進(jìn)展。
[0049]所有病人平均中位生存期是441天，生存期明顯延長。I年和2年的生存率在68%和 52%。
[0050]還可以按照上述方法，將人TGF_i32反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人肺腺癌細(xì)胞株SK-LU-1、人肺腺癌細(xì)胞株Rh-2，人大細(xì)胞肺癌NC1-H-460，人肺鱗癌細(xì)胞株NC1-H-520、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H358、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H1650、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H1299、人肺癌細(xì)胞株MST0-211H、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H1975、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H2087、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H2227、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H23、人肺腺鱗癌細(xì)胞NC1-H596、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H838、人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1 [SKMES-1 ;SKMES1]、人肺鱗癌細(xì)胞LTEP-s、人肺腺癌瘤株Calu-3、人肺鱗癌細(xì)胞NC1-H2170、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H2087、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H23、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H1975、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H838、人肺癌細(xì)胞H1299或人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H446中，制成不同的肺癌治療性疫苗。
[0051]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0052]實(shí)施例2:卵巢癌腫瘤治療性疫苗的制備
[0053]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人卵巢癌細(xì)胞A2780、人卵巢癌細(xì)胞CoCl、人卵巢癌細(xì)胞CoC2、人卵巢癌細(xì)胞0VCAR-3、人卵巢癌細(xì)胞SK-0V-3、人卵巢癌細(xì)胞SK-0V-3/DDP腫瘤細(xì)胞系中，分別制備得到卵巢癌腫瘤治療性疫苗。
[0054]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0055]實(shí)施例3:乳腺癌腫瘤治療性疫苗的制備
[0056]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人乳腺髓樣癌細(xì)胞Bcap-37、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT474、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-157、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞MDA-MB-231、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3、人乳腺腺癌細(xì)胞MCF-7腫瘤細(xì)胞系中，制備得到乳腺癌腫瘤治療性疫苗。
[0057]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0058]實(shí)施例4:肝癌腫瘤治療性疫苗的制備
[0059]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人肝細(xì)胞癌細(xì)胞BEL-7402、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞BEL-7405、人肝癌細(xì)胞H7402、人肝癌細(xì)胞HCC-9204、人肝癌細(xì)胞H印3B、人肝癌細(xì)胞H印G2、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肝癌細(xì)胞BEL-7404腫瘤細(xì)胞系中，制備得到肝癌腫瘤治療性疫苗。
[0060]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。[0061]實(shí)施例6:胃癌腫瘤治療性疫苗的制備
[0062]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人胃腺癌細(xì)胞BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞MGC-803、人胃低分化腺癌細(xì)胞SGC7901、人胃腺癌細(xì)胞AGS腫瘤細(xì)胞系中，制備得到胃癌腫瘤治療性疫苗。
[0063]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0064]實(shí)施例7:結(jié)腸癌腫瘤治療性疫苗的制備
[0065]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0205、人結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0320DM、人回盲腸腺癌細(xì)胞HCT-8、人低分化結(jié)腸腺癌細(xì)胞HCT-116、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT-29、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS-174T、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2腫瘤細(xì)胞系中，制備得到結(jié)腸癌腫瘤治療性疫苗。
[0066]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0067]實(shí)施例8:胰腺癌腫瘤治療性疫苗的制備
[0068]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人胰腺導(dǎo)管上皮癌細(xì)胞PANC-1、人胰腺腺癌細(xì)胞Panc 10.05、人胰腺腺癌細(xì)胞SW1990、人胰腺癌細(xì)胞JF305、人胰腺癌細(xì)胞PC-3、人胰腺癌細(xì)胞Capan-2腫瘤細(xì)胞系中，制備得到胰腺癌腫瘤治療性疫苗。
[0069]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0070]實(shí)施例9:白血病治療性疫苗的制備
[0071]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人白血病細(xì)胞CEM、人慢性髓原白血病細(xì)胞Κ562、人細(xì)胞白血病細(xì)胞HPB-ALL Τ、人白血病細(xì)胞HL-60、人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937、人T細(xì)胞白血病細(xì)胞6T-CEM、人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞A3腫瘤細(xì)胞系中，制備得到白血病治療性疫苗。
[0072]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0073]實(shí)施例9:淋巴瘤治療性疫苗的制備
[0074]按照實(shí)施例1所述方法，將人TGF-β 2反義質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到:人淋巴瘤細(xì)胞MJ、人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞Daudi B、人淋巴瘤細(xì)胞RajiBurkitt、人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞RAM0SB、人單核細(xì)胞型淋巴瘤細(xì)胞THPl腫瘤細(xì)胞系中，制備得到白血病治療性疫苗。
[0075]實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)患者腫瘤抗原性的不同選擇轉(zhuǎn)染后的多種腫瘤細(xì)胞系合用，以適應(yīng)不同分化的癌癥病人。
[0076]實(shí)施例10無細(xì)胞布氏菌制劑的制備
[0077]—、布氏菌制劑的制備
[0078]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0079] 1.生產(chǎn)用種子:將工作種子批菌種啟開后，接種于肝浸液瓊脂斜面或其他適宜培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)44~48小時為第I代菌種。第I代菌種在2~8°C可以保存15日；將第I代菌種移種肝瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，放37°C培養(yǎng)44~48小時，為第2代菌種，經(jīng)肉眼純菌檢查合格后，用滅菌生理氯化鈉溶液洗下菌苔制成懸液。以此作為生產(chǎn)用種子，用于生產(chǎn)。
[0080]2.生產(chǎn)用培養(yǎng)基:用肝浸液瓊脂培養(yǎng)基。
[0081]3.菌種接種和培養(yǎng):于培養(yǎng)基中接種生產(chǎn)用種子后，放37°C培養(yǎng)44~48小時，肉眼逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。
[0082]二、無細(xì)胞布氏菌制劑的制備
[0083](1)將所述制劑加熱煮沸15分鐘得到滅活菌液；
[0084](2)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)生理鹽水洗滌3次后，在無菌條件下用超高壓射流對撞機(jī)在1000kgf/cm2壓力下破碎菌體2次；
[0085](3)菌體破碎后的懸液經(jīng)1000Orpm離心0.5小時后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌5次；
[0086](4)無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后將懸液分裝，在60~65°C加熱0.5~2小時加熱滅菌，得到所述制劑的無細(xì)胞制劑；
[0087](5)將得到的無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
[0088]實(shí)施例11卡介菌多糖、核酸制劑的制備
[0089]卡介菌多糖、核酸制劑系用卡介菌經(jīng)熱酚法提取多糖、核酸，配以滅菌生理氯化鈉溶液制成，用于預(yù)防和治療慢性支氣管炎、感冒、哮喘等疾病。
[0090]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0091]—、卡介菌多糖、核酸制劑的制備
[0092]來源:采用國家藥品管理批準(zhǔn)的菌種進(jìn)行生產(chǎn)，嚴(yán)禁使用通過動物的菌種用于生產(chǎn)。
[0093]凍干菌種在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基以及液體蘇通培養(yǎng)基上每傳一次為一代。在馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌種放冰箱保存不超過2個月。用于生產(chǎn)的培養(yǎng)物的總代數(shù)不超過12代。
[0094]菌體收集:培養(yǎng)物應(yīng)逐瓶檢查，若有污染、混濁等情況應(yīng)廢棄。收集馬鈴薯培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)物或液體蘇通表面培養(yǎng)物，壓干，加入適量蒸餾水，以高速粉碎機(jī)破碎菌體后備用。
[0095]提取:取破碎菌懸液與等量熱酚混勻，以靜置法或離心沉淀菌體，吸取上清，以透析法除酚，加入適量乙醇沉淀多糖、核酸，收集沉淀物。分別以乙醇、乙醚混勻洗滌，離心后干燥即得精制多糖、核酸。
[0096]實(shí)施例12:無細(xì)胞A群鏈球菌制劑的制備
[0097]A群鏈球菌制劑是由A群鏈球菌的弱毒菌株經(jīng)培養(yǎng)、增效及青霉素處理后制成的凍干品，用于癌性胸水及惡性腫瘤的免疫治療。
[0098]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0099]一、A群鏈球菌制劑的制備
[0100]菌種為CMCC 32235株或SIPI722株，接種在Todd-Hewitt肉湯或酵母浸膏或其他適宜的固體或液體培養(yǎng)基。
[0101]將工作種子批菌種啟開后，接種在適宜的固體或液體培養(yǎng)基上，36±1°C培養(yǎng)，2~4代擴(kuò)增，由此制備適宜的工作種子液。
[0102]菌種接種及培養(yǎng):采用大瓶或大罐液體培養(yǎng)。于培養(yǎng)基中接種生產(chǎn)用工作種子液后，在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌應(yīng)廢棄。
[0103]采集及處理:正常培養(yǎng)物離心或薄膜過濾，菌體用適量生理氯化鈉溶液洗兩次，根據(jù)菌體濕重，加入適量的青霉素G，在660nm處測定A值，計算含量或?qū)⒕w懸浮于適量的BBM溶液中，在660nm處測定A值來計算含量后加入適量青霉素G。經(jīng)多步處理后的菌液為待稀釋原液。
[0104]二、無細(xì)胞A群鏈球菌制劑的制備
[0105](I)將所述制劑加熱煮沸15~60分鐘得到滅活菌液；
[0106](2)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)生理鹽水洗滌3次后，在無菌條件下用超高壓射流對撞機(jī)在1500kgf/cm2壓 力下破碎菌體2次；
[0107](3)菌體破碎后的懸液經(jīng)20000rpm離心10分鐘后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌4次；
[0108](4)無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后將懸液分裝，在60~65°C加熱0.5~2小時加熱滅菌，得到所述制劑的無細(xì)胞制劑；
[0109](5)將得到的無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
[0110]實(shí)施例13:紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑的制備
[0111]紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架(N-CWS)系紅色諾卡氏菌經(jīng)發(fā)酵、破碎、提取獲得細(xì)胞壁骨架，加入適量乳化劑后凍干制成，主要含該菌細(xì)胞壁的組份霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖和粘肽等，用于惡性胸腹水和癌癥患者的免疫治療。
[0112]一、紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑的制備
[0113]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0114]制造用菌種用紅色諾卡氏菌P0-8株；
[0115]生產(chǎn)用培養(yǎng)基:使用葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)基。
[0116]生產(chǎn)用種子:將工作種子批菌種啟開后接種在營養(yǎng)瓊脂斜面上，28°C培養(yǎng)。2~3代采用葡萄糖-酵母膏液體振蕩培養(yǎng)36小時。純菌試驗(yàn)無污染雜菌者方可供作種子。
[0117]接種及培養(yǎng):在葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)液中接種種子液，振蕩通氣培養(yǎng)5天，在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣涂片鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。
[0118]菌體收集:收集培養(yǎng)液,離心收獲濕菌體。
[0119]破壁:濕菌體加蒸餾水，以超聲波破碎菌體。分別加胰蛋白酶、糜蛋白酶和鏈蛋白酶水解16~24小時，離心，獲細(xì)胞壁粗提物。
[0120]提取:分別以乙醚-乙醇、氯仿和氯仿-甲醇提取16小時。
[0121]干燥:溶媒提取后的細(xì)胞壁骨架于60°C減壓干燥至無溶媒味為止。獲得的細(xì)胞壁骨架于瑪瑙研缽中研細(xì)，得N-CWS原粉。置-20°C干燥保存，有效期為2年。
[0122]實(shí)施例14無細(xì)胞綠膿桿菌制劑的制備
[0123]本品系綠膿桿菌MSHA菌毛株培養(yǎng)后，取菌苔制成懸液，加甲醛殺菌，以PBS稀釋成每1ml含菌1.8X IO9制成，用于惡性腫瘤的輔助治療。
[0124]一、綠膿桿菌制劑的制備 [0125]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。將工作種子批菌種啟開后，接種在營養(yǎng)瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基，放35~37°C培養(yǎng)，一般不超過18小時，傳代不得超過5代，由此制備適宜數(shù)量的生產(chǎn)用工作種子，用于生產(chǎn)。
[0126]生產(chǎn)用培養(yǎng)基:用pH7.2~7.4的營養(yǎng)瓊脂或國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)的其他培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中不應(yīng)含有對人體有害或其他過敏源物質(zhì)。
[0127]菌種接種和培養(yǎng):采用克氏瓶涂種法，置37°C培養(yǎng)18~20小時。在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片做革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)污染雜菌應(yīng)廢棄。
[0128]收獲和殺菌:培養(yǎng)結(jié)束后于采集的培養(yǎng)物中加入不超過1%甲醛的PBS，加殺菌劑后的原液放置室溫(20~26°C)，維持時間14~16天，離心洗滌后保存于2~8°C。
[0129]二、無細(xì)胞綠膿桿菌制劑的制備
[0130](I)將所述制劑加熱煮沸45分鐘得到滅活菌液；
[0131](2)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)生理鹽水洗滌3次后，在無菌條件下用超高壓射流對撞機(jī)在2000kgf/cm2壓力下破碎菌體2次；
[0132](3)菌體破碎后的懸液經(jīng)6000rpm離心1.5小時后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌3次；
[0133](4)無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后將懸液分裝，在60~65°C加熱0.5~2小時加熱滅菌，得到所述制劑的無細(xì)胞制劑；
[0134](5)將得到的無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
[0135]實(shí)施例15:無細(xì)胞假單胞菌制劑的制備
[0136]一、假單胞菌制劑的制備
[0137]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0138]將工作種子批菌種開啟后，接種于肉浸液基礎(chǔ)培養(yǎng)基，放30°C培養(yǎng)48小時,傳代不得超過5代。由此制備適宜數(shù)量的生產(chǎn)用工作種子。
[0139]培養(yǎng)基:肉浸液基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0140]菌種接種和培養(yǎng):采用涂種法，按種后置30°C培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)過程和殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。
[0141]采集和殺菌:培養(yǎng)結(jié)束后，刮取菌苔混懸于生理氯化鈉溶液的瓶中。將收獲的菌懸液置70°C水浴間歇滅菌2次，每次2小時，然后于3500r/min離心30分鐘，并棄上清液，加生理氯化鈉溶液混懸，菌懸液放2~8°C保存。
[0142]二、無細(xì)胞假單胞菌制劑的制備[0143](I)將所述制劑加熱煮沸15~60分鐘得到滅活菌液；
[0144](2)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)生理鹽水洗滌3次后，在無菌條件下用超高壓射流對撞機(jī)在2000kgf/cm2壓力下破碎菌體2次；
[0145](3)菌體破碎后的懸液經(jīng)8000rpm離心I小時后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌I~5次；
[0146](4)無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后將懸液分裝，在60~65°C加熱0.5~2小時加熱滅菌，得到所述制劑的無細(xì)胞制劑；
[0147](5)將得到的無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
[0148]實(shí)施例16:母牛分支桿菌制劑的制備
[0149]—、母牛分支桿菌制劑的制備
[0150]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0151]將工作種子批菌種開啟后，接種于羅氏培養(yǎng)基，放30°C培養(yǎng)48小時，傳代不得超過5代。由此制備適宜數(shù)量的生產(chǎn)用工作種子。 [0152]培養(yǎng)基:羅氏培養(yǎng)基。
[0153]菌種接種和培養(yǎng):采用涂種法，按種后置30°C培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)過程和殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。
[0154]二、無細(xì)胞母牛分支桿菌制劑的制備
[0155](I)將所述制劑加熱煮沸15~60分鐘得到滅活菌液；
[0156](2)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)生理鹽水洗滌3次后，在無菌條件下用超高壓射流對撞機(jī)在1600kgf/cm2壓力下破碎菌體2次；
[0157](3)菌體破碎后的懸液經(jīng)18000rpm離心I小時后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌I~5次；
[0158](4)無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后將懸液分裝，在60~65°C加熱0.5~2小時加熱滅菌，得到所述制劑的無細(xì)胞制劑；
[0159](5)將得到的無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
[0160]實(shí)施例17:恥垢分支桿菌制劑的制備
[0161]一、恥垢分支桿菌制劑的制備
[0162]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0163]將工作種子批菌種開啟后，接種于羅氏培養(yǎng)基，放30°C培養(yǎng)48小時，傳代不得超過5代。由此制備適宜數(shù)量的生產(chǎn)用工作種子。
[0164]培養(yǎng)基:羅氏培養(yǎng)基。
[0165]菌種接種和培養(yǎng):采用涂種法，按種后置30°C培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)過程和殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。[0166]二、無細(xì)胞恥垢分支桿菌制劑的制備
[0167](I)將所述制劑加熱煮沸15分鐘得到滅活菌液；
[0168](2)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)生理鹽水洗滌3次后，在無菌條件下用超高壓射流對撞機(jī)在1500kgf/cm2壓力下破碎菌體2次；
[0169](3)菌體破碎后的懸液經(jīng)1000Orpm離心0.5小時后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌5次；
[0170](4)無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后將懸液分裝，在60~65°C加熱0.5~2小時加熱滅菌，得到所述制劑的無細(xì)胞制劑；
[0171](5)將得到的無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
[0172]實(shí)施例18無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑的制備
[0173]1.CP工作種子批菌種連續(xù)2次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐，在低熱原、不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)7天:CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌，菌號為65101 (76-27或7627),65102 (H-84)或 65103 (77-1 或 771);
[0174]2.收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15分鐘得到菌液:
[0175]3.無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)洗滌后，用超高壓射流對撞機(jī)破碎菌體；所述的菌體是滅活菌，菌體濃度為100億/ml ;其中所述菌體破碎是在無菌條件下進(jìn)行。所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次；
[0176]4.菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液:所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌2次；菌體破碎后懸液的離心條件是在4°C、12000rpm離心50分鐘；
[0177]5.將懸液分裝后加熱滅菌，65°C加熱0.5小時，得到無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑。
[0178]實(shí)施例19
[0179]將實(shí)施例1制備的肺癌疫苗、實(shí)施例18制備的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑分別分裝，合并包裝，制備得到肺癌疫苗加免疫增強(qiáng)劑的組合物。
[0180]可按照該方法制備各種癌癥疫苗與免疫增強(qiáng)劑的組合物。
[0181]實(shí)驗(yàn)例1:
[0182]按照實(shí)施例1的方法將TGF-β 2反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肺腺癌細(xì)胞株SK_LU_1、肺腺癌細(xì)胞株Rh-2、大細(xì)胞肺癌NC1-H-460、肺鱗癌細(xì)胞株NC1-H-520中，制備肺癌治療性疫苗，聯(lián)合免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑，進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
[0183]病人入組指標(biāo):非小細(xì)胞肺癌IIIA、IIIB或IV期病人，共48例，中性粒細(xì)胞大于1500/ml，血小板大于100，000/ml，肝腎功能正常。
[0184]劑量在2.5 X IO7細(xì)胞/每種細(xì)胞，靜脈注射，四種細(xì)胞合用，每個月一次。同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑，5mg/0.1ml肌肉注射,每周一次。
[0185]6.反應(yīng)性和有效性:
[0186]在第24周時，有28%的病人部分緩解，87%的病人疾病未進(jìn)展。
[0187]所有病人平均中位生存期是563天，生存期明顯延長。I年和2年的生存率在85%和 69%ο[0188]實(shí)施例2:肺癌動物實(shí)驗(yàn):
[0189]1.制備實(shí)驗(yàn)動物
[0190]1.13LL細(xì)胞的培養(yǎng)
[0191] 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株購自上海市胸科醫(yī)院胸部腫瘤研究所。
[0192]用含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基，加雙抗(100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素)，置于37°C、5%C02混合氣體孵箱中培養(yǎng)，每1_2天換液，每3天傳代一次，傳代用
0.25%胰酶消化。取I X IO4細(xì)胞接種于24孔板，每24h計數(shù)，重復(fù)3孔，持續(xù)8天，計算每孔細(xì)胞均數(shù)，繪制生長曲線。
[0193]1.2細(xì)胞懸液的制備
[0194]取對數(shù)生長期的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，以0.25%的胰酶消化，收集細(xì)胞，離心去上清，用無菌生理鹽水洗滌兩次，將細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力測定大于90%,并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度分別為I X 105/mL、I X 106/mL、I X 107/mL，立即對小鼠進(jìn)行皮下接種及肺原位接種。
[0195]1.3實(shí)驗(yàn)動物和接種方法
[0196]實(shí)驗(yàn)動物C57BL/6小鼠48只，雌雄各半，8_10周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。采用原位接種法，具體如下:
[0197](I)分組:將小鼠隨機(jī)分為3組，每組16只，一組用于定時監(jiān)測腫瘤形成情況，另外2組用于腫瘤治療試驗(yàn)；第I組接種小鼠Lewis肺癌細(xì)胞總數(shù)為IX 105。
[0198](2)麻醉:戊巴比妥鈉溶液50mg/kg腹腔內(nèi)注射，將戊巴比妥鈉配成10mg/mL的工作液，按0.05mL/10g體重劑量對小鼠進(jìn)行麻醉。
[0199](3)接種:小鼠麻醉后，將其仰臥固定在操作臺上，對小鼠前胸壁進(jìn)行酒精消毒，在左腋前線肋弓上約1.5cm處作一約5_的小切口，分離皮膚及皮下組織暴露至胸壁，將50 μ L細(xì)胞懸液與50 μ L Matrigel混勻，在快凝固之前以胰島素注射針將小鼠Lewis肺癌細(xì)胞與Matrigel混懸液共100 μ L注入小鼠左肺，進(jìn)針約3mm，注射完后停針5s，拔針后縫合切口。
[0200]1.4移植瘤生長的觀察和測量
[0201]定期觀察C57BL/6小鼠的精神、飲食、排便、體重和活動等情況，皮下接種組于腫瘤形成后第3天開始測量腫瘤大小，以游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑及短徑，以公式V=a2b π /2 (a為腫瘤的短徑，b為腫瘤的長徑)計算腫瘤大小。原位移植組分別在接種后第3、6、9、12、20天，處死2只小鼠，觀察腫瘤形成及轉(zhuǎn)移情況。
[0202]2結(jié)果=IXlO5劑量級的小鼠在第9天解剖時有成瘤跡象，成瘤率均為100%。生存期為35d。
[0203]3.治療
[0204]按上述方法制備試驗(yàn)動物，采用按照實(shí)施例1的方法制備的將人TGF- β 2反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠Lewis肺癌細(xì)胞,得到肺癌的治療性疫苗。
[0205]第一組在原位接種的同時給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在IX IO5細(xì)胞/只，生存期間每周一次，第一組的小鼠平均生存期為86.3天；
[0206]第二組與原位接種后2周給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在I X IO5細(xì)胞/只，生存期間每3天一次，第二組的小鼠平均生存期為73.3天；[0207]由于腫瘤惡流質(zhì)原因，腫瘤的大小會有所變化，所以對腫瘤體積不做統(tǒng)計。
[0208]實(shí)驗(yàn)例3:
[0209]按實(shí)驗(yàn)例2的方法制備試驗(yàn)動物，采用實(shí)施例1制備的腫瘤治療性疫苗進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0210]第三組在原位接種的同時給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在IX IO5細(xì)胞/只，生存期間每周一次；同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，生存期間每周一次。第三組的小鼠平均生存期為123.3天；
[0211]第四組與原位接種后2周給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在IX IO5細(xì)胞/只，生存期間每3天一次；同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，生存期間每周一次。第三組的小鼠平均生存期為116.1天；
[0212]由于腫瘤惡流質(zhì)原因，腫瘤的大小會有所變化，所以對腫瘤體積不做統(tǒng)計。
[0213]實(shí)施例4:乳腺癌治療性疫苗的疫苗動物實(shí)驗(yàn)
[0214]1.材料與方法
[0215]1.1雌激素受體(estrogen receptor, ER)免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2動物:Balb/c小鼠，雌性，6~8周齡，體重18~22g，共30只，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于SPF級條件下。分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組4只。
[0216]1.3細(xì)胞起源于Balb/c小鼠的乳腺癌細(xì)胞MCF-7，由廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所保存。
[0217]1.4MCF-7細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，每隔2天傳代I次，待傳代足夠數(shù)量后取對數(shù)生長期細(xì)胞配成細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色，血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，細(xì)胞濃度調(diào)至IX 107ml。在Balb/c小鼠胸壁5~6肋間或腹壁第4對乳腺處皮下接種腫瘤細(xì)胞0.1ml，相當(dāng)于IX IO6細(xì)胞/只小鼠，每天觀察腫瘤的生長情況。
[0218]1.5按照實(shí)施例3的方法制備的將人TGF-β 2反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠乳腺癌細(xì)胞MCF-7得到小鼠的乳腺癌腫瘤治療性疫苗。
[0219]2.腫瘤生長情況:乳腺癌細(xì)胞接種后10天，在接種部位乳墊處出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，呈圓形、橢圓形或分葉狀生長，質(zhì)地較硬。結(jié)節(jié)漸增大，接種后17天第一組Balb/c小鼠移植瘤平均體積105.2mm3。
[0220]3.治療
[0221]按上述方法制備試驗(yàn)動物，采用實(shí)施例2制備的腫瘤疫苗進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0222]第2組在原位接種的同時給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在I X IO5細(xì)胞/只，每周一次，接種后17天第2組Balb/c小鼠移植瘤平均體積55.7mm3。
[0223]第3組與原位接種后2周給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在IX IO5細(xì)胞/只，每3天一次，接種后17天第3組Balb/c小鼠移植瘤平均體積62.5mm3。
[0224]實(shí)驗(yàn)例5:乳腺癌治療性疫苗的聯(lián)合治療
[0225]按上述方法制備試驗(yàn)動物2組，采用實(shí)施例2制備的乳腺癌腫瘤疫苗進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0226]第4組在原位接種的同時給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在I X IO5細(xì)胞/只，生存期間每周一次；同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞A群鏈球菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，每周一次。接種后17天Balb/c小鼠移植瘤平均體積40.8mm3。[0227]第5組與原位接種后2周給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在I X IO5細(xì)胞/只，生存期間每3天一次；同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞A群鏈球菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，每周一次。接種后17天Balb/c小鼠移植瘤平均體積45.3mm3。
[0228]實(shí)驗(yàn)例6:胃癌腫瘤治療性疫苗的治療實(shí)驗(yàn)
[0229]1.1材料Balb/c小鼠32只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK(京)2002-0003。雌性，6~8周齡，體重18~20g，SPF級條件下飼養(yǎng)。小鼠胃癌細(xì)胞MFC，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。DMEM培養(yǎng)液購自Sigma公司，胎牛血清購自四季青生物制品有限公司。
[0230]1.2方法購買的小鼠胃癌細(xì)胞MFC皮下接種:接種細(xì)胞數(shù)為I X IO8的鼠第21天腫瘤組織長至1.0cm/0.8cm大小，中央出現(xiàn)出血和壞死，腫瘤組織平均體積為0.32cm3。
[0231]3.治療
[0232]按上述方法制備試驗(yàn)動物，采用實(shí)施例6制備的將人TGF-β 2反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠胃癌細(xì)胞MFC，制備得到的胃癌腫瘤疫苗進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0233]第2組在 皮下接種的同時給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在1.5X IO5細(xì)胞/只，每周一次，接種后21天Balb/c小鼠移植瘤平均體積0.18mm3。
[0234]第3組與原位接種后2周給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在1.5 X IO5細(xì)胞/只，每3天一次,接種后21天Balb/c小鼠移植瘤平均體積0.21mm3。
[0235]實(shí)驗(yàn)例7:胃癌治療性疫苗的聯(lián)合治療
[0236]按上述方法制備試驗(yàn)動物2組，采用實(shí)驗(yàn)例6制備的胃癌腫瘤疫苗進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0237]第4組在原位接種的同時給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在1.5X IO5細(xì)胞/只，生存期間每周一次；同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞布氏菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，每周一次。接種后21天Balb/c小鼠移植瘤平均體積0.15mm3。
[0238]第5組與原位接種后2周給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在1.5 X IO5細(xì)胞/只，生存期間每3天一次；同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞布氏菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，每周一次。接種后21天Balb/c小鼠移植瘤平均體積0.17mm3。
[0239]實(shí)驗(yàn)例8:白血病治療性疫苗的治療實(shí)驗(yàn)
[0240]1.1實(shí)驗(yàn)動物
[0241]6~8周雌性和雄性SPF級Balb/c小鼠，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。40只，分為4組。小鼠白血病細(xì)胞L1210購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。
[0242]1.2接種小鼠白血病細(xì)胞1^1210細(xì)胞
[0243]無菌條件下取發(fā)病紅白血病Balb/c小鼠的脾臟，剪碎后經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾，PH7.4的PBS洗滌I次，離心去上清，加入0.15mol/L NH4Cl紅細(xì)胞裂解液處理lmin，PBS洗滌2次，計數(shù)備用。按每只Balb/c小鼠尾靜脈注射白血病細(xì)胞2 X IO6個進(jìn)行接種，總體積
0.2mL/只，雄性小鼠接種10只，雌性4只。正常對照組:n = 4，正常Balb/c小鼠尾靜脈輸注PBS0.2mL。觀察小鼠的精神狀態(tài)、腹部，取瀕死小鼠的肝脾稱重，計算MST和發(fā)病率、死亡率。
[0244]1.3外周血白細(xì)胞計數(shù)
[0245]取小鼠尾靜脈血5 μ L,加入195 μ L白細(xì)胞計數(shù)稀釋液中，待紅細(xì)胞溶解后,倒置顯微鏡下計數(shù)。計算公式:細(xì)胞濃度=(鏡下4大方格中細(xì)胞數(shù))X105/mL。當(dāng)外周血WBC>3.0X IO7 / mL時拉頸處死，按上述方法取脾細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)傳代。
[0246]2 結(jié)果
[0247]2.1接種小鼠白血病細(xì)胞L1210細(xì)胞
[0248]接種2X IO6個白血病細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組(η = 10)平均生存時間(MST)為14.5d，發(fā)病率100 %，死亡率100 %，連續(xù)傳代15代，發(fā)病率和死亡率仍保持100 %，未見自發(fā)緩解現(xiàn)象。發(fā)病小鼠表現(xiàn)為精神萎靡，腹部腫大，死亡時肝脾明顯增大，肝質(zhì)量(2.4±0.48) g，脾質(zhì)量(0.84±0.20) g，而正常對照組(η = 4)肝質(zhì)量(1.05±0.15) g，脾質(zhì)量(0.073±0.006) g，兩者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01 )。
[0249]2.2外周血白細(xì)胞計數(shù)
[0250]發(fā)病晚期每天進(jìn)行WBC計數(shù)，白血病實(shí)驗(yàn)組的外周血WBC逐漸升高，死亡前I~2d 外周血 WBC 為(3.33±0.27) X 107/mL，正常對照組(1.37±0.23) X 107/mL，兩者相比，P< 0.05。
[0251]3.治療
[0252]按上述方法制備試驗(yàn)動物，采用實(shí)施例9的方法將人TGF- β 2反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠白血病細(xì)胞L1210中，制備得到白血病治療性疫苗，進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0253]第3組在接種接種小鼠白血病細(xì)胞L1210同時給予疫苗，靜脈注射，劑量在1.5X105細(xì)胞/只，每周一次；接種后平均生存時間為29.5天，死亡前I~2d外周血WBC為(2.87±0.23) X 107/mL ；
[0254]第4組與接種小鼠白血病細(xì)胞L1210后2周給予腫瘤疫苗，靜脈注射，劑量在1.5X IO5細(xì)胞/只，每3天一次；接種后平均生存時間為26.5天。死亡前I~2d外周血WBC 為(2.17±0.27) X 107/mL。
[0255]實(shí)驗(yàn)例9:白血病治療性疫苗的聯(lián)合治療
[0256]按上述方法制備試驗(yàn)動物2組，采用實(shí)驗(yàn)例8制備的白血病治療性疫苗進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0257]第3組在接種小鼠白血病細(xì)胞L1210的同時給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在1.5 X IO5細(xì)胞/只，每周一次，同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞母牛分枝桿菌制劑，
0.5mg/0.1ml肌肉注射,每周一次接種后平均生存時間為25.5天，死亡前I~2d外周血WBC為(1.46±0.35) XlOVmL ；
[0258]第4組與接種小鼠白血病細(xì)胞L1210后2周給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在1.5X IO5細(xì)胞/只，每3天一次；同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞母牛分枝桿菌制劑，
0.5mg/0.1ml肌肉注射,每周一次。接種后平均生存時間為20.5天。死亡前I~2d外周血WBC 為(1.69±0.29) X 10VmL。
[0259]實(shí)施例10胰腺癌治療性疫苗的動物實(shí)驗(yàn)
[0260]1.動物模型準(zhǔn)備:
[0261]1.1實(shí)驗(yàn)動物及試劑:
[0262]Balb/c小鼠，體重18~22g，40只，分為4組；小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-83購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。
[0263] 1.2小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-83移植性胰腺癌模型制作:[0264]將小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-83培養(yǎng)后配成I X 107/ml，取0.2mL接種于小鼠皮下，4wk后成瘤。分別于20、30、40天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小。
[0265]根據(jù)公式V=ab2/2計算腫瘤體積[V=腫瘤體積，a=瘤體最長徑，b=瘤體最短徑]。肉眼觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移與腹水產(chǎn)生情況。
[0266]1.3.移植瘤體積變化監(jiān)測
[0267]接種后第20、30、40天，測量腫瘤體積平均值分別為84.1±21.9mm3,413.7 ±208.4mm3, 2187.3 ±1882.8mm3。結(jié)果顯示后者與IOd前比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.01)。解剖結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有3只荷瘤Balb/c小鼠的腫瘤內(nèi)出現(xiàn)液化灶且面積增大，同時伴有血性腹水。
[0268]3.治療
[0269]按上述方法制備試驗(yàn)動物，采用實(shí)施例8的方法將人TGF- β 2反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-83得到胰腺癌腫瘤治療性疫苗，進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0270]第3組在接種小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-83的同時給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在1.5Χ IO5細(xì)胞/只，每周一次，第20、30、40天，測量腫瘤體積平均值分別為65.3 ±14.6mm3, 379.3 ±164.8mm3,1068.7 ±1202.5mm3。
[0271]第4組在接種小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-832周后給予腫瘤治療性疫苗，靜脈注射，劑量在1.5X105細(xì)胞/只，每3天一次，第20、30、40天，測量腫瘤體積平均值分別為72.5 ±19.4mm3, 368.6 ±149.5mm3，1368.5 ±1432.7mm3。
[0272]實(shí)驗(yàn)例11:胰腺癌治療性疫苗的聯(lián)合治療
[0273]按上述方法制備試驗(yàn)動物2組，采用實(shí)驗(yàn)例10制備的胰腺癌治療性疫苗進(jìn)行治療性試驗(yàn):
[0274]第3組在接種小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-83的同時給予治療性疫苗，靜脈注射，劑量在1.5X105細(xì)胞/只，每周一次，同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞布氏菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，每周一次。第20、30、40天，測量腫瘤體積平均值分別為45.7±16.2mm3,265.3±134.9mm3,975.7±838.4mm3。
[0275]第4組在接種小鼠胰腺腺癌細(xì)胞MPC-832周后給予治療性疫苗，靜脈注射，劑量在
1.5 X IO5細(xì)胞/只，每3天一次，同時采用免疫增強(qiáng)劑一無細(xì)胞布氏菌制劑，0.5mg/0.1ml肌肉注射，每周一次。第20、30、40天，測量腫瘤體積平均值分別為56.2±21.6mm3，289.6±132.4mm3,1136.5±1054.1mm3。
【權(quán)利要求】
1.一種惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的惡性腫瘤治療性疫苗為腫瘤細(xì)胞系，所述的腫瘤細(xì)胞系包含人TGF-β 2反義核酸的質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞系選自肺癌腫瘤細(xì)胞、肝癌腫瘤細(xì)胞、乳腺癌腫瘤細(xì)胞、胃癌腫瘤細(xì)胞、胰腺癌腫瘤細(xì)胞或結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的肺癌腫瘤細(xì)胞選自:人肺腺癌細(xì)胞株SK-LU-1、人肺腺癌細(xì)胞株Rh-2，人大細(xì)胞肺癌NC1-H-460，人肺鱗癌細(xì)胞株NC1-H-520、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H358、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H1650、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H1299、人肺癌細(xì)胞株MST0-211HH、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H1975、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H2087、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H2227、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H23、人肺腺鱗癌細(xì)胞NC1-H596、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H838、人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1 [SKMES-1 ;SKMES1]、人肺鱗癌細(xì)胞LTEP-s、人肺腺癌瘤株Calu-3、人肺鱗癌細(xì)胞NC1-H2170、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H2087、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H23、人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NC1-H1975、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H838、人肺癌細(xì)胞H1299或人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NC1-H446、
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的乳腺癌腫瘤細(xì)胞選:人乳腺髓樣癌細(xì)胞Bcap-37、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT474、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-157、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞MDA-MB-231、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3、人乳腺腺癌細(xì)胞MCF-7。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的肝癌腫瘤細(xì)胞選自:人肝細(xì)胞癌細(xì)胞BEL-7402、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞BEL-7405、人肝癌細(xì)胞H7402、人肝癌細(xì)胞HCC-9204、人肝癌細(xì)胞Hep3B、人肝癌細(xì)胞H印G2、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肝癌細(xì)胞BEL-7404。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的胃癌腫瘤細(xì)胞選自:人胃腺癌細(xì)胞BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞MGC-803、人胃低分化腺癌細(xì)胞SGC7901、人胃腺癌細(xì)胞AGS。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞選自:人結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0205、人結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0320DM、人回盲腸腺癌細(xì)胞HCT-8、人低分化結(jié)腸腺癌細(xì)胞HCT-116、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT-29、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS-174T、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的胰腺癌細(xì)胞選自:人胰腺導(dǎo)管上皮癌細(xì)胞PANC-1、人胰腺腺癌細(xì)胞Pancl0.05、人胰腺腺癌細(xì)胞SW1990、人胰腺癌細(xì)胞JF305、人胰腺癌細(xì)胞PC-3、人胰腺癌細(xì)胞Capan-2。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的白血病細(xì)胞選自:人白血病細(xì)胞CEM、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人細(xì)胞白血病細(xì)胞HPB-ALL T、人白血病細(xì)胞HL-60、人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937、人T細(xì)胞白血病細(xì)胞6T-CEM、人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞A3。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的淋巴瘤癌細(xì)胞選:人淋巴瘤細(xì)胞MJ、人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞Daudi B、人淋巴瘤細(xì)胞RajiBurkitt、人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞RAMOSB、人單核細(xì)胞型淋巴瘤細(xì)胞THPI。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的卵巢癌細(xì)胞選自:人卵巢癌細(xì)胞A2780、人卵巢癌細(xì)胞CoCl、人卵巢癌細(xì)胞CoC2、人卵巢癌細(xì)胞0VCAR-3、人卵巢癌細(xì)胞SK-0V-3、人卵巢癌細(xì)胞SK-0V-3/DDP。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，所述的TGF-β2的cDNA%:NCBI Reference Sequence:NM_003238.3，片段 1369bp_2613bp。
13.—種惡性腫瘤治療性疫苗組合物，其特征在于，所述的組合物包括權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤治療性疫苗和免疫增強(qiáng)劑，所述的免疫增強(qiáng)劑選自:短棒狀桿菌制劑，無細(xì)胞短棒狀桿菌制 劑，卡介菌多糖、核酸制劑，紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑，A群鏈球菌制劑,無細(xì)胞A群鏈球菌制劑，綠膿桿菌制劑，無細(xì)胞綠膿桿菌制劑，布氏菌制劑，無細(xì)胞布氏菌制劑，無細(xì)胞母牛分枝桿菌制劑，無細(xì)胞恥垢分支桿菌制劑，胸腺肽制劑，左旋咪唑制劑，霍亂霉素B亞單位制劑，白細(xì)胞介素IL-1制劑，白細(xì)胞介素IL-2制劑，白細(xì)胞介素IL-12制劑，白細(xì)胞介素IL-3制劑，白細(xì)胞介素IL-4制劑，白細(xì)胞介素IL-6制劑，白細(xì)胞介素IL-1l制劑，熱休克蛋白制劑，CpG寡脫氧核苷酸制劑，凍干卡介苗胞壁勻漿制劑，滅活草分歧桿菌制劑，銅綠假單胞菌MSHA菌毛株菌苗(PA-MSHA菌苗)，烏苯美司，必思添，多價細(xì)菌溶解產(chǎn)物，干擾素IFN-α制劑，干擾素IFN-β制劑，干擾素IFN-Y制劑，集落刺激因子制劑，細(xì)胞集落刺激因子制劑，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子制劑，轉(zhuǎn)移因子制劑；優(yōu)選無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑。
【文檔編號】A61K39/00GK103961693SQ201310027998
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月24日
【發(fā)明者】熊慧 申請人:熊慧