專利名稱：Ipv-dpt疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及混合疫苗，尤其是含有滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株(★一 H >株# 才々O 7 ) (sIPV)的混合疫苗以及該混合疫苗的制備方法。
背景技術：
脊髓灰質炎是脊髓灰質炎病毒引發的傳染病。對于人而言，脊髓灰質炎病毒是經口感染，并在腸道增殖，經血液進入中樞神經系統的。進入中樞神經系統的脊髓灰質炎病毒通過在大型運動神經細胞中增殖，引起運動神經細胞變性、壞死，導致四肢發生急性弛緩性麻痹。此外，脊髓灰 質炎病毒侵入延髓的呼吸中樞時，有時因呼吸麻痹而致死。為了抑制引發這些危重癥狀的脊髓灰質炎的發病，脊髓灰質炎疫苗廣為使用。可使用2種脊髓灰質炎疫苗:口服活脊髓灰質炎疫苗和滅活的脊髓灰質炎疫苗。口服活脊髓灰質炎疫苗是使用脊髓灰質炎病毒的弱毒株(沙賓株)的疫苗。口服給藥的脊髓灰質炎病毒弱毒株引發通常的感染。口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰質炎病毒在人腸道大量增殖，其結果，在腸道局部形成免疫。另外，口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰質炎病毒進入血液中，通過引發病毒血癥促進血中抗體的產生。但是由于脊髓灰質炎病毒弱毒株在中樞神經系統的增殖能力非常弱，通常不引起麻痹。此外，于被接種者的體內，在接種后約4 6周，口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰質炎病毒增殖，經排泄物排出。該排出的病毒感染被接種者周圍對脊髓灰質炎免疫弱或無免疫的人，則與被接種者的情況相同，顯示出賦予免疫或增強免疫的效果。但口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰質炎病毒弱毒株在被接種者體內反復增殖期間，或在被所述排出的病毒感染的人的體內反復增殖期間，有時發生向強毒性轉化的變異。在極少數情況下，該突變株導致疫苗相關的麻痹。滅活的脊髓灰質炎疫苗是將脊髓灰質炎病毒經福爾馬林滅活，失去感染力的疫苗。由于滅活的脊髓灰質炎疫苗不在被接種者體內增殖、不感染被接種者周圍的人，不會導致疫苗相關的麻痹。制備滅活的脊髓灰質炎疫苗時，以往使用強毒株，近年來逐漸開發了弱毒株(沙賓株)(Biologicals34(2006) 151-154，Dev Bil.Basel.Karger, 2001，vol.105，ppl63_169，臨床和病毒 Vol.30Νο.5 (2002.12) 336-343)。認為存在下述缺點:弱毒株(沙賓株)的增殖性稍弱于強毒株的增殖性。含有百日咳菌的保護性抗原(防御抗原)、白喉類毒素(y'7 7卜y 4卜'')、以及破傷風類毒素(破傷風卜々y 4卜'')的疫苗作為百日咳白喉破傷風混合疫苗而廣
泛使用。已知由無細胞性百日咳疫苗、白喉類毒素、破傷風類毒素以及滅活的脊髓灰質炎病毒構成的多價疫苗(特表2000-504032號公報)。VeiX)細胞是綠猴腎臟來源的傳代細胞，對各種病毒具有寬范圍的敏感性，廣泛用于病毒培養。文獻公開了培養腸道病毒71疫苗的制備方法,該方法包括在微載體(■ 4夕口々\ u 7 —)上培養Vero細胞，用所培養的Vero細胞使培養腸道病毒71增殖(Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivatedenterovirus type71vaccine development:Suh—Chin ffu,etc., Vaccine, 22, 3858-3864,2004)。文獻還公開了使用微載體的通常的細胞培養條件(Microcarrier cell cultureprinciples&methods:Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988)。

發明內容
在上述情況下，期望一種包括制備高效價的脊髓灰質炎病毒沙賓株的步驟，制備含有滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株(SlPV)和百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素(DPT)的混合疫苗的方法。為了解決上述問題，本發明者們經過潛心研究，結果發現通過在約4g/L 約6g/L的微載體存在下，培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞，可以制備高效價的脊髓灰質炎病毒沙賓株。基于這些發現，進行了反復研究，結果完成了本發明。gp，本發明提供:
(I) 一種混合疫苗的制備方法，所述混合疫苗含有(A)滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株、(B)百日咳菌的保護性抗原、(C)白喉類毒素、以及

(D)破傷風類毒素，該方法包括下述步驟:(a)在約4g/L 約6g/L的微載體存在下,培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞。(2)上述(I)所述的方法，其還包括下述步驟:(b)使脊髓灰質炎病毒沙賓株感染所述VeiO細胞的步驟，(c)使該脊髓灰質炎病毒增殖的步驟，(d)回收含有該脊髓灰質炎病毒的病毒液的步驟，以及(e)滅活該脊髓灰質炎病毒的步驟。(3)上述(I)所述的方法，其中，所述微載體的濃度為約5g/L。(4)上述⑴所述的方法，其中，所述微載體為葡聚糖制微載體。(5)上述(I)所述的方法，其中，使Veix)細胞增殖的步驟(步驟(a))以約3L以上的規模進行。(6)上述(I)所述的方法，其中，使Veix)細胞增殖的步驟(步驟(a))以約30L以上的規模進行。(7)上述(2)所述的方法還包括(d-2)將所述病毒液進行純化的步驟。(8)上述(7)所述的方法，其中，所述純化步驟(步驟(d-2))包括下述步驟:(i)將經所述步驟⑷回收的病毒液通過超離心進行沉淀〃卜)化、(ii)將該沉淀的重懸液進行超聲波處理、(iii)經柱色譜純化。
(9)上述(8)所述的方法，其中，所述(iii)經柱色譜純化的步驟只進行I次。(10)以上述⑴所述方法制備的疫苗。(11)上述(I)所述的方法，其中，培養Vero細胞的步驟(步驟(a))以約3L以上的規模進行。(12)上述(I)所述的方法，其中，培養Vero細胞的步驟(步驟(a))以約30L以上的規模進行。通過在約4g/L 約6g/L的微載體存在下，培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞，可以得到高效價的脊髓灰質炎病毒沙賓株。通過使用高效價的脊髓灰質炎病毒沙賓株，可以高效地制備滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株。于是，包括下述步驟的混合疫苗的制備方法(本發明的制備方法)作為制備含有滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株的混合疫苗的高效制備方法是很有用的，所述步驟為在約4g/L 約6g/L的微載體存在下，培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞。


圖1表示經微載體法培養Vero細胞時，Vero細胞的增殖曲線圖。3L表示初始細胞數約為2xl05細胞/mL(低濃度)，和3g/L的微載體。3H表示初始細胞數約為IOxIO5細胞/mL (高濃度)，和3g/L的微載體。5L表示初始細胞數約為2xl05細胞/mL (低濃度)，和5g/L的微載體。5H表示初始細胞數約為IOxIO5細胞/mL(高濃度)，和5g/L的微載體。圖2為表示用在各種條件下培養的VeiO細胞得到的I型脊髓灰質炎病毒的感染滴度(感染価)(病毒效價)的圖。3L表示初始細胞數約為2xl05細胞/mL(低濃度)，用3g/L的微載體培養的VeiO細胞得到的I型脊髓灰質炎病毒。5L表示初始細胞數約2xl05細胞/mL(低濃度)，用5g/L的微載體培養的VeiO細胞得到的I型脊髓灰質炎病毒。5H表示初始細胞數約IOxlO5細胞/mL(高濃度)，用5g/L的微載體培養的Vero細胞得到的I型脊髓灰質炎病毒。Ref.表示用綠猴腎臟細胞增殖的I型脊髓灰質炎病毒。本發明提供下述混合疫苗的制備方法，該方法包括可制備高效價的脊髓灰質炎病毒沙賓株的步驟，所述混合疫苗包含滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株(SlPV)和百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素(DPT)。以下，對本發明進行詳細說明。1.滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株(I)脊髓灰質炎病毒沙賓株在本說明書中，脊髓灰質炎病毒沙賓株是指來源于艾伯特B.沙賓博士(Dr.Albert B.Sabin)分尚的脊髓灰質炎病毒的弱毒株的脊髓灰質炎病毒株(參照SabinAB, Boulger LR.History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains.J.Biol.Standardl973, I, 115-118 等)。脊髓灰質炎病毒沙賓株中包括脊髓灰質炎病毒沙賓I型株、脊髓灰質炎病毒沙賓II型株以及脊髓灰質炎病毒沙賓III型株。作為脊髓灰質炎病毒沙賓I型株，可以列舉，LSc、2ab株等。作為脊髓灰質炎病毒沙賓II型株，可以列舉，P712、Ch、2ab株等。作為脊髓灰質炎病毒沙賓III型株，可以列舉，Leon, 12&1b株等。(2)滅活
在本說明書中，病毒的“滅活”是指使病毒失去感染能力。作為滅活的方法，可以列舉，使用物理方法(例如，使用X射線照射、熱、超聲波等的方法)、化學方法(例如，使用福爾馬林、汞、乙醇、氯等的方法)等，但并不限于這些方法。脊髓灰質炎病毒的滅活可用公知的方法進行(例如，參照BiologiCalS34(2006) 151-154等)。具體來講，例如，可通過將脊髓灰質炎病毒用福爾馬林處理進行滅活。(3)滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株的免疫原性滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株中通常混合存在被稱為D抗原以及C抗原的2種病毒抗原。D抗原為完全病毒粒子。D抗原對應的抗體具有中和活病毒的感染性的能力，作為保護性抗體(防御抗體)發揮作用。C抗原被稱為缺損粒子，是完整病毒粒子缺失核心核酸R N A和部分病毒蛋白的粒子，是中空狀粒子。C抗原對應的抗體無中和活病毒的感染性的能力，即使有該能力也是非常低的。因此，將滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株作為疫苗使用時，D抗原是必要的。
脊髓灰質炎病毒包括I型、II型、III型3種類型。對感染脊髓灰質炎病毒的免疫，對于I型、II型、III型3種病毒型是特異的，即使存在型間交差免疫也很微弱。I型、
II型以及III型滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的D抗原具有可產生下述中和抗體的免疫原性，所述中和抗體為分別對應于脊髓灰質炎病毒的I型、II型以及III型野生株(強毒株)的中和抗體。滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的D抗原對I型、II型以及III型分別具有不同的免疫原性，為了產生足夠的抗體用于中和脊髓灰質炎病毒的I型、II型以及III型的野生株(強毒株)，所必需的D抗原量因病毒型而異。如上所述，脊髓灰質炎病毒包括I型、II型、III型3種類型，無論哪種類型都引發相同的脊髓灰質炎。因此，將滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株作為疫苗(滅活的脊髓灰質炎疫苗)使用時，必需具有可產生足夠中和I型、II型以及III型各野生株(強毒株)的脊髓灰質炎病毒抗體的免疫原性，此外，優選與以往使用的強毒株來源的滅活脊髓灰質炎疫苗的免疫原性接近的免疫原性。為了表現出該免疫原性，以D抗原量計，優選疫苗含有I型、II型以及III型滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的比例為2 4:80 120:80 120，特別優選約3:約100:約100的比例。由于按照上述特定比例含有I型、II型以及III型，本發明使用的滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株表現出與強毒株來源的滅活脊髓灰質炎疫苗(例如，Salk ( 〃 一々)疫苗)相同的免疫原性。2.滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的制備本發明所用滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株可通過下述方法制備。首先,在約4g/L 約6g/L微載體存在下，培養Vero細胞,得到脊髓灰質炎病毒培養用細胞。在所得脊髓灰質炎病毒培養用細胞中接種種病毒(脊髓灰質炎病毒沙賓株)，通過培養病毒得到增殖的脊髓灰質炎病毒沙賓株。將所得脊髓灰質炎病毒沙賓株滅活，得到滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株。通過使用的種病毒(沙賓I型株、沙賓II型株或沙賓III型株)，可以得到相應的滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株。在病毒滅活前或后，可將病毒濃縮以及/或純化。如上所述，在滅活的脊髓灰質炎疫苗中，必需具有可產生足夠中和I型、II型以及III型各野生株(強毒株)的抗體的免疫原性。但是，滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株的D抗原對I型、II型以及III型分別具有不同的免疫原性。于是，關于具有可產生足夠中和I型、II型以及III型各野生株(強毒株)抗體的免疫原性的滅活脊髓灰質炎疫苗，可通過調節含有的I型、II型以及III型滅活脊髓灰質炎病毒的量而得到。(Vero 細胞)Vero細胞是綠猴(Cercopithecus aethiops)腎臟來源的傳代細胞，在ATCC(American Type Culture Collection)進行了登記。Vero細胞表現出成纖維細胞樣的細胞形態，對各種病毒具有廣范圍敏感性，由于易于傳代培養和維持，在病毒培養中被廣泛使用。作為已知的可由ATCC獲得的Vero細胞，可以列舉，ATCC號CCL_81、CRL_1587等。(微載體)在本說明書中，“微載體”是指使細胞附著在表面，可在液體培養基中以混懸狀態進行細胞培養的載體。只要是使細胞附著在表面，可在液體培養基中以混懸狀態進行細胞培養的載體即可，對材質、形狀、大小等沒有特別限制。作為微載體的材質， 可以列舉，葡聚糖(^卜’ >)、明膠、膠原、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、纖維素等。作為微載體的材質，優選葡聚糖。作為微載體的形狀，可以列舉，球狀(珠狀)、圓盤狀等。微載體的形狀優選為球狀。球狀微載體的大小例如為約0.01 Imm,優選為約0.05 0.5mm,更優選為約
0.1 0.3mm。微載體可以是多孔性的。作為本發明使用的球狀微載體，可以列舉，Cytodexl (商品名)、Cytodex3(商品名)、Cytopore (商品名)(以上為GE Health Biosciences公司制)等。作為圓盤狀微載體，可以列舉，Cytolinel (商品名)、Cytoline2 (商品名)(以上為 GE Health Biosciences公司制)等。作為多孔性微載體，可以列舉，Cytopore (商品名)、Cytolinel (商品名)、Cytoline2 (商品名)(以上為GE Health Biosciences公司制)等。作為本發明使用的微載體，特別優選球狀葡聚糖制微載體。作為球狀葡聚糖制微載體，優選Cytodexl (商品名)、Cytodex3 (商品名)以及Cytopore (商品名),更優選Cytodexl (商品名)以及Cytodex3 (商品名)，特別優選Cytodexl (商品名)。(Vero細胞的培養)在本發明中，通過在約4g/L 約6g/L的微載體存在下，培養Vero細胞,進行增殖。微載體濃度優選為約4.5g/L 約5.5 g / L，更優選為約5g/L。關于上述使VeiO細胞增殖的步驟，作為液體量，優選以3L以上的規模進行，更優選30L以上，特別優選150L以上。此外，使Vero細胞增殖的步驟通常以1000L以下的規模進行。在微載體存在下，培養Vero細胞時，作為培養基，可以使用含有約5 20vol%的小牛血清或胎牛血清的ME培養基〔Science，122卷，501 (1952)〕、DME培養基〔Virology, 8 卷，396 (1959)〕、RPMI1640 培養基〔The Journal of the American MedicalAssociationl99 卷，519(1967)〕、199 培養基〔Proceeding of the Society for theBiological Medicine，73卷，I (1950)〕等。作為培養基，優選D M E培養基，更優選含有小牛血清的DME培養基，特別優選含有約5vol%小牛血清的DME培養基。在細胞培養期間，根據需要交換培養基。優選pH為約6 8，更優選pH為約6.5 7.5，特別優選pH為約7。培養通常在約35°C 40°C進行約5 9日，根據需要進行通氣、攪拌。細胞培養時的溶氧濃度(DO)優選為約60 90%，更優選為約70 80%，特別優選為約75%。開始在微載體存在下的培養時，培養基中Vero細胞的細胞數(初始細胞數)可根據培養基、微載體的種類、培養規模等進行適當設定。優選初始細胞數為2X104個/mL 10 X IO5 個 /mL,特別優選 2 X IO5 個 /mL 10 X IO5 個 /mL。(脊髓灰質炎病毒的培養)關于脊髓灰質炎病毒的培養，可通過下述方法進行:在VeiO細胞的培養細胞中接種脊髓灰質炎病毒沙賓株(種病毒)，使之感染，在細胞內培養脊髓灰質炎病毒。感染細胞的培養可按照與上述Vero細胞培養相同的方法進行。作為培養脊髓灰質炎病毒使用的培養基，優選199培養基，更優選添加了碳酸氫鈉的199培養基，特別優選添加了 0.3 八％碳酸鈉的199培養基。病毒培養時的培養溫度優選為約30°C 38°C，更優選為約32°C 36°C，特別優選為約33°C 35°C。病毒培養時間優選為約I 5日，更優選為約2 4日，特別優選為約3日。而且，病毒培養可以以脊髓灰質炎病毒所致細胞變性效果(脊髓灰質炎病毒感染細胞引起細胞的圓形化，從微載體脫離)為指標，使之結束。作為種病毒，可以使用預先用綠猴原代腎培養細胞培養的脊髓灰質炎病毒沙賓株。
(含有脊髓灰質炎病毒的病毒液的回收)病毒培養結束后，除去微載體，回收含有脊髓灰質炎病毒的病毒液(有時稱為脊髓灰質炎病毒液。)。關于微載體的除去，例如可用特氟龍篩(例如、孔徑120 μ m)等進行。由于篩上殘留的微載體中殘存(附著)有脊髓灰質炎病毒，可用病毒培養液等清洗，回收脊髓灰質炎病毒。可用濾膜(例如0.2 μ m的濾膜)等過濾所得脊髓灰質炎病毒液，除去細胞屑。可在滅活前或后，濃縮以及/或純化脊髓灰質炎病毒液。作為濃縮方法，可以列舉，超濾法、超離心法、透析法等。作為濃縮方法，優選超濾法、超離心法，更優選超濾法和超離心法，進一步優選在進行超濾法后，進行超離心法。作為超濾法中使用的超濾膜，可使用病毒濃縮時通常使用的超濾膜。作為超濾膜的分級分子量(分畫分子量)，優選IOOkDa左右。作為超濾膜的材質，優選聚醚砜等。關于通過超離心法濃縮脊髓灰質炎病毒，例如，可通過將脊髓灰質炎病毒液在4°C，以100，OOOg超離心4小時形成沉淀(pellet)來進行。所述沉淀可重懸于磷酸緩沖液等中。通過將沉淀的重懸液進行超聲波處理，可粉碎凝集塊。超聲波處理可使用市售裝置例如INS0NAT0R M0DEL200M( ^ 夕)等進行。關于超聲波處理的條件，只要為可使凝集塊散開的程度即可，可根據用于超聲波處理的容器、超聲波輸出功率、重懸液的濃度等進行適當設定。作為超聲波處理的條件，可以列舉，在200W進行3 10分鐘的超聲波處理等。即使進行該超聲波處理，脊髓灰質炎病毒沙賓株也不會失去免疫原性，可作為脊髓灰質炎病毒疫苗使用。作為純化方法，可以列舉，利用純化對象物的大小、密度、沉降系數等物理性質的方法、利用化學或物理化學反應(吸附和解吸等)的方法等，沒有特別限制。作為純化方法，可以更具體地列舉，密度梯度離心法、過濾(包括超濾)、離子交換柱色譜法、親和色譜法、凝膠過濾色譜法、鹽析法等。作為純化方法，優選柱色譜法，更優選離子交換柱色譜法，特別優選DEAE-離子交換柱色譜法。關于進行柱色譜的純化次數，只要進行至達到必要的純度即可，沒有特別限制，從生產效率等角度考慮，優選以最小限度的步驟進行。作為濃縮以及純化，優選通過將脊髓灰質炎病毒液經超離心實現的沉淀化、對該沉淀的重懸液的超聲波處理、以及柱色譜純化而進行。從生產效率等角度考慮，經柱色譜的純化優選只進行I次。通過將脊髓灰質炎病毒液通過超離心實現的沉淀化、對該沉淀的重懸液進行超聲波處理以及只進行I次的經柱色譜的純化，可以高效且充分地濃縮以及純化脊髓灰質炎病毒液。(脊髓灰質炎病毒的滅活)脊髓灰質炎病毒的滅活可通過通常使用的方法進行。更具體地說，例如，向脊髓灰質炎病毒液中添加滅活劑，通過使脊髓灰質炎病毒與滅活劑反應，可以滅活脊髓灰質炎病毒。作為滅活劑，優選福爾馬林。關于滅活條件，只要脊髓灰質炎病毒被滅活即可，沒有特別限制。為了避免殘留有滅活不充分的脊髓灰質炎病毒，滅活處理的時間通常為已確認脊髓灰質炎病毒滅活的時間的約2 4倍，優選為約2.5 3.5倍，更優選為約3倍。例如，使用福爾馬林作為滅活劑時，其添加量優選為約0.001w/v% 0.lw/v%,更優選為約0.005w/v% 0.05w/v%,特別優選為約0.01w/v%o滅活溫度特別優選為約37°C。滅活時間因滅活劑的種類、滅活劑的濃度、滅活溫度等而異。例如，使用約0.01w/v%的福爾馬林作為滅活劑，當滅活溫度 為約37°C時，滅活時間優選為約8日 16日，更優選為約10日 14日，特別優選為約12日。使用約0.01w/v%的福爾馬林，滅活溫度為約37°C時，通常至第4日脊髓灰質炎病毒沙賓株被滅活。3.百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素(DPT)本發明使用的百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素沒有特別限制。關于百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素，作為百日咳白喉破傷風混合疫苗，可購得市售品(例如、武田藥品工業株式會社制、阪大微生物病研究會制、化學及血清療法研究所制等)。此外，百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素可通過公知的方法獲得。具體來講，百日咳菌的保護性抗原例如可通過下述操作得到:通過將百日咳菌I相菌(東浜株)的培養液用硫酸銨分級分離法(分畫法)/蔗糖密度梯度離心分級分離法等物理化學方法而萃取、分離、純化感染保護性抗原級分后，用福爾馬林減弱殘存的毒性。白喉類毒可通過下述例如操作得到:將白喉菌(Park-Williams N0.8株)產生的毒素用柱色譜法等物理化學方法純化濃縮后，用福爾馬林進行無毒化。破傷風類毒素可通過下述例如操作得到:將破傷風菌(Harvard株)產生的毒素用柱色譜法等物理化學方法純化濃縮后，用福爾馬林進行無毒化。百日咳菌的保護性抗原包括百日咳毒素(PT抗原)、纖維狀紅細胞凝集素(FHA抗原)、外膜蛋白(69KD抗原)、菌毛(線毛)(也稱為FB抗原、凝集原(FGG))。作為百日咳菌的保護性抗原，不必須含有全部的上述各抗原，可含有這些抗原中的I種以上、優選2種以上、更優選3種以上。針對所述保護性抗原的抗體保護宿主不受百日咳的感染。
4.混合疫苗本發明的混合疫苗含有滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株、百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素。百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素，如上所述，作為百日咳白喉破傷風混合疫苗，可購得市售品。因此，本發明的混合疫苗可通過混合滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株和百日咳白喉破傷風混合疫苗而制得。滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株可通過混合滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓I型株、滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓II型株、以及滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓III型株而制得。如上所述，以D抗原量計，優選滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株含有I型、II型以及III型滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的比例為2 4:80 120:80 120，特別優選為約3:約100:約100。在本發明的混合疫苗中，百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素的含量只要是可預防百日咳、白喉以及破傷風的有效量即可。更具體地講，所述百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素的含量可以與上述可作為市售品購得的百日咳白喉破傷風混合疫苗中的含量相同。而且，滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株以外的其它成分對百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素或/以及破傷風類毒素的免疫原性有影響時，通過適當調節百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素的含量，可以制備有效預防各疾患的混合疫苗。本發明的混合疫苗可按照常規方法制備、使用。具體來講，可按照以下所述方法制備、使用。 本發明的混合疫苗可按照常規方法進行制劑化，制成注射劑。注射劑可按照本身已知的方法進行制備，例如，將上述物質溶解于注射劑中通常使用的無菌的水性或油性溶液中，通過混懸或乳化進行制備。作為注射用水性溶液，例如，可以使用生理鹽水、含有葡萄糖或其它佐劑的等滲液等。通常將制備的注射液充填到適當的安瓿、注射器等中。根據需要，本發明的混合疫苗可含有防腐劑、抗氧化劑、螯合劑等制劑添加劑。作為防腐劑，可以列舉，硫柳汞、2-苯氧基乙醇等。作為螯合劑，可以列舉，乙二胺四乙酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(夕'' ')；^7'T ^ >四酢酸)等。本發明的混合疫苗還可進一步含有佐劑。作為佐劑，可以列舉，氫氧化鋁、磷酸鋁、氯化鋁等。本發明的混合疫苗還可含有除滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株、百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素以外的免疫原性成分。作為這些免疫原性成分，可以列舉，除脊髓灰質炎病毒、百日咳菌、白喉菌以及破傷風菌以外的病毒或菌的免疫原性成分。作為免疫原性成分，可以列舉，類毒素、弱毒化病毒、滅活的病毒、蛋白質、肽、多糖、脂多糖、脂肽、或這些的組合等。作為除脊髓灰質炎病毒、百日咳菌、白喉菌以及破傷風菌以外的病毒或菌，可以列舉，流行性感冒病毒、麻疹病毒、耳下腺炎病毒、風疹病毒、皰疹病毒、水痘病毒、狂犬病病毒、人免疫不全病毒、肝炎病毒、肺炎雙球菌、腦膜炎菌、傷寒菌、流行性感冒b圃等。本發明的混合疫苗可經例如皮下注射或肌肉注射非經口的施用，優選經皮下注射。可根據給藥對象的年齡、體重等各種條件，對本發明混合疫苗I次的給藥量進行適當選擇。具體來講，例如，可含有4國際單位以上的百日咳菌的保護性抗原、約15Lf的白喉類毒素、約2.5Lf的破傷風類毒素、約2 4單位(優選為約3單位)的滅活的沙賓I型脊髓灰質炎病毒(作為D抗原)、約80 120單位(優選為約100單位)的滅活的沙賓II型脊髓灰質炎病毒(作為D抗原)、約80 120單位(優選為約100單位)的滅活的沙賓III型脊髓灰質炎病毒(作為D抗原)。關于本發明混合疫苗的給藥次數，例如，作為初次免疫，以3 8周為間隔，可給藥2 3次。作為初次免疫，優選在給藥本發明混合疫苗2次的情況下，間隔3 8周再給藥I次百日咳白喉破傷風混合疫苗(DPT疫苗)。作為追加免疫，在初次免疫后，間隔6個月以上(例如，在初次免疫結束后12個月至18個月期間)，可再給藥I次。
實施例下面，通過實施例詳細地說明本發明，但本發明不受這些實施例的限制。
_7] 參考例I (脊髓灰質炎疫苗病毒制造用保存細胞庫的建立)由從ATCC獲得的VeiO細胞，按如下方法制作了疫苗病毒制造用的保存細胞庫。( i )原始細胞庫(MCB:Master Cell Bank)的調制融化從 ATCC獲得的裝在安瓿中的凍存細胞(CCL81 Vero，F-6573、傳代數:124代)，將其移入空的4盎司瓶(容量154mL、細胞增殖面積為54cm2的培養瓶)。向裝有細胞的4盎司瓶中滴加細胞增殖液(添加了 5vol%小牛血清、0.075%碳酸氫鈉、20 μ g/mL琥乙紅霉素、100 μ g/mL 卡那霉素(最終濃度)的 DME (Dulbecco’ s Modified Eagle，s Medium、SIGMA( V ")、商品號D5523)，經約5分鐘加入了 15mL。將裝有細胞和細胞增殖液的瓶子在36°C靜置培養(I只4盎司瓶、125代)。第二天早上用新鮮的15mL細胞增殖液更換，再于36°C進行靜置培養。靜置培養開始后的第6天進行了傳代(從I只4盎司瓶到4只4盎司瓶、126代)。傳代方法按以下的方法進行。傳代方法(I)棄掉培養液。(2)在4盎司瓶中加入傳代用0.25%胰島素液5mL。(3)浸潤細胞表面約I分鐘，然后棄掉傳代用0.25%胰島素液。(4)將4盎司瓶在36°C靜置，等待細胞從玻璃表面剝離。(5)細胞出現剝離后，加入5mL細胞增殖液，用吸管吹打將全部細胞剝離。(6)進一步用吸管吹打使細胞均勻懸浮，然后將細胞增殖液移入離心管。(7)600rpm、離心5分鐘,棄上清,將作為沉淀的細胞用吸管吹打從而均勻重懸在約8mL的新鮮的細胞增殖液中。(8)在新的4只4盎司瓶(每只裝入新鮮的細胞增殖液13mL)的每I只中加入2mL的細胞混懸液。(9)將4只4盎司瓶在36°C靜置，進行細胞培養。傳代用0.25%胰島素液的組成如下。5% 胰島素 50mL/L5%聚乙烯基吡咯烷酮(90K) 20mL/L0.247mol 依地酸鈉 *2 56mL/L
EK*3 2mL/L胰島素稀釋液872mL/L*1:使用豬胰臟來源的1:300活性的胰島素。*2:0.247mol依地酸鈉的組成如下。依地酸鈉_2Na.2H20 91.95g/LNaOH 9.88g/L*3:EK的組成如下。乳糖酸紅霉素10，000 μ g/mL硫酸卡那霉素50，000 μ g/mL*4:胰島素稀釋液的組成如下。NaCl 8，000mg/ LKCl 400mg/LNa2HPO4.12H20 150mg/LKH2PO4 60mg/L以下，按相同的方法(因培養面積比在I次傳代中為約3 4倍，所以培養瓶以及取液體量有所不同)每隔3 6日進行傳代，制備了 129代的細胞(每傳代I次，傳代數增加I)。在33只SR瓶(Small Roux瓶:容量727mL、細胞增殖面積156cm2的培養瓶)中，對培養的129代的細胞像傳代時那樣進行胰島素處理，離心，將沉淀以約1.5X107個/mL重懸在凍存培養基(添加了 10%DMS0(二甲亞砜)、10vol%小牛血清、0.075%碳酸氫鈉、20 μ g/mL琥乙紅霉素、100 μ g/mL卡那霉素(最終濃度)的DME (Dulbecco，s Modified Eagle，sMedium、SIGMA、商品號D5523))中。向安瓿中分注上述細胞混懸液lmL，以緩慢地冷卻速度(約I分降低1°C )將溫度降為_32°C后，移入液氮中保存。將上述這樣得到的129代的細胞作為原始細胞庫(MCB)使用。(ii)制造用保存細胞庫(MWCB:Manufacture’ s Working Cell Bank)的調制使用如上述(i)調制并保存的原始細胞庫(MCB)，按與上述(i)的原始細胞庫(MCB)的調制方法基本完全相同的方法，從融化安瓿中的細胞開始，通過細胞的傳代進行增殖直至134代(因初始細胞數多，故取液體量、培養瓶種類和數量有不同)。前述的134代的細胞也像原始細胞庫(MCB)那樣在液氮中保存。將像上述那樣得到的134代的細胞作為制造用保存細胞庫(MWCB)使用。實施例1 (脊髓灰質炎疫苗病毒制造用細胞的制備)(i)靜置培養步驟將上述參考例I中制備并保存的制造用保存細胞庫(MWCB)的I個安瓿(134代的細胞)，用與制備上述參考例I的原始細胞庫(MCB)及制造用保存細胞庫(MWCB)時相同的方法進行解凍，將細胞用LR瓶(Large Roux瓶，容量約1540mL、細胞增殖面積約274cm2的培養瓶)(X3只)靜置培養7天(135代)。靜置培養開始后的第7天進行傳代，將培養規模擴大至18只LR瓶(136)，并進行靜置培養。靜置培養及其傳代按與上述參考例I的原始細胞庫(MCB)的調制及制造用保存細胞庫(MWCB)的制備相同的方法進行。接下來，用40室細胞工廠(40段七> 7 r夕卜丨J 一)(Nunc ( )、商品號139446)的靜置培養7天(137代)。在靜置培養開始后的第7天進行傳代，再用40段細胞工廠4臺靜置培養7天(138代)。(ii)微載體培養步驟接下來，將上述(i)的靜置培養步驟中得到的138代的細胞像上述(i)的傳代時那樣進行胰島素處理，離心，將作為沉淀的細胞用吸管吹打均勻懸浮在1，OOOmL的微載體培養用細胞增殖液(添加了 5vol%小牛血清(Thermo Trace公司制)、0.11%碳酸氫鈉、0.1%果糖、20 μ g/mL琥乙紅霉素、100 μ g/mL卡那霉素(最終濃度)的DME (Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium、SIGMA、商品號D5523))中。將細胞混懸液與預先用PBS (磷酸緩沖鹽水)膨潤的、用微載體培養用細胞增殖液平衡化的微載體(Cytodexl (商品名)、GE HealthcareBiosciences公司)相混合(所使用的Cytodexl (商品名)膨潤前的重量為5g/L),用3臺50L容量培養器于37 °C、pH7.15在攪拌下進行培養。從培養的第2天開始，持續性地每I天將細胞增殖液的一半量更換為新鮮的細胞增殖液。將培養7天的細胞作為脊髓灰質炎疫苗病毒制造用細胞(139代)使用。實施例2 (滅活的脊髓灰質炎疫苗I型的制備)(i)病毒培養步驟對于實施例1得到的脊髓灰質炎疫苗病毒制造用細胞(139代)，在即將接種種病毒之前停止攪拌，使細胞沉淀，用添加了 0.075%碳酸氫鈉、20 μ g/mL琥乙紅霉素、100 μ g/mL卡那霉素(最終濃度)的EBSS (Earl’s Balanced Salt Solut ion)清洗I次。除去與微載體一起收集的5mL細胞培養液的上清后，添加0.25%胰島素液使其重新為5mL，將細胞從小珠上剝下并使之懸浮，測定細胞數，推測50L容量培養器中的總細胞數。接種弱毒沙賓株(Sabin株)的I型(LSc，2ab株)的種病毒，濃度是相對每個細胞為約10_3CCID5(I。種病毒接種后，立即向培養器中注入病毒培養液(添加0.3%碳酸氫鈉、20 μ g/mL琥乙紅霉素、100 μ g/mL卡那霉素(最終濃度)的M199 (Mediuml99)) 50L。而且，使用的種病毒是預先用美洲綠猴原代腎培養細胞在約33.3°C進行培養后、分裝成小份在-70°C下凍存的種病毒。病毒培養在34°C ±1°C下進行3天。以脊髓灰質炎病毒引起的細胞變性效果(脊髓灰質炎病毒感染細胞發生細胞的圓形化，其后從微載體脫離)為指標，在95 100%的細胞從微載體脫離時結束病毒培養。病毒培養結束后，通過特氟龍篩(孔徑120μπι)除去微載體，回收了病毒混懸液。對于殘留在篩網上的微載體，每I臺50L容量培養器用約3L的病毒培養液清洗一次。將該清洗液加到回收的病毒混懸液中，以此作為“ I型脊髓灰質炎病毒液”。(ii)病毒濃縮.純化步驟將上述⑴得到的I型脊髓灰質炎病毒液約150L用0.2μπι的濾膜(Pall，SLK7002NRP)過濾，除去細胞碎屑。將濾液用超濾膜(沙多利斯、PESU(聚醚砜)100kDa、
0.lm2,3051466801E—SG)濃縮至1.2L。對于濃縮的病毒液，在6°C、100，000g、超離心4小時使其沉淀化，并重懸于PB (磷酸鹽緩沖液，0.1moI/L)中(I只離心管(約IOOmL)的沉淀重懸于5mL的PB)。將沉淀的重懸液于4°C振蕩一夜后，以200W進行8分鐘超聲波處理(Kubota、INS0NAT0R M0DEL200M)，使凝集塊分散。然后，15，OOOrpm、離心30分鐘后取上清。將所得上清用 DEAE Sepharose CL-6B(商品名、GE Healthcare Biosciences 公司、GE17-0710-05)純化。使用PB (磷酸鹽緩沖液，0.1moI/L)作為洗脫液。監測280nm處的吸光度，回收最初的峰，以此作為“純化I型脊髓灰質炎病毒液”。對于采集的峰，通過計算260/280nm吸光度的值，確認了該值為1.5以上(脊髓灰質炎病毒完整粒子的260/280nm為
1.6 1.7)。(iii)滅活步驟將上述(ii)得到的純化I型脊髓灰質炎病毒液用滅活前稀釋液(添加5%氨基乙酸(最終濃度)的不含Ca、Mg、酚紅、碳酸氫鈉的M199)稀釋約10倍，用0.2 μ m的濾膜(Pall、SLK7002NRP)過濾，除去病毒凝集塊。制備濾液后，迅速開始滅活，以防止病毒再次凝集。滅活開始I小時前，將濾液與1:200稀釋的福爾馬林分別在37°C加熱備用。在對濾液進行充分攪拌的條件下，向其中加入福爾馬林使得最終濃度為1:4，000，加溫至37°C開始滅活。在福爾馬林處理中，每天上午和下午攪拌液體共2次，均勻地進行病毒的滅活。推測存在滅活不充分的病毒附著在容器的栓或容器的某個特定位置的情況，在滅活開始第2、4天更換栓，在第6天更換容器。此外，考慮到滅活步驟中病毒發生凝集的可能性，在滅活的第6天用0.2 μ m的濾膜(Pall、SLK7002NRP)進行了過濾。福爾馬林處理步驟在12天結束。在第12天，用亞硫酸鈉(添加濃度為0.0264mol/L)中和福爾馬林處理病毒液中的游離福爾馬林，然后，添加依地酸鈉(0.0009mol/L)作為穩定劑，以此作為“滅活脊髓灰質炎疫苗I型”的原液。
(iv) D抗原量的測定通過間接ELISA法進行，該方法使用了對類型(type)和D抗原特異性高的抗體。間接ELISA法是這樣進行的:首先，將作為第I抗體的與被檢抗原同型的D抗原特異性單克隆抗體(小鼠來源)包被在微板上。然后，加載稀釋后的被檢抗原。然后，加載作為第2抗體的與被檢抗原同型的兔多克隆抗體，再加載HRPO標記抗兔IgG抗體進行反應。反應后，使用鄰苯二胺溶液進行顯色，然后，測定492nm的吸光度。通過采用平行線定量法比較被檢抗體的吸光度測定值與對照抗原的測定值，求出被檢抗原的D抗原量。實施例3 (滅活脊髓灰質炎疫苗II型的制備)按照與實施例2相同的方法制備了 “滅活脊髓灰質炎疫苗II型”的原液，除了用弱毒Sabin株II型(P712, Ch, 2ah株)替代弱毒Sabin株I型(LSc, 2ah株)作為種病毒。實施例4(滅活脊髓灰質炎疫苗III型的制備)按照與實施例2相同的方法制備了“滅活脊髓灰質炎疫苗III型”的原液，除了使用弱毒Sabin株III型(Leon, 12alb株)替代弱毒Sabin株I型(LSc,2ab株)作為種病毒。實施例5 (百日咳菌保護性抗原的制備)(I)百日咳菌的培養將百日咳菌I相菌(東浜株)用Cohen-Wheeler培養基于30 34°C在攪拌下培養20 24小時。將用Cohen-Wheeler培養基培養出的百日咳菌用^ f 4 f 一 '> 3 >卜培養基于30 34°C繼續培養48 68小時。采用超濾法將培養液濃縮至1/10量，采用離心分離將上清液和菌體分離。(2)百日咳毒素的制備向上述(I)得到的上清液中加入占1/10量的lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，再添加25w/v%乙酸鈣溶液使其為0.1 2.0w/v%,經過濾得到含百日咳毒素(感染保護性抗原)的濾液。采用SP柱色譜法(平衡化溶液:0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ6.0))將濾液過柱，用0.415mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗脫吸附的百日咳毒素，分級分離出含百日咳毒素的液體。然后，采用凝膠柱色譜法(平衡化溶液:添加了 0.25mol/L氯化鈉的0.025mol/L磷酸鈉液(pH8.7))將含有百日咳毒素的液體過柱，然后進行過濾(孔徑0.2 μ m)，由此得到純化百日咳毒素(PT抗原)液。(3)纖維狀紅細胞凝集素的制備將上述(I)中分離的菌體用添加了 lmol/L氯化鈉的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)溶解，然后通過離心分離重新分成上清液和菌體。向重新分離出的上清液中加入25w/v%乙酸鈣溶液使其為0.1 2.0w/v%，通過過濾得到含纖維狀紅細胞凝集素(感染保護性抗原)的液體。對濾液用硫酸銨濃縮后，采用密度梯度離心法進行純化，分級分離出純化纖維狀紅細胞凝集素(FHA抗原)。(4)外膜蛋白的制備將上述(3)中重新分離出的菌體用添加0.145mol/L氯化鈉的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)溶解，于60°C加熱90分鐘，然后通過離心分離重新分離成上清液和菌體。向重新分離出的上清液中加入lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)使其占1/10量，再加入25w/v%乙酸鈣溶液使其為0.1 2.0w/v%，過濾，得到了含有外膜蛋白(感染保護性抗原)的濾液。將含外膜蛋白(感染保護性抗原)的液體，經SP柱色譜法(平衡化溶液:0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6.0))純化，回收通過柱的液體。然后，經凝膠柱色譜法(平衡化溶液:添加了 0.25mol/L磷酸鈉的0.025mol/L磷酸鈉溶液 (pH8.7))過柱之后，進行過濾(孔徑
0.2 μ m)，由此得到純化外膜蛋白(69K抗原)。(5)菌毛(凝集原(AGG))的制備在上述(4)中收集含外膜蛋白的液體后的殘渣中，加入上清液1/10量的添加了lmol/L氯化鈉的0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，進行過濾，得到了含菌毛(感染保護性抗原)的濾液。用硫酸銨濃縮所得含菌毛的液體后，采用密度梯度離心法進行純化，分級分離出了純化菌毛(FB抗原)。(6)保護性抗原的制備(減毒)將上述⑵ (5)中得到的PT抗原、FHA抗原、69KD抗原以及FB抗原以下列抗原比例為目標品質混合:相對于0.5mL的下述實施例8中制備的DPT混合疫苗，為PT抗原為
1.89 μ g、FHA抗原為3.00 μ g、69K抗原為0.76 μ g、FB抗原為0.36 μ g，得到的液體為純化的感染保護性抗原液。向純化的感染保護性抗原液中加入0.2 0.5vol%的福爾馬林，并且根據需要加入lw/v%以下的賴氨酸鹽酸鹽，37 41°C加熱7天以上，進行減毒，得到百日咳保護性抗原液。采用超濾法除去多余的福爾馬林和賴氨酸鹽酸鹽，得到百日咳保護性抗原原液。實施例6(白喉類毒素的制備)(I)白喉菌的培養將白喉菌(ParkWilliams N0.8)用 Loeffler’ s 培養基于 32.0 34.(TC培養 5天。(2)白喉類毒素的制備向上述(I)所得的培養液中加入硫酸銨后，對上清液進行過濾(孔徑0.45 μ m)，得到的濾液采用苯基疏水性柱色譜法(平衡化溶液:添加1.25mol/L硫酸銨的0.0lmol/L磷酸鈉溶液(pH6.5))過柱，采用DEAE離子交換柱色譜法(平衡化溶液:0.0lmol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0))將所得毒素液過柱，然后采用凝膠柱色譜法(平衡化溶液:添加了0.145mol/L氯化鈉的0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0))過柱而分級分離出白喉類毒素，以此為純化毒素液。(3)白喉類毒素的類毒素化向上述⑵所得的純化毒素液中加入Iw/v%以下的賴氨酸鹽酸鹽、0.3vol%的福爾馬林,38.0 40.(TC加熱21天,進行了類毒素化。(4)白喉類毒素的制備在上述(3)中進行類毒素化后，采用超濾法除去多余的福爾馬林以及賴氨酸鹽酸鹽，得到白喉類毒素液。實施例7 (破傷風類毒素的制備)(I)破傷風菌的培養將破傷風菌(Harvard47-A)用肝肉湯(liver-liverbroth)于 34.5°C 36.5°C
培養5天。(2)破傷風類毒素的制備
向上述(I)中所得的培養液中添加硫酸銨，使其濃度為1.25mol/L。然后，采用苯基疏水性柱色譜法(平衡化溶液:添加1.25mol/L硫酸銨的0.01mol/L磷酸鈉溶液(pH6.5))過柱，將所得毒素液經DEAE離子交換色譜法(平衡化溶液:0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5))過柱，然后再采用凝膠柱色譜法(平衡化溶液:添加0.145mol/L氯化鈉的0.004mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0))過柱，分級分離出破傷風類毒素，以此為純化毒素液。(3)破傷風類毒素的類毒素化向上述(2)中所得的純化毒素液中加入0.3vol%的福爾馬林，調整為pH7.0，于39°C加熱15 23天進行了類毒素化。(4)破傷風類毒素的制備在上述(3)的類毒素化之后，采用超濾法除去多余的福爾馬林以及賴氨酸鹽酸鹽，得到破傷風類毒素液。實施例8 (混合疫苗的制備)(i)混合滅活的脊髓灰質炎疫苗的制備將上述實施例2、3以及4所得的滅活脊髓灰質炎疫苗I型、滅活脊髓灰質炎疫苗II型以及滅活脊髓灰質炎疫苗III型的原液以D抗原量分別為3、100、10，與199培養基(M199)、最終濃度為0.5vol%的2-苯氧基乙醇以及最終濃度為0.09 w / V %的氯化鋁混合。將所得混合液的PH用氫氧化鈉或鹽酸調整為7，得到混合滅活脊髓灰質炎疫苗。(ii)DPT混合疫苗的制備將上述實施例5、6以及7中所得的百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素以及破傷風類毒素的原液與199培養基(M199)、最終濃度為0.5vol%的2-苯氧基乙醇以及最終濃度為0.24 w / V %的氯化鋁混合。將所得混合液的pH用氫氧化鈉和鹽酸調整為7，得到DPT混合疫苗。(iii)混合疫苗的制備將上述(i)中所得的混合滅活脊髓灰質炎疫苗與上述(ii)中所得的DPT混合疫苗等量混合，制備了混合疫苗。實施例9 (混合疫苗的穩定性)對于實施例8所得的混合疫苗，在25°C進行加速試驗來測定穩定性。穩定性通過對各病毒的效價試驗來進行評價。(I)沉淀純化百日咳疫苗的效價試驗使用了受試物、標準百日咳疫苗以及百日咳菌18323株。分別稀釋受試物及標準液，以此為基礎，分別以4倍或其它合適的對數等間隔進行共計3個梯度稀釋以上的稀釋液。以16只以上的4周齡小鼠為I組，對于各稀釋液分別使用I組。對于每I只小鼠I次腹腔內注射稀釋液0.5mL。免疫注射21天后，對于每I只小鼠腦內注射用于攻擊的菌混懸液0.025mL，觀察14天，計算出死亡只數。用統計學方法處理試驗結果并進行比較，發現受試物的效價一定為8單位/mL以上。(2)沉淀白喉類毒素的效價試驗使用了受試物、對照沉淀白喉類毒素和適當的毒素液。受試物和對照品的稀釋使用生理鹽水，此外，毒素液的稀釋使用添加0.2W/v%明膠的0.017mol/L磷酸鹽緩沖氯化鈉溶液(PH7.0)。分別稀釋受試物和對照品，制作對數等間隔的梯度稀釋液。以10只以上的5周齡小鼠為I組，對于受試物和對照品的各稀釋液分別使用I組，對于每I只皮下注射 0.5mL。免疫注射4 6周后，從各動物采血，測定血中抗毒素效價。用統計學方法處理試驗結果并進行比較，發現受試物的效價一定在47單位/mL以上。(3)沉淀破傷風類毒素的效價試驗使用了受試物、對照沉淀破傷風類毒素和適當的毒素液。受試物和對照品的稀釋使用生理鹽水，此外，毒素液的稀釋使用添加0.2W/v%明膠的0.017mol/L磷酸鹽緩沖氯化鈉(PH7.0)。分別稀釋受試物和對照品，制作對數等間隔的梯度稀釋液。10只以上的5周齡小鼠為I組。對于受試物和對照品的各稀釋液分別使用I組，對于每I只小鼠I次皮下注射0.5mL。免疫注射4 6周后，用約IOOLD5tl的毒素攻擊各小鼠，觀察4天。用統計學方法處理試驗結果并進行比較，發現受試物的效價一定在27單位/mL以上。(4)大鼠免疫原性試驗使用了受試物、IPV效價試驗用對照品、各型標準血清、和用于中和試驗攻擊的脊髓灰質炎病毒沙賓株(1、I1、III型)。分別稀釋受試物和對照品，制作對數等間隔的稀釋液。以10只以上的Wister系8周齡、雌性大鼠為I組，各稀釋液分別使用I組。對于每I只，在后肢大腿部肌肉內接種0.5mL。接種21日后，從全部動物按個體采血，采集血清，56°C加熱30分鐘。添加個體動物血清和標準血清，各血清添加2孔以上，用MEM培養基進行2倍梯度稀釋。而且，在各孔中接種各型中和用病毒混懸液至約100CCID5(I。然后，將全部板在36± 1°C的CO2培養箱中放置3小時后，約4°C下反應一夜。第二天，向各孔中添加I X IO4個細胞的細胞混懸液，在36±1°C的CO2培養箱中培養7天。培養結束后，觀察各孔的CPE，計算出50%中和點的血清稀釋倍數，以其倒數為中和抗體價。用統計學方法處理試驗結果并進行比較，發現受試物的效價一定與對照品相等或更高。加速試驗的結果示于表I。作為對照IPV，使用了 Lot04 C (日本脊髓灰質炎研究所制)。表1.
權利要求
1.混合疫苗的制備方法，所述混合疫苗含有: (A)滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株、 (B)百日咳菌的保護性抗原、 (C)白喉類毒素，以及 (D)破傷風類毒素， 該方法包括下述步驟: (a)在約4g/L 約6g/L的微載體存在下,培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞。
2.權利要求1所述的方法，其還包括下述步驟: (b)使脊髓灰質炎病毒沙賓株感染所述Ve ro細胞的步驟， (c)使該脊髓灰質炎病毒增殖的步驟， (d)回收含有該脊髓灰質炎病毒的病毒液的步驟，以及 (e)滅活該脊髓灰質炎病毒的步驟。
3.權利要求1所述的方法，其中，所述微載體的濃度為約5g/L。
4.權利要求1所述的方法，其中，所述微載體為葡聚糖制微載體。
5.權利要求1所述的方法，其中，培養Veix)細胞的步驟(步驟(a))以約3L以上的規模進行。
6.權利要求1所述的方法，其中，培養Veix)細胞的步驟(步驟(a))以約30L以上的規模進行。
7.權利要求2所述的方法，還包括 (d-2)將所述病毒液進行純化的步驟。
8.權利要求7所述的方法，其中所述純化步驟(步驟(d-2))包括下述步驟: (i)將經所述步驟(d)回收的病毒液通過超離心進行沉淀化、 ( )將該沉淀的重懸液進行超聲波處理、 (iii)經柱色譜純化。
9.權利要求8所述的方法，其中，所述(iii)經柱色譜純化的步驟只進行I次。
10.用權利要求1所述方法制備的疫苗。
全文摘要
本發明提供下述混合疫苗的制備方法，該方法包括制備高效價脊髓灰質炎病毒沙賓株的步驟，所述混合疫苗包括滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株、百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素以及破傷風類毒素。混合疫苗的制備方法包括下述步驟在約4g/L～約6g/L微載體存在下，培養待接種本發明脊髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞，該方法作為含有滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的混合疫苗的高效制備方法是很有用的。
文檔編號A61K39/10GK103223163SQ20131009101
公開日2013年7月31日 申請日期2007年9月28日 優先權日2006年9月29日
發明者安部忍, 清水文七 申請人:財團法人日本小兒麻痹癥研究所, 武田藥品工業株式會社