微小rna或其抑制劑在脂代謝調控中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及microRNA或其抑制劑的用途，具體涉及microRNA或其抑制劑在制備調節脂代謝的藥物或制備預防或治療脂代謝相關疾病的藥物中的用途，所述microRNA包括miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種或數種。本發明還涉及所述microRNA或其抑制劑用于調節脂代謝相關蛋白表達水平的用途。本發明還涉及包含所述microRNA或其抑制劑的組合物。本發明所述的microRNA或其抑制劑可作為藥物組成成分，應用于預防或治療脂代謝紊亂導致的高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠心病等相關疾病。
【專利說明】微小RNA或其抑制劑在脂代謝調控中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及microRNA或其抑制劑的用途，具體涉及microRNA或其抑制劑在制備調節脂代謝的藥物或制備預防或治療脂代謝相關疾病的藥物中的用途。另外，microRNA或其抑制劑可用于上述相關疾病或相關蛋白功能機理研究的工具藥物。本發明還涉及所述microRNA或其抑制劑用于調節脂代謝相關蛋白表達水平的用途。本發明還涉及包含所述microRNA或其反義寡核苷酸抑制劑的組合物。
【背景技術】
[0002]動脈粥樣硬化性心腦血管病是世界范圍內最主要的致殘和致死的疾病，血脂異常是動脈粥樣硬化最重要的危險因素之一。尋找療效顯著安全可靠的血脂調節藥物一直是醫藥工作者長期研究的課題。
[0003]大量流行病學研究發現，動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的發病率和病死率與血衆高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平呈負相關，與血衆低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipopro-tein cholesterol, LDL-C)水平呈正相關。HDL-C濃度增加0.026mM,心血管事件的風險將減少2_3% ;而LDL-C濃度減少2-3mM，心血管事件的風險將減少約40-50%。血漿高密度脂蛋白抗動脈粥樣硬化功能主要通過其介導的膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport, RCT)來實現的，HDL-C清除速度越快，膽固醇逆轉運效率越高，動脈粥樣硬化的發病率和死亡率越低。此外，HDL的心血管保護作用還與其抗炎及抗氧化活性有關。
[0004]人B族I 型清 道夫受體(scavenger receptor class B, memberl, SR-BI)又稱 CD36和溶酶體整合膜蛋白 II 相關蛋白 I (CD36and Lysosomal integral membrane protein-1IAnalogouS-l，CLA-l)，是清道夫受體家族中的一個重要的膜整合糖蛋白。實驗表明，SR-BI是參與小鼠肝細胞HDL相關膽固醇酯選擇性吸收的關鍵分子。作為一個在肝臟中高表達的功能性高密度脂蛋白受體，SR-BI以高親和力和高飽和度與HDL相結合介導HDL-C選擇性攝取，這一過程是RCT的最后一個限速環節。肝細胞SR-BI過表達能夠促進HDL-C逆轉運，提高血漿HDL清除率，降低臨床動脈粥樣硬化及相關心血管疾病危險事件的發病率和致死率。
[0005]ATP 結合盒轉運蛋白 Al (ATP-binding cassette, sub-family A, memberl, ABCAl)是一個以ATP為能源轉運各種底物的膜相關蛋白。巨噬細胞和肝細胞中ABCAl的功能最為突出:其以膽固醇為底物在細胞內脂質清除過程中起外排泵的作用。ABCAl基因突變與Tangier病和家族性高密度脂蛋白缺乏癥有密切關系。巨噬細胞攝取的氧化型脂蛋白膽固醇以游離膽固醇的形式通過ABCAl介導外排與脂質缺乏的apoA-Ι結合形成前β-HDL(pre-β -HDL)，這一過程是RCT的第一個限速環節，對脂質代謝和動脈粥樣硬化的發生發展具有重要影響。
[0006]低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)主要功能是通過攝取膽固醇進入細胞內，用于細胞增殖和固醇類激素及膽汁酸鹽的合成等。LDL或其他含ApoBlOO, E的脂蛋白如VLDL、β -VLDL均可與LDL受體結合，內吞入細胞使其獲得脂類，主要是膽固醇，這種代謝過程稱為LDL受體途徑(LDL receptor pathway),該途徑依賴于LDL受體介導的細胞膜吞飲作用完成。LDLR基因的突變導致常染色體顯性遺傳性疾病及家族性高膽固醇血癥。
[0007]過氧化物酶體增殖物激活受體Y (peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma, PPAR- y or PPARG)可與維甲酸 X 受體(retinoid X receptors, RXRs)形成異源二聚體調節多種基因的轉錄。PPAR-Y對脂肪細胞分化具有重要的調節作用。此外，PPAR- Y還與許多病理過程密切相關，如肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化和癌癥。近來的研究發現，PPAR-y可調控干預巨噬細胞內膽固醇和脂質的平衡，進而影響動脈粥樣硬化的進程，這一調控過程與多個脂蛋白受體有關。研究表明，PPAR-Y可能通過抑制轉錄因子活化蛋白-1 (activation protein-1, ΑΡ-l)的活性，抑制清道夫受體 SR-A (scavenger receptorA)的表達，導致巨噬細胞攝取脂蛋白能力下降。在已分化的巨噬細胞，PPAR-Y配體還誘導SR-BI的表達，促進膽固醇從泡沫細胞外流。另有研究提示，PPAR- Y還可通過誘導ABCAl和SR-BI，刺激膽固醇逆向轉運的關鍵步驟，從而促進膽固醇外流。
[0008]微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類高度保守的單鏈非編碼小RNA，由約20-22個單核苷酸組成，廣泛存在于真核生物中，參與轉錄后水平或翻譯水平的調控。microRNA在真核生物基因調控中起著重要作用，廣泛參與了細胞增殖、分化、發育、代謝、凋亡等多種基本生命活動。microRNA具有高度保守性、時序性和組織特異性等特征，通過與靶基因不完全互補結合，每個microRNA都具有調節多個mRNAs的潛能。microRNA表達水平的穩定對于生命體正常生理機能的發揮以及維持新陳代謝的動態平衡至關重要。
[0009]近年研究發現，HiiCT0RNA除了調控正常生理過程，對于腫瘤、糖脂代謝性疾病等眾多病理過程中同樣非常重要，在疾病的診斷與治療中可能發揮關鍵性作用。microRNA在調控心血管系統的發育中及其病理過程中起重要作用，心肌肥厚、心臟衰竭、心肌梗死后重構和血管重塑等多種心血管疾病狀態下，呈現出高度特異的microRNA表達模式。不同病理狀態下，microRNA的表達譜不盡相同。腫瘤及心血管疾病等各種疾病狀態下，差異表達的特異microRNA可作為生物學標記應用于各種疾病的診斷與分型。microRNA相關的疾病數據庫也已經陸續建立起來。miciORNA的細胞靶點與心血管疾病表型的相關性研究，闡明了新的生物學途徑和病理機制。
[0010]microRNA表達量的增加或減少均能引發嚴重的病理后果，因此穩定靶器官中相應microRNA表達水平可能成為疾病治療的一個新思路。在生物體內使用寡核苷酸抑制劑或microRNA，改變內源性microRNA豐度，人為控制體內單個或多個microRNA水平，使得以microRNA為基礎的治療策略應用于臨床成為可能。如果這些方法能夠安全有效的運用于人體,將大大促進心血管疾病等人類重大疾病問題的解決。

【發明內容】

[0011]本發明采用SiRNA基因沉默技術將microRNA生成過程中的兩個關鍵酶Dicer和Drosha表達抑制以后，膽固醇的逆向轉運過程中的關鍵分子SR-BI基因mRNA水平顯著上調。這提示microRNA在SR-BI表達調控中發揮重要作用。對預測的miRNAs的作用進行檢測篩選，最終獲得3個能夠顯著降低肝細胞SR-BI基因mRNA水平的miRNAs:microRNA-96(miR-96)、microRNA-185 (miR-185)和 microRNA-223 (miR-223)。進一步對這 3 個 miRNAs的生物學活性進行檢測，證實了這三種microRNA或其抑制劑對于脂代謝過程中相關蛋白的調控作用，由此完成了本發明。
[0012]本發明一個方面涉及微小RNA (microRNA, miRNA)的抑制劑在制備調節脂代謝的藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
[0013]本發明另一方面涉及微小RNA的抑制劑在制備預防或治療脂代謝相關疾病的藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種；其中所述脂代謝相關疾病例如為脂代謝紊亂導致的高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥等)、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
[0014]本發明另一方面涉及組合物，其含有微小RNA的抑制劑，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種，所述組合物用于調節脂代謝，或者用于預防或治療脂代謝相關疾病，所述脂代謝相關疾病例如為脂代謝紊亂導致的高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥等)、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
[0015]本發明另一方面涉及微小RNA用于下調細胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體(SR-BI)表達水平的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和
miRNA-223中的一種、兩種或三種。
[0016]本發明另一方面涉及微小RNA的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中人B族I型清道夫受體表達水平的制劑中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或二種。
[0017]本發明另一方面涉及miRNA-96和/或miRNA-223用于下調細胞(例如離體的或在體的)中ATP結合盒轉運蛋白Al (ABCAl)表達水平的用途。
[0018]本發明另一方面涉及miRNA-96和/或miRNA-223的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中ATP結合盒轉運蛋白Al表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中ATP結合盒轉運蛋白Al表達水平的制劑中的用途。
[0019]本發明另一方面涉及miRNA-185用于下調細胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達水平的用途。
[0020]本發明另一方面涉及miRNA-185的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達水平的制劑中的用途。
[0021]本發明另一方面涉及miRNA-96用于下調細胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達水平的用途。
[0022]本發明另一方面涉及miRNA-96的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達水平的制劑中的用途。
[0023]本發明另一方面涉及微小RNA的抑制劑在制備用于提高哺乳動物體內高密度脂蛋白(HDL)水平和/或降低血液中低密度脂蛋白(LDL)、膽固醇、甘油三酯水平的制劑或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
[0024]本發明另一方面涉及上調細胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體、ATP結合盒轉運蛋白Al、低密度脂蛋白受體或過氧化物酶體增殖物激活受體Y表達水平的方法，所述方法包括給細胞施用微小RNA的抑制劑的步驟，或者包括將細胞與微小RNA的抑制劑相接觸的步驟，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或二種。
[0025]本發明另一方面涉及一種篩選用于調節脂代謝、或者用于預防或治療脂代謝相關疾病的藥物的方法，所述方法包括篩選miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223的抑制劑的步驟；優選地，所述方法包括根據miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別設計其反義RNA，或者將miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別與候選物質接觸，分別檢測各微小RNA的表達，并選擇特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達的物質。
[0026]根據上述任一方面任一項的用途、方法或組合物，其中所述的微小RNA的抑制劑可以是能夠抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223對靶基因的調控作用的任何物質，可以是在細胞中抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達的物質，也可以是與各miRNA具有特異性相互作用，例如與各miRNA特異性結合的物質，或者抑制各miRNA與Dicer或RISC的相互作用的物質。
[0027]根據上述任一方面任一項的用途、方法或組合物，所述的微小RNA或其抑制劑也可用于上述相關疾病或相關蛋白功能機理研究的工具藥物。
[0028]以下對本發明進行詳述。
[0029]在本發明中，所述調節脂代謝是指降低哺乳動物體內膽固醇水平、甘油三酯水平和/或低密度脂蛋白水平，和/或提高高密度脂蛋白水平。
[0030]在本發明中，所述脂代謝相關疾病包括動脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是心肌梗塞、中風)、阿爾茨海默癥、高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥)、肥胖、糖尿病和代謝綜合征。
[0031]在本發明中，所述微小RNA的抑制劑具有本領域公知的含義，其可以是能夠特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223對靶基因的調控作用的任何物質，可以是在細胞中特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達的物質，也可以是與各miRNA具有特異性相互作用，例如與各miRNA特異性結合的物質，或者特異性抑制各miRNA與DICER或RISC的相互作用的物質。
[0032]在本發明的實施方案中，所述微小RNA的抑制劑(反義寡核苷酸抑制劑，ant1-miR)是指化學合成及修飾的、與特異miRNA序列(特別是核心序列,例如第2_8個核苷酸)互補、特異性抑制內生miRNAs功能的單鏈核酸分子,通過特異的祀向單個miRNA分子，從而削弱內源miR NA對其祀基因的調控作用，影響祀基因的表達(Stenvang J, PetriA, Lindow Mj Obad S，Kauppinen S.，Inhibition of microRNA function by antimiRoligonucleotides，Silence.2012Jan9;3(I): 1.do1:10.1186/1758-907X-3-1.)。 反義寡核苷酸抑制劑可以有不同的長度和化學修飾，如磷酸骨架的硫代修飾，核糖的2’ -O-烷基化修飾，包括2’ -O-甲基、2’ -O-甲氧乙基、2’ -F等，以及肽核酸(peptide nucleicacid, PNA)、鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)等修飾。[0033]當用于上述用途時，所述微小RNA或其抑制劑可以單獨使用，也可以與其它分子連接后使用，例如與膽固醇、靶細胞受體等連接，或者連接入載體后使用。
[0034]在本發明中，所述細胞是指含有miR-96、miR-185或miR-223作用位點、受miR-96、miR-185、miR-223或其抑制劑調控的細胞，特別是通過miR-96、miR-185、miR-223或其抑制劑能夠調控其SR-BI蛋白或其它膽固醇或脂代謝相關蛋白的細胞。在本發明的實施方案中，所述細胞包括肝細胞(例如肝實質細胞)、單核巨噬細胞以及肝臟、腎臟、心臟、腸道、肺和脾臟組織內的細胞。
[0035]在本發明中，所述上調或下調細胞中某蛋白的表達水平是指上調或下調細胞中某蛋白的mRNA水平或蛋白質水平；其中所述的上調或下調是與未進行干預的細胞進行比較。
[0036]在本發明的實施方案中，結合實時定量RT-PCR和流式細胞技術，證實在肝細胞中miR-96、miR-185和miR-223均能顯著下調SR-BI基因mRNA水平和蛋白水平的表達，而它們的反義寡核苷酸抑制劑則具有相反的作用。進而利用流式細胞術分析細胞對Di1-HDL的攝取發現:miR-96、miR-185和miR-223均能顯著抑制肝細胞對Di1-HDL的攝取作用，而相應的反義寡核苷酸抑制劑則具有相反的作用。其中，當SR-BI基因沉默后，miR-185抑制肝細胞對Di1-HDL攝取的作用消失。證明miR-96、miR-185和miR-223能夠有效調節膽固醇逆轉運過程中的關鍵分子SR-BI。
[0037]在本發明的實施方案中，為確定這些miRNAs的作用位點，利用PCR技術擴增獲得不同長度的SR-BI基因3’非翻譯區(3’ UTR)片段以及相應miRNAs作用位點缺失的SR-BI基因3’ UTR片段，并將這些片段構建到熒光素酶報告基因下游，通過轉染H印G2細胞后熒光素酶活性檢測發現，miR-96、miR-185和miR-223均能夠顯著抑制熒光素酶報告基因的表達，并利用核苷酸缺失的方法確定了其結合位點，miR-96、miR-185和miR-223位于SR-BI基因3’ UTR片段的不同區 域。聯合作用結果證明，miR-96、miR-185和miR-223之間存在協同作用，共同調控SR-BI基因轉錄后水平的表達。
[0038]在本發明的實施方案中，檢測了小鼠不同組織中miR-96和miR-185的分布情況。miRNAs定量分析結果顯示，miR-96和miR-185在小鼠肝臟中均有一定水平的分布。進一步檢測了高脂飲食飼養的ApoE基因敲除小鼠肝臟中miR-96和miR-185的表達情況，結果顯示，與正常飲食飼養小鼠相比，高脂飲食飼養鼠的血清總膽固醇水平和LDL膽固醇水平顯著升高，呈現高脂血癥特征，同時肝臟SR-BI表達顯著增加，而miR-96和miR-185的表達水平顯著降低。這種負相關性也進一步佐證了這些miRNAs與SR-BI之間的調控關系。
[0039]鑒于巨噬細胞在SR-BI參與的膽固醇逆轉運過程中的關鍵作用，在本發明的實施方案中，檢測了 miR-96、miR-185和miR-223在佛波酯(PMA)誘導的人單核巨噬細胞THP-1細胞中的分布和作用。結果顯示，在巨噬細胞(PMA誘導的THP-1)中，miR-185和miR-96均可顯著降低SR-BI的mRNA水平，而miR-223沒有明顯變化。
[0040]在本發明的實施方案中，檢測了 miR-96、miR-185和miR-223，尤其是miR-185和miR-96對其他相關預測靶基因的調控作用。對RCT第一個限速環節的關鍵分子ABCAl研究表明，ABCAl基因3’UTR上存在miR-96和miR-223作用位點各一個。多物種序列比對結果證實它們具有高保守性。利用小分子RNA轉染和Real-time RT-PCR技術分析表明，在肝細胞中miR-96和miR-223能顯著下調ABCAlmRNA水平，它們的反義寡核苷酸抑制劑能顯著上調ABCAlmRNA水平。這證實miR-96和miR-223能夠有效調節ABCAl。[0041] 在本發明的實施方案中，對LDLR的研究表明，LDLR3’UTR上存在兩個miR-185作用位點，多物種序列比對結果證實此位點非常保守。利用小分子RNA轉染和Real-timeRT-PCR技術分析表明，在肝細胞中miR-185能顯著下調LDLR mRNA水平，它們的反義寡核苷酸抑制劑能顯著上調LDLRmRNA水平。這證實miR-185能夠有效調節LDLR。
[0042]在本發明的實施方案中，對于調節膽固醇和脂質代謝平衡的重要轉錄因子PPAR- Y的研究表明，其3’UTR上存在一個miR-96作用位點，多物種序列比對結果證實此位點非常保守。利用小分子RNA轉染和Real-time RT-PCR技術分析表明，在肝細胞中miR-96能顯著下調PPAR- Y mRNA水平，它們的反義寡核苷酸抑制劑能顯著上調PPAR- y mRNA水平。證實miR-96能夠有效調節PPAR- Y。
[0043]發明的有益效果
[0044]本發明證實了 miR-96、miR-185、miR-223作用于脂代謝過程中的一系列重要靶點，在脂代謝調節過程中發揮重要作用。可以將miR-96、miR-185、miR-223作為藥物組成成分或生物標志物，或將其作為新型藥物作用靶點應用其抑制劑作為藥物組成成分，應用于預防或治療脂代謝紊亂導致的高脂血癥、動脈粥粥樣硬化、冠心病等相關疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1 Dicer或Drosha基因沉默對SR-BI mRNA水平的影響；
[0046]其中左圖為Dicer或Drosha基因沉默后SR-BI mRNA的水平；
[0047]中圖為Drosha基因沉默后Drosha mRNA的水平；
[0048]右圖Dicer基因沉默后Dicer mRNA的水平；
[0049]Scr-si 表示 siRNA 對照序列(invitrogen，12935-200，12935-300，12935-400)，Drosha-si (invitrogen, HSS120887)表不 Drosha 基因沉默組，Dicer-si (invitrogen,HSS118719)表示Dicer基因沉默組。
[0050]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 scr-si 相比。
[0051]圖 2 SR-BI3’ UTR 上的 mirR-96、miR-185、miR223 的預測靶位點。
[0052]圖3 SR-BI3’ UTR上存在的miR-96、miR-185和miR-223預測靶點在多個物種中呈現的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Mml稱猴；Ssc豬；Bta牛；Eca馬；Cfa犬；Fca貓；Mmu小鼠；Cpo豚鼠；Rno褐家鼠；0cu兔；Ete猬)
[0053]圖4 miR-96、miR-185和miR-223及其拮抗劑對SR-BI mRNA和蛋白表達水平的調控作用；其中，
[0054]A表示Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑瞬時轉染miR-185及其反義寡核苷酸抑制劑至人肝癌細胞IfepG2或Bel-7402和人正常肝細胞HL-7702，作用不同時間后測定的SR-BI mRNA和蛋白水平；
[0055]B表不Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑瞬時轉染miR-96、miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞HepG2后，SR-BI mRNA及蛋白表達水平的變化。
[0056]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001，與 ctl-miR(miR)相比;#P<0.05,與ctl-miR(ant1-miR)相比。(其中圖A中的con miR與圖B中的ctl_miR相同)
[0057]圖5 miR-96、miR-185 和 miR-223 與 SR-BI3’ UTR 直接作用位點確證；其中，
[0058]A表明當SR-BI3’ UTR片段中存在miR-185的相應預測靶點時，miR-185能夠顯著降低熒光素酶報告基因表達活性；當SR-BI3’ UTR片段中不存在miR-185的相應預測靶點時，miR-185不呈現降低熒光素酶報告基因表達活性的效應；
[0059]B表明當SR-BI3’ UTR片段中存在miR-96和miR-223的相應預測靶點時，miR-96和miR-223能夠顯著降低熒光素酶報告基因表達活性；
[0060]C表明miR-96、miR-185和miR-223單獨或聯合作用時對熒光素酶報告基因表達活性的效應，證實這些miRNAs之間存在協同作用；
[0061]其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑(反義寡核苷酸抑制劑)，ctl-miR表示對照miRNA (5，-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’，SEQ ID NO:7), pc-luc 表示不含有 SR-BI3’ UTR的對照質粒；U1對應的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段(959bp)的全長，U2對應的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第120-959bp，U3對應的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第312-959bp ；U4對應的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第498_959bp ；U5對應的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第664-959bp ；U6對應的核苷酸序列為SR-BI3’ UTR片段中第870-959bp ；WT代表野生SR-BI3，UTR片段，DELl代表缺失了 miR-185結合位點I的SR-BI3’ UTR片段，DEL2代表缺失了 miR-185結合位點2的SR-BI3’ UTR片段。
[0062]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 ctl-miR 相比;#P〈0.05，##Ρ〈0.01，與野生載體相比。
[0063]圖6 miR-96、miR-185 和 miR-223 對肝細胞 Dil-HDL 攝取的影響；
[0064]A:Lipofectamine RNAiMAX reagent瞬時轉染miR-185或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞H印G2、Bel-7402和正常肝實質細胞HL-7702，作用72小時后，在2 μ g/mLDil-HDL中孵育4小時后，流式細胞檢測肝細胞對Dil-HDL的攝取；
[0065]B:Lipofectamine RNAiMAX reagent 瞬時轉染 miR-96、miR-223 或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞H印G2，作用72小時后，在2μ g/mLDil-HDL中孵育4小時后，流式細胞檢測肝細胞對Dil-HDL的攝取；
[0066]ctl-miR 表不對照 miRNA, ant1-miR 表不 miRNA 的拮抗劑；
[0067]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001，與 ctl-miR(miR)相比；#Ρ〈0.05，與 ctl-miR(ant1-miR)相比。
[0068]圖7 SR-BI基因在miR-185介導的抑制肝細胞攝取Dil-HDL過程中的作用；其中ctl-miR表示對照miRNA，scr-si表示siRNA對照，SR-B1-si表示SR-BI基因沉默組。
[0069]**P<0.01,***P<0.001, NS,沒有顯著差異。
[0070]圖8 ABCA13’ UTR 上存在的 miR-96 和 miR-223 預測靶點。
[0071]圖9 ABCA13’UTR上存在的miR-96和miR-223預測靶點在多個物種中呈現的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ame大熊貓；Mmu小鼠)。
[0072]圖10 miR-96,miR-223及其拮抗劑對ABCAlmRNA水平的調節作用；其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑，ctl-miR表示miRNA對照。
[0073]**Ρ〈0.01,與 ctl-miR(miR)相比;##Ρ〈0.01,與 ctl-miR(ant1-miR)相比。
[0074]圖11 LDLR3’ UTR上存在的兩個miR-185預測靶點。
[0075]圖12 LDLR3’ UTR上存在的miR-185預測靶點在多個物種中呈現的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Bta牛)。
[0076]圖13 miR-185及其拮抗劑對LDLR mRNA水平的調節；其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑，ctl-miR表示miRNA對照。[0077]**Ρ〈0.01，與 ctl-miR (miR)相比;#P<0.05，與 ctl-miR (ant1-miR)相比。
[0078]圖14 PPAR- Y 3’ UTR上存在的一個miR-96預測靶點。
[0079]圖15 PPAR- Y 3’ UTR上存在的miR-96預測靶點在多個物種中呈現的序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ssc豬；Bta牛；Fca貓；Mmu小鼠；Rno褐家鼠；Gga 雞)。
[0080]圖16 miR-96及其拮抗劑對PPAR- y mRNA水平的調節；其中ant1-miR表示miRNA的拮抗劑，ctl-miR表示miRNA對照。
[0081]**Ρ〈0.01,與 ctl-miR(miR)相比;##Ρ〈0.01,與 ctl-miR(ant1-miR)相比。
[0082]圖17高脂飼養小鼠肝臟中miR-96和miR-185的表達水平，其中第一幅圖表示小鼠體重，第二幅圖表不總膽固醇水平，第二幅圖表不LDL水平,第四幅圖表不miR-96和miR-185的豐度，chow表示正常飲食喂養組，HFD表示高脂飲食喂養組。
[0083]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 ctl-miR 相比。
[0084]圖18 miR-96、miR-185 和 miR-223 對巨噬細胞 SR-BI mRNA 水平和 Dil-HDL 攝取的影響，ctl-miR表示miRNA對照,chow表示正常飲食喂養組,HFD表示高脂飲食喂養組。
[0085]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，n=6 (chow) and n=5 (HFD)。 [0086]圖19 HDL對miR-185和SR-BI mRNA水平的調節，其中veh表示溶劑對照。
[0087]*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與 veh(miR_185)相比；#Ρ〈0.05，與 veh (SR-BI)相比。
[0088]圖20 miR-96、miR-185或miR-223在ApoE基因敲除小鼠不同組織或細胞中的分布；其中
[0089]A表示miR-96、miR-185在不同組織(肝、腎、心臟、腸道、肺和脾)中的豐度，
[0090]B表示miR-96、miR-185或miR-223在不同細胞(人肝癌細胞H印G2、Bel-7402、正常肝實質細胞HL-7702和PMA誘導24小時后的巨噬細胞THP-1)中的豐度。
【具體實施方式】
[0091]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0092]材料和方法
[0093]I 材料 [0094]L I質粒、細胞株和動物真核細胞表達載體pGL3_Basic和pcDNA3.1均為美國Promega公司產品；人肝癌細胞株H印G2、Bel_7402和HL-7702為本實驗室保存(其中H印G2購自ATCC，HB-8065，后兩者購自中國醫學科學院基礎研究所);ApoE敲除小鼠購自北京大學
醫學部。
[0095]1.2主要試劑DNA細胞裂解液及突光素酶檢測系統(Luciferase Assay System)、RNA提取試劑盒(SV Total RNA Isolation System)均購自美國Promega公司；轉染試劑 (Lipofectamine?2000)、逆轉錄試劑盒(SuperScript III First-Strand)均購自美國Invitrogen 公司；實時突光定量 RT-PCR 試劑盒(FastStart Universal SYBR Green PCRMaster)購自Roche公司；小RNA提取試劑盒(miRNeasy Mini Kit)、小RNA逆轉錄試劑盒(miScript II RT Kit)、熒光定量檢測試劑盒(miScript SYBR Green PCR Kit)均購自美國Qiagen公司；MEM細胞培養基購自美國Thermo公司；胎牛血清、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和G418抗生素購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。
[0096]1.3 儀器 MiniCycle PTC-200 型 PCR 儀為美國 MJ Research 公司產品；EnVision多功能微孔板檢測儀為美國PerkinElmer公司產品；實時熒光定量PCR儀iQ5MultiColorReal-Time PCR 為 Bio-Rad 公司產品。
[0097]2 方法
[0098]2.lpc-luc-3’ UTR重組質粒的構建將通過PCR獲得的CLA-13’ UTR序列(NM_005505)克隆至pc-luc質粒(將熒光素酶報告基因插入pcDNA3.1質粒載體多克隆位點中，構建質粒pc-luc)突光素酶報告基因下游,獲得重組質粒pc-luc-3’UTR。測序鑒定。
[0099]2.2細胞培養及轉染IfepG2等細胞培養于含10%胎牛血清、lmmol/L丙酮酸鈉和I %非必需氨基酸的MEM培養基中，于3 7 °C、5%C02條件下培養。轉染用質粒的提取方法按 PureYi el d?P lasmid Midiprep System 試劑盒說明書進行。將 IXlO5 個 HepG2細胞接種于30mm培養皿中，待細胞貼壁生長匯聚程度達到80%左右時，利用脂質體Lipofectamine?2000 或 Lipofectamine RNAiMAX 將 pc_luc_3’ UTR 或 miRNAs 瞬時轉染至HepG2細胞，轉染相應時間后后進行檢測。
[0100]2.3實時熒光定量PCR提取細胞的總RNA，采用試劑盒SuperScript IIIFirst-Strand (Invitrogen)或miScript II RT Kit 合成 cDNA,米用 2><TaqMan? GeneExpression Master Mix 或miScript SYBR Green PCR Kit 進行突光定量PCR反應,利用數據分析軟件分析并計算Ct值。以GAPDH或U6為內參，采用相對Ct的方法對熒光素酶基因的轉錄水平進行定量。
[0101]2.4細胞表面蛋白表達水平檢測將細胞以I X IO5個/ml的密度接種于24孔細胞培養板中，處理后消化收集細胞，4%多聚甲醛固定細胞4h，以Iml含5%FBS的PBS將細胞重懸并于4。C靜置15min,分別加入一抗(1:500)、FITC標記二抗(1:1000)各孵育50min,PBS漂洗后于300目尼龍膜過濾，經流式細胞儀檢測。各組細胞樣品的平均檢測細胞數為10，000個，每組細胞的相對熒光強度以對數積分圖表示。
[0102]2.5細胞攝取Di1-HDL功能檢測利用流式細胞儀檢測化合物對細胞攝取Di1-HDL的影響。HepG2等細胞傳代后以I X IO5個/ml的細胞密度接種于24孔細胞培養板上，處理后，加入2μg/ml Di1-HDL于37° C孵育4h。消化收集細胞并重懸于700 μ I PBS中，過300目尼龍網后經流式細胞儀檢測細胞熒光值。每個樣品平均檢測10，000個細胞，每組細胞的相對熒光強度用對數積分圖表示。
[0103]miRNA的篩選過程
[0104]預測miRNA分別轉染HepG2細胞，利用實時熒光定量RT-PCR檢測miRNA對SR-BI表達的影響。
[0105]篩選到的miRNA為miR-96、miR-185和miR-223，其序列分別為:
[0106]hsa-miR-96
[0107]5，- uuuggcacuagcacauuuuugcu-3，(SEQ ID NO:1)
[0108]hsa-miR-185
[0109]5，-uggagagaaaggcaguuccuga-3’ (SEQ ID NO:2)[0110]hsa-miR-223
[0111]5，-ugucaguuugucaaauacccca-3’ (SEQ ID NO:3)
[0112]本發明的miRNA 購自 QIAGEN 公司，hsa-miR-96 為 Cat.n0.MSY0000095，hsa-miR-185 為 Cat.n0.MSY0000455, hsa-miR-223 為 Cat.n0.MSY0004570。
[0113]實施例1, miR-96、miR-185和miR-223調節昍固醇逆轉運的重要靶點SR-BI。
[0114]1.1、Dicer和Drosha基因沉默對SR-BI mRNA水平的影響
[0115]用siRNA基因沉默 技術敲除microRNA生物合成過程中的兩個關鍵酶Dicer和Drosha 后，Real-time RT-PCR 法檢測 SR-BI mRNA 水平。
[0116]實驗結果表明，Dicer或Drosha基因沉默后，SR-BI mRNA水平顯著上調，說明microRNA參與了 SR-BI的調控(如圖1所示)。
[0117]1.2,miR-96,miR-185和miR-223及其拮抗劑對SR-BI mRNA和蛋白表達水平的調控作用。
[0118]本發明的miRNA拮抗劑(ant1-miR)購自QIAGEN公司，其序列和貨號分別為:
[0119]ant1-miR-96 (Cat.n0.MIN0000095)
[0120]5，- agcaaaaaugugcuagugccaaa - 3，(SEQ ID NO:4)
[0121]ant1-miR-185 (Cat.n0.MIN0000455)
[0122]5，- ucaggaacugccuuucucucca - 3，(SEQ ID NO:5)
[0123]ant1-miR-223 (Cat.n0.MIN0004570)
[0124]5，- ugggguauuugacaaacugaca - 3，(SEQ ID NO:6)
[0125]miRNA拮抗劑對照購自QIAGEN公司，其貨號為Cat.n0.1027271。
[0126]Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑瞬時轉染 miR-96、miR-185、miR-223 及其反義寡核苷酸抑制劑至人肝癌細胞H印G2或Bel-7402和人正常肝細胞HL-7702，作用48或72小時后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細胞總RNA, cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉錄，Real-time RT-PCR 法測定 SR-BI mRNA 水平。Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑瞬時轉染miR-96、miR-185、miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞H印G2、Bel-7402和正常肝實質細胞HL-7702，作用48或72小時后，流式細胞儀檢測SR-BI蛋白表達水平變化。
[0127]實驗結果表明，肝細胞中miR-96、miR-185和miR-223均能顯著下調SR-BI mRNA和蛋白表達水平(如圖5所示)。
[0128]1.3、靶向SR-BI基因3’ UTR的miRNA預測及靶位點同源性分析
[0129]MicroRNA.0rg (http: //www.microrna.0rg)和 TargetScan (http://www.targetscan.0rg)等在線軟件預測miR-96、miR-185和miR-223等miRNAs直接作用于SR-BI3，UTR (NM_005505)o利用Clustal X2軟件對多個物種的SR-BI3，UTR序列進行比對。
[0130]預測結果如圖2所示，SR-BI3’UTR上存在miR-96和miR-223預測靶位點各一個，存在miR-185預測靶位點兩個。序列比對結果如圖3所示，SR-BI3’ UTR上存在的miR-96、miR-185和miR-223預測靶點在多個物種中呈現序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Mml獼猴；Ssc豬；Bta牛；Eca馬；Cfa犬；Fca貓；Mmu小鼠；Cpo豚鼠；Rno褐家鼠；0cu兔；Ete猬)。
[0131]1.4、miR-96、miR-185 和 miR-223 與 SR-BI3’ UTR 直接作用位點確證。
[0132]將熒光素酶報告基因插入pcDNA3.1質粒載體多克隆位點中，構建質粒pc-luc。按miR-96、miR-185和miR-223預測靶點的位置，PCR法分段擴增不同長度的SR-BI3’ UTR片段或者使用overlap PCR法將SR-BI3’UTR上miR-185預測靶點刪除，得到的一系列不同長度的SR-BI3’UTR片段插入至pc-luc質粒載體熒光素酶報告基因下游。瞬時轉染法，使用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑將所構建的含有一系列SR_BI3’UTR片段的pc-luc質粒載體與miR-96、miR-185和miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑轉染至H印G2細胞，作用48小時后，突光素酶報告基因分析技術檢測突光素酶報告基因表達活性。
[0133]如圖4所示的實驗結果表明:當SR-BI3’ UTR片段中存在miR-96、miR-185和miR-223的相應預測靶點時，miR-96、miR-185和miR-223能夠顯著降低熒光素酶報告基因表達活性；當SR-BI3’ UTR片段中不存在miR-96、miR-185和miR-223的相應預測靶點時，miR-96、miR-185和miR-223不呈現降低熒光素酶報告基因表達活性的效應。實驗結果確證了 miR-96、miR-185和miR-223在SR-BI基因3’ UTR上的作用靶位點。進一步實驗證實這些miRNAs之間存在協同作用。
[0134]1.5,miR-96,miR-185和miR-223對肝細胞攝取Dil-HDL (Dil熒光標記的高密度脂蛋白)的影響。
[0135]Lipofectamine RNAiMAX reagent (Invitrogen)瞬時轉染 miR-96、miR-185、miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞H印G2、Bel-7402和正常肝實質細胞HL-7702,作用72小時后，在2 μ g/mL Dil-HDL中孵育4小時后，流式細胞檢測肝細胞對Dil-HDL的攝取。
[0136]實驗結果顯示:轉染miR-96、miR-185、miR-223后，肝細胞Dil-HDL攝取明顯降低；轉染miR-96、miR-185、miR-223的反義寡核苷酸抑制劑后，三種肝細胞的Dil-HDL攝取明顯升高。表明miR-96、miR-185、miR-223能夠抑制肝細胞對HDL的攝取，而miR-96、miR_185、miR-223的反義寡核苷酸 抑制劑能夠增加肝細胞對HDL的攝取(如圖6所示)。
[0137]1.6、SR-BI基因在miR-185介導的抑制肝細胞攝取Dil-HDL過程中的作用。
[0138]用siRNA基因沉默技術敲除SR-BI基因后，HepG2細胞SR-BI蛋白表達顯著降低。瞬時轉染miR-18572小時后，2 μ g/mL Dil-HDL中孵育4小時后，流式細胞術檢測肝細胞Dil-HDL 攝取。
[0139]如圖7所示實驗結果表明，SR-BI基因沉默后，miR-185下調Dil-HDL攝取的作用消失，證明miR-185通過SR-BI基因發揮抑制肝細胞攝取Dil-HDL的作用。
[0140]實施例2, miR-96和miR-223對昍固醇逆轉運的重要靶點ABCAl的調節。
[0141]2.1、miR-96、miR-223與ABCA13’ UTR作用靶點預測及同源性分析。
[0142]MicroRNA.0rg 和 TargetScan 預測 miR-96 和 miR-223 與 ABCA13’UTR 的作用位點。利用Clustal X2軟件對多個物種的ABCA13’ UTR的miR-96和miR-223預測靶點序列進行比對。
[0143]預測結果如圖8所示，ABCA13’ UTR上存在miR-96和miR-223預測靶點各一個。序列比對結果如圖9所示，ABCA13’ UTR上存在的miR-96和miR-223預測靶點在多個物種中呈現序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ame大熊貓；Mmu小鼠)。
[0144]2.2、miR-96、miR-223及其拮抗劑對ABCAlmRNA水平的調節作用
[0145]Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑瞬時轉染miR-96和miR-223或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞H印G2，作用72小時后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細胞總RNA，cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉錄，Real-time RT-PCR法測定mRNA水平。
[0146]實驗結果如圖10所示，miR-96和miR-223能顯著降低!fepG2細胞ABCAlmRNA水平，而其反義寡核苷酸抑制劑能顯著提高HepG2細胞ABCAlmRNA水平。
[0147]實施例3, miR-185及其桔杭劑對LDLR的調節。
[0148]3.1、miR-185與LDLR3’ UTR直接作用靶點預測及同源性分析。
[0149]MicroRNA.0rg 和 TargetScan 預測 miR-185 與 LDLR3’ UTR 的作用位點。利用Clustal X2軟件對多個物種的LDLR3’ UTR的miR-185預測靶點序列進行比對。
[0150]預測結果如圖11所示，LDLR3’UTR上存在miR-185預測靶點兩個。序列比對結果如圖12所示，LDLR3’ UTR上存在的miR-185預測靶點在多個物種中呈現序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Bta牛)。
[0151]3.2、miR-185及其拮抗劑對LDLR mRNA水平的調節
[0152]Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑瞬時轉染miR-185或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞H印G2，作用72小時后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細胞總RNA，cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉錄，Real-time RT-PCR法測定mRNA水平。
[0153]實驗結果如圖13所示，miR-185能顯著降低HepG2細胞LDLR mRNA水平，而其反義寡核苷酸抑制劑能顯著提高HepG2細胞LDLR mRNA水平。
[0154]實施例4, miR-96及其桔杭劑對PPAR- Y的調節。
[0155]4.1、miR-96與PPAR-Y 3’ UTR直接作用靶點預測及同源性分析。
[0156]MicroRNA.0rg 和 TargetScan 預測 miR-96 與 PPAR- Y 3’ UTR 作用位點。ClustalX2軟件對多個物種的PPAR- Y 3’ UTR的miR-96預測靶點序列進行比對。
[0157]預測結果如圖14所示，PPAR- Y 3’UTR上存在miR-96預測靶點。序列比對結果如圖15所示，PPAR- Y 3’ UTR上存在的miR-96預測靶點在多個物種中呈現序列保守性(Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab蘇門答臘黑猩猩；Ssc豬；Bta牛；Fca貓；Mmu小鼠；Rno褐家鼠；Gga雞)。
[0158]4.2、miR-96及其拮抗劑對PPAR- y mRNA水平的調節
[0159]Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑瞬時轉染miR-96或其反義寡核苷酸抑制劑至肝癌細胞H印G2，作用72小時后，RNA小量提取試劑盒(Promega)提取細胞總RNA，cDNA合成試劑盒(Invitrogen)逆轉錄，Real-time RT-PCR法測定mRNA水平。
[0160]實驗結果如圖16所示，miR-96能顯著降低HepG2細胞PPAR-Y mRNA水平，而其反義寡核苷酸抑制劑能顯著提高H印G2細胞PPAR- Y mRNA水平
[0161]實施例5, miR-96、miR-185和miR-223在脂代謝調節中的作用。
[0162]5.1、HDL 對 miR-185 和 SR-BI mRNA 水平的調節。
[0163]HDL孵育肝癌細胞IfepG2后，Real-time RT-PCR法測定miR-185的豐度和SR-BImRNA水平。
[0164]實驗結果表明，miR-185的豐度呈現明顯的劑量依賴性下調效應，而SR-BI mRNA水平呈現明顯的劑量依賴性上調效應(如圖19所示)。說明miR-185和SR-BI均參與到HDL介導的脂質調節過程。
[0165]5.2、miR-96、miR-185或miR-223在ApoE基因敲除小鼠不同組織或細胞中的分布。
[0166]取ApoE基因敲除小鼠的肝臟、腎臟、心臟、腸道、肺和脾等器官以及人肝癌細胞!fepG2、Bel-7402、正常肝實質細胞HL-7702和PMA誘導24小時后的巨噬細胞THP-1等細胞系，Real-time RT-PCR法測定miR-96、miR-185和miR-223在不同組織或細胞中的豐度。
[0167] 實驗結果顯示，miR-185和miR-96在小鼠肝臟、腎臟和心臟等器官及人肝細胞和巨噬細胞等細胞系中均呈現高表達，而miR-223在人巨噬細胞中呈現高表達(如圖20所示)。
[0168]5.3、高脂飼養小鼠肝臟中miR-96和miR-185的表達水平。
[0169]ApoE基因敲除小鼠高脂飼料喂養8周，眼眶取血測定其血清總膽固醇水平和LDL膽固醇水平。同時取肝臟，Real-time RT-PCR法(Qiagen)測定miR-96和miR-185的豐度。
[0170]ApoE基因敲除小鼠聞脂詞料喂養8周后，血清總膽固醇水平和LDL膽固醇水平明顯升高，肝臟miR-96和miR-185的表達明顯下調，而SR-BI的表達水平顯著升高(如圖17所示)。
[0171]5.4,miR-96,miR-185 和 miR-223 對巨噬細胞 SR-BI mRNA 水平和 Dil-HDL 攝取的影響。
[0172]Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑(Invitrogen)瞬時轉染 miR-96、miR-185、miR-223至PMA誘導24小時的巨噬細胞THP-1，作用72小時。Real-time RT-PCR法檢測SR-BI mRNA水平，或在2 μ g/mL Dil-HDL中孵育4小時后，流式細胞檢測巨噬細胞對Dil-HDL的攝取。
[0173]實驗結果顯示:轉染miR-96、miR-185和miR-223后，巨噬細胞SR-BImRNA水平均下調。轉染miR-185后，Dil-HDL攝取顯著降低，而轉染miR-96后，Dil-HDL攝取顯著升高(如圖18所示)。
[0174]盡管本發明的【具體實施方式】已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護范圍之內。本發明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
【權利要求】
1.微小RNA(microRNA, miRNA)的抑制劑在制備調節脂代謝的產品或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA_223中的一種、兩種或三種。
2.微小RNA的抑制劑在制備預防或治療脂代謝相關疾病的產品或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA_223中的一種、兩種或三種；其中所述脂代謝相關疾病例如為脂代謝素亂導致的聞脂血癥(特別是聞膽固醇血癥、聞甘油二酷血癥等)、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
3.組合物，其含有微小RNA的抑制劑，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種，所述組合物用于調節脂代謝，或者用于預防或治療脂代謝相關疾病，所述脂代謝相關疾病例如為脂代謝紊亂導致的高脂血癥(特別是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥等)、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病(特別是冠心病、心肌梗塞、中風等)、阿爾茨海默癥、肥胖、糖尿病或代謝綜合征等疾病。
4.微小RNA用于下調細胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體(SR-BI)表達水平的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
5.微小RNA的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中人B族I型清道夫受體表達水平的制劑中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
6.miRNA-96和/或miRNA-223用于下調細胞(例如離體的或在體的)中ATP結合盒轉運蛋白Al (ABCAl)表達水平的用途。
7.miRNA-96和/或miRNA-223的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中ATP結合盒轉運蛋白Al表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中ATP結合盒轉運蛋白Al表達水平的制劑中的用途。
8.miRNA-185用于下調細胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達水平的用途。
9.miRNA-185的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中低密度脂蛋白受體(LDLR)表達水平的制劑中的用途。
10.miRNA-96用于下調細胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體、(PPAR- Y )表達水平的用途。
11.miRNA-96的抑制劑用于上調細胞(例如離體的或在體的)中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-Y )表達水平的用途或者在制備用于上調細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR- Y )表達水平的制劑中的用途。
12.微小RNA的抑制劑在制備用于提高哺乳動物體內高密度脂蛋白(HDL)水平和/或降低血液中低密度脂蛋白(LDL)、膽固醇、甘油三酯水平的制劑或藥物中的用途，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
13.上調細胞(例如離體的或在體的)中人B族I型清道夫受體、ATP結合盒轉運蛋白Al、低密度脂蛋白受體或過氧化物酶體增殖物激活受體Y表達水平的方法，所述方法包括給細胞施用微小RNA的抑制劑的步驟，或者包括將細胞與微小RNA的抑制劑相接觸的步驟，所述微小RNA選自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一種、兩種或三種。
14.一種篩選用于調節脂代謝、或者用于預防或治療脂代謝相關疾病的藥物的方法，所述方法包括篩選miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223的抑制劑的步驟；優選地，所述方法包括根據miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別設計其反義RNA，或者將miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分別與候選物質接觸，分別檢測各微小RNA的表達，并選擇特異抑制 miRNA-96、miRNA-185 或 miRNA-223 表達的物質。
15.根據權利要求1-2、4-12任一項的用途、權利要求3的組合物、權利要求13或14的方法，其中所述的 微小RNA的抑制劑可以是能夠特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223對靶基因的調控作用的任何物質，可以是在細胞中特異抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表達的物質，也可以是與各miRNA具有特異性相互作用，例如與各miRNA特異性結合的物質，或者特異抑制各miRNA與DICER或RISC的相互作用的物質。
【文檔編號】A61P3/06GK103961706SQ201310035358
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優先權日:2013年1月30日
【發明者】洪斌, 王麗, 賈曉健, 姜華軍, 杜郁, 楊帆, 司書毅 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所