專利名稱：一種仙臺病毒抗原肽及其在仙臺病毒感染檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種仙臺病毒抗原肽及其在仙臺病毒感染檢測中的應用。
背景技術：
仙臺病毒(Sandaivirus)屬于副粘病毒科副粘病毒亞科、呼吸道病毒屬病毒,為單股負鏈RNA病毒，是一種實驗嚙齒類常見和高發的感染性副流感病毒，是引起嚙齒類動物呼吸系統疾病的主要病原，小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠等嚙齒類實驗動物均易感。仙臺病毒多數情況下無明顯臨床表現，但會對實驗動物的免疫系統產生影響，在合并其他細菌性病原體的感染后造成致死性的影響，是嚙齒類實驗動物必須排查的病原體，其傳染性強，容易擴散，在多數情況下呈隱性感染，可影響幼鼠發育成長和降低成年鼠的繁殖率，改變體內細胞免疫反應，且很難從鼠群中清除。1953年在日本仙臺的一次新生兒肺炎流行中首次分離出，又名Hemagglutinating virus of Japan(HVJ),即Fushimi株。由于許多特性與流感不同，以后又陸續分離到其他毒株，故命名為副流感病毒。仙臺病毒幾乎可凝集所有種類的紅血球，而且有溶血性。其表面具有血凝素和溶血素，溶血素有溶細胞作用，能溶解某些動物的紅細胞，與病毒的感染性有關，血凝素則能凝集某些哺乳類和禽類的紅細胞。仙臺病毒感染可侵犯呼吸道的表層組織，在上皮細胞中增殖，所致的免疫反應不牢固易再次感染，成人中通常引起輕型呼吸道感染，而5歲以下兒童發病率高、病情重，表現為急性阻塞性喉-支氣管-氣管炎和肺炎。由于仙臺病毒不僅感染動物，而且還會導致兒童患嚴重的呼吸道疾病，所以開發一種能夠及時的、準確的檢測仙臺病毒感染的產品，對動物和人類的健康具有重要意義。

目前的檢測多采用血清學的方法包括ELISA、IFA以及血凝抑制實驗等。這些血清學的檢測方法比較經典，在實際應用中卻存在一些問題，而最為主要的是血清學檢測使用的抗原質量的穩定性和適用性。在血清學檢測中最為關鍵的因素是抗原的質量。抗原的特異性和代表性，抗原的免疫原性和抗原性，這些因素均會影響到最終對血清學檢測結果的判定。近年來隨著多肽展示技術的應用，已經針對許多病原體的特異抗原表位進行了相關分析，也找到了一些有用的多肽表位，有些在微生物檢測中也得到了應用。使用的線性表位多肽庫，雖然不能包含天然空間構象表位，但是仍有許多線性表位具有良好的抗原性，多個抗原表位的組合可以很好的滿足血清學檢測的需要。在目前的國家標準推薦的檢測方法中使用病毒全顆粒作為抗原物質來檢測實驗動物血清中可能存在的抗體。但是由于病毒全顆粒在實驗室的擴增培養以及分離純化等過程中存在著許多的變量，包括病原體本身的變異、每次生產病毒可能摻入的非特異性抗原成分等，這些因素均會影響到抗原的穩定性。雖然病毒全顆粒保證了全部抗原位點的存在，但是抗原暴露的不同方式也會影響到抗原表位的展示最后影響檢測工作的結果。而且病毒全顆粒抗原會和其他病原體的產生交叉抗原最終影響檢測的準確性。

發明內容
有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種仙臺病毒抗原肽及其在仙臺病毒感染檢測中的應用，本發明提供的仙臺病毒抗原肽提高了多肽組合的特異性和針對性，因此可提高實驗動物微生物檢測的準確性。本發明提供了一種仙臺病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本發明還提供了一種仙臺病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。優選地，本發明提供的仙臺病毒抗原肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性大于85%。本發明提供的抗原肽是仙臺病毒的優勢抗原表位，且分子量較小，因此降低了與其他分子發生交叉反應的可能，提高了多肽組合的特異性和針對性，從而提高了對仙臺病毒感染檢測的準確率。本發明提供了一種編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。本發明還提供了一種仙臺病毒疫苗，包括本發明提供的仙臺病毒抗原肽及藥學上可接受的輔料。本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。優選地，本發明提供給的仙臺病毒疫苗的劑型為口服制劑或注射劑。

由于本發明提供的抗原肽是仙臺病毒的優勢抗原表位，所以在制備疫苗時，可減少仙臺病毒對動物的危害。本發明提供的仙臺病毒抗原肽在仙臺病毒感染檢測中的應用。本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。用抗原的優勢表位檢測動物體是否感染該抗原的原理是:當動物體感染抗原后，動物體就會產生針對該抗原的抗體，該抗體分布在動物的血清中，通過檢測血清中該抗體的存在與否，就能得知動物體是否感染抗原。動物體產生的抗體一般是針對抗原的優勢表位，即所產生的抗體能特異性的與抗原的優勢表位相結合。所以通過抗原優勢表位檢測血清中是否存在與其結合的抗體，就能得知動物體是否感染該病毒。本發明提供了一種非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法，包括以下步驟:步驟1:將本發明提供的抗原肽包被到酶標板上，經第一洗滌后封閉，獲得封閉后的酶標板；步驟2:取待測樣品加入封閉后的酶標板中，經孵育、第二洗滌、標記二抗、第三洗滌后顯色，獲得受檢溶液；步驟3:取受檢溶液，用酶標儀檢測OD45tl值，采用Cut off值法判斷檢測結果；Cut off值法判斷的標準為:受檢溶液的OD45tl值彡I +3SD為陽性，
受檢溶液的OD45tl值彡i +2SD為陰性，J +3SD >受檢溶液的OD45tl的值> ~x +2SD為可疑，重新測受檢溶液的OD45tl值，受檢溶液的OD45tl值小于 +3SD則判為陰性；其中，i為所有陰性對照樣品的OD450平均值，SD為所有陰性樣品OD450的標準差；陰性對照樣品與待測樣品的檢測方法一致；其中，本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。i值和SD值對某一物種而言為固定值，可在檢測后保存，再次檢測時可不對陰性對照進行檢測。作為優選，包 被具體為:將100 μ L含有10 μ g/mL抗原肽的包被緩沖液加入酶標板上，4°C條件下放置過夜。優選地，包被緩沖液的pH為9.6。更優選地，包被緩沖液的溶劑為蒸餾水。更優選的，包被緩沖液中Na2CO3的質量-體積濃度為1.59g/L，NaHCO3的質量體積濃度為2.93g/L。作為優選，第一洗滌采用洗滌緩沖液。優選地，洗滌緩沖液洗滌緩沖液pH值為7.4。更優選地，洗滌緩沖液的溶劑為蒸餾水。更優選地，洗滌緩沖液中各組分的含量為:
KH2PO40.2 g/L
Na:HPC):.!2H:02.9 g.L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
Tween-200.00025 %作為優選，封閉具體為:在酶標板上加入樣品稀釋液，37°C條件下放置不少于I小時。優選地，樣品稀釋液為牛血清白蛋白與洗滌緩沖液的混合物。更優選地，樣品稀釋液中，牛血清蛋白的含量為lg/L。作為優選，待測樣品為動物血清與樣品稀釋液的混合物。優選地，待測樣品中動物血清與樣品稀釋液的體積比為1:2。作為優選,待測樣品的添加量為，每孔50 μ L。作為優選，孵育具體為:在室溫條件下，放置I小時。作為優選，第二洗滌采用洗滌緩沖液。作為優選，二抗采用辣根過氧化物酶標記。優選地，采用樣品稀釋液稀釋二抗，制備稀釋后的二抗。
更優選地，二抗與樣品稀釋液的體積比為1:10000。最優選地，標記二抗具體為:取100 μ L稀釋后的二抗加入酶標板，37°C條件下放置I小時。作為優選，第三洗滌采用洗滌緩沖液。作為優選地，顯色具體為:在酶標板上加入底物緩沖液，放置5min后，加入終止液。優選地，底物緩沖液的pH值為5.0。更優選地，底物緩沖液的溶劑的為水，其中各組分的含量為:Na2HPO4 0.1028mol/L檸檬酸0.0486mol/L更優選地，終止液采用濃度為2mol/L的H2SO4水溶液。本發明提供了一種仙臺病毒感染檢測試劑盒，包括包被有本發明提供的抗原肽的平板、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、終止液和底物緩沖液。其中，本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。

優選的，包被有本發明提供的包被有本發明提供的抗原肽的平板的基質為:玻片、酶標板、多肽芯片或蛋白芯片。更優選地，包被有本發明提供的抗原肽的平板的基質為:多肽芯片。優選地，洗滌緩沖液洗滌緩沖液pH值為7.4。更優選地，洗滌緩沖液的溶劑為蒸餾水。優選地，洗滌緩沖液中各組分的含量為:
KH2PO40.2 g/L
Na2HPO4.12H:02.9 g/L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
7weeiv200.00025 %優選地，樣品稀釋液為牛血清白蛋白與洗滌緩沖液的混合物。更優選地，樣品稀釋液中，牛血清蛋白的含量為lg/L。優選地，終止液為濃度為2mol/L的H2SO4水溶液。優選地，底物緩沖液的pH值為5.0。更優選地，底物緩沖液的溶劑的為水。更優選地，底物緩沖液中各組分的含量為:Na2HPO4 0.1028mol/L檸檬酸0.0486mol/L作為優選，本發明提供的仙臺病毒感染檢測試劑盒的使用方法為:步驟1:取樣品稀釋液稀釋待測樣品后加入包被有本發明提供的抗原肽的平板中，經孵育、第四洗滌、標記二抗、第五洗滌后顯色，獲得受檢溶液；步驟2:取受檢溶液，用酶標儀檢測OD45tl值，采用Cut off值法判斷檢測結果；Cut off值法判斷的標準為:受檢溶液的OD45tl值≥；+3SD為陽性，受檢溶液的OD45tl值≤ +2SD為陰性，i +3SD >受檢溶液的OD45tl的值> J +2SD為可疑，重新測受檢溶液的OD45tl值，受檢溶液的OD45tl值小于i +3SD則判為陰性；其中， 為所有陰性對照樣品的OD45tl平均值，SD為所有陰性樣品OD450的標準差，陰性對照樣品與待測樣品的檢測方法一致。i值和SD值對某一物種而言為固定值，可在檢測后保存，再次檢測時可不對陰性對照進行檢測。優選地，待測樣品中動物血清與樣品稀釋液的體積比為1:2。作為優選,待測樣品的添加量為，每孔50 μ L。作為優選，孵育具體為:在室溫條件下，放置I小時。作為優選，第二洗滌采用洗滌緩沖液。作為優選，二抗采用辣根過氧化物酶標記。優選地，采用樣品稀釋液稀釋二抗，制備稀釋后的二抗。更優選地，二抗與樣品稀釋液的體積比為1:10000。最優選地，標記二抗具體為:取100 μ L稀釋后的二抗加入酶標板，37°C條件下放置I小時。作為優選，第三洗滌采用洗滌緩沖液。作為優選地，顯色具體為:在酶標板上加入底物緩沖液，放置5min后，加入終止液。本發明提供了一種仙臺病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。并提供了其在仙臺病毒感染檢測中的應用。本發明采用蛋白雜交技術，篩選出仙臺病毒的優勢抗原，該優勢抗原為仙臺病毒的NP (nucleocapsid protein)蛋白，仙臺病毒的NP蛋白有524個氨基酸殘基。本發明根據優勢抗原NP蛋白的氨基酸序列，采用overlapping方式設計抗原多肽陣列并合成了抗原多肽陣列芯片，篩選出了仙臺病毒特異性強而分子量小的線性表位。由于本發明提供的仙臺病毒抗原肽分子量較小，降低了與其他分子發生交叉反應的可能性，因此提高了多肽組合的特異性和針對性，從而提高了實驗動物微生物檢測的準確性。本發明還提供了一種仙臺病毒疫苗，包括本發明提供的仙臺病毒抗原肽及藥學上可接受的輔料，由于本發明提供的抗原肽是仙臺病毒的優勢抗原，所以在制備疫苗時，可減少仙臺病毒對動物的危害。通過對抗原肽與梯度稀釋的陰性及陽性血清的結合反應進行研究，結果表明:本發明提供的抗原肽與陽性血清具有良好的量效關系，且本發明提供的抗原肽與陽性血清中仙臺病毒的抗體可產生特異性的結合。


圖1示仙臺病毒抗原與大鼠仙臺病毒陰性對照和陽性對照抗血清雜交電泳圖，其中，泳道N示仙臺病毒抗原與大鼠仙臺病毒陰性對照血清雜交電泳，泳道P示仙臺病毒抗原與大鼠仙臺病毒陽性對照血清雜交電泳，箭頭a示條帶分子量為70kDa，箭頭b示條帶分子量為57kDa ；圖2示仙臺病毒NP蛋白多肽陣列模式圖；圖3示抗原多肽陣列與大鼠血清結合實驗圖，圖3(a)示大鼠仙臺病毒陰性對照血清與仙臺病毒NP蛋白多肽陣列反應后所得圖像(源自成像儀分析軟件生成圖像)，圖3 (b)示大鼠仙臺病毒陽性血清與仙臺病毒NP蛋白多肽陣列反應后所得圖像，其中，I號框示抗原表位212，2號框抗原表位229 232、3號框不抗原表位241 243，4號框不抗原表位258 259 ；圖4天然抗原及篩選出的優勢抗原肽分別與陰性血清和陽性血清的結合實驗圖，其中，縱坐標為OD45tl值，■示抗原與陽性血清結合的實驗結果，□示抗原與陰性血清結合的實驗結果，柱A示篩選出的優勢抗原肽A分別與陰性血清和陽性血清結合的實驗結果，柱B示篩選出的優勢抗原肽B分別與陰性血清和陽性血清結合的實驗結果，柱C示篩選出的優勢抗原肽C分別與陰性血清和陽性血清結合的實驗結果，柱D示篩選出的優勢抗原肽D分別與陰性血清和陽性血清結合的實驗結果，柱Sev示天然抗原分別與陰性血清和陽性血清結合的實驗結果；圖5示抗原肽C與梯度稀釋的陽性血清和陰性對照血清的結合實驗圖，其中，橫坐標為稀釋比例，縱坐標為OD45tl值，曲線I示抗原肽C與梯度稀釋的陽性血清結合的實驗結果，曲線2示抗原肽C與梯度稀釋的陰性血清結合的實驗結果。
具體實施例方式本發明提供了提供一種仙臺病毒抗原肽及其在仙臺病毒感染檢測中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參`數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供了一種仙臺病毒抗原肽，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。本發明還提供了一種仙臺病毒抗原肽，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。本發明提供的仙臺病毒抗原肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性大于85%。本發明提供的抗原肽是仙臺病毒的優勢抗原，且分子量較小，因此降低了與其他分子發生交叉反應的可能，提高了多肽組合的特異性和針對性，從而提高了對仙臺病毒感染檢測的準確率。本發明提供的抗原肽的篩選方法為:首先，采用蛋白雜交技術，篩選出仙臺病毒的優勢抗原；然后，根據優勢抗原的氨基酸序列，采用overlapping方式設計抗原多肽陣列并合成了抗原多肽陣列芯片，篩選出了仙臺病毒線性表位。本發明的篩選出的仙臺病毒優勢抗原是仙臺病毒的NP (nucleocapsid protein)蛋白。設計抗原多肽陣列時以14 18個氨基酸殘基為多肽長度，以2個氨基酸位移來設計抗原多肽陣列。抗原肽陣列的合成采用自動單點多肽合成儀。篩選出的優勢抗原肽表位位于NP蛋白的C端。本發明提供的抗原肽是仙臺病毒的優勢抗原表位，且分子量較小，因此降低了與其他分子發生交叉反應的可能，提高了多肽組合的特異性和針對性，從而提高了對仙臺病毒感染檢測的準確率。抗原肽的制備可采用生物學的方法或化學合成。本發明提供了一種編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。本發明還提供了一種仙臺病毒疫苗，包括本發明提供的仙臺病毒抗原肽及藥學上可接受的輔料。本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。為方便使用， 本發明提供給的仙臺病毒疫苗的劑型為口服制劑或注射劑。由于本發明提供的抗原肽是仙臺病毒的優勢抗原表位，所以在制備疫苗時，可減少仙臺病毒對動物的危害。本發明提供的仙臺病毒抗原肽在仙臺病毒感染檢測中的應用。本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。用抗原的優勢表位檢測動物體是否感染該抗原的原理是:當動物體感染抗原后，動物體就會產生針對該抗原的抗體，該抗體分布在動物的血清中，通過檢測血清中該抗體的存在與否，就能得知動物體是否感染抗原。動物體產生的抗體一般是針對抗原的優勢表位，即所產生的抗體能特異性的與抗原的優勢表位相結合。所以通過抗原優勢表位檢測血清中是否存在與其結合的抗體，就能得知動物體是否感染該病毒。本發明提供了一種非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法，包括以下步驟:首先，將本發明提供的抗原肽包被到酶標板上，經第一洗滌后封閉，獲得封閉后的酶標板；然后，取待測樣品加入封閉后的酶標板中，經孵育、第二洗滌、標記二抗、第三洗滌后顯色，獲得受檢溶液；然后，取受檢溶液，用酶標儀檢測OD45tl值，采用Cut off值法判斷檢測結果；Cut off值法判斷的標準為:受檢溶液的OD45tl值彡；+3SD為陽性，受檢溶液的OD45tl值Si +2SD為陰性，^ +3SD彡受檢溶液的OD450的值彡 +2SD為可疑，重新測受檢溶液的OD45tl值，受檢溶液的OD45tl值小于i +3SD則判為陰性；其中， 為所有陰性對照樣品的OD45tl平均值，SD為所有陰性樣品OD45tl的標準差；陰性對照樣品與待測樣品的檢測方法一致；其中，本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。 值和SD值對某一物種而言為固定值，可在檢測后保存，再次檢測時可不對陰性對照進行檢測。本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，包被具體為:將100 μ L含有10 μ g/mL抗原肽的包被緩沖液加入酶標板上，4°C條件下放置過夜。包被采用的包被緩沖液的pH為9.6。包被緩沖液的溶劑為蒸餾水。包被緩沖液中Na2CO3的質量-體積濃度為1.59 g/L, NaHCO3的質量體積濃度為
2.93g/L。 本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，第一洗滌采用洗滌緩沖液。洗滌緩沖液洗滌緩沖液pH值為7.4。洗滌緩沖液的溶劑為蒸餾水。洗滌緩沖液中各組分的含量為:
KH2PO40.2 g/L
Na:HP0.:.!2H:02.9 u L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
Tween-200.00025 %本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，封閉具體為:在酶標板上加入樣品稀釋液，37°C條件下放置不少于I小時。樣品稀釋液為牛血清白蛋白與洗滌緩沖液的混合物。樣品稀釋液中，牛血清蛋白的含量為lg/L。本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，待測樣品為動物血清與樣品稀釋液的混合物。待測樣品中動物血清與樣品稀釋液的體積比為1:2。待測樣品的添加量為每孔50 μ L0本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，孵育具體為:在室溫條件下，放置I小時。本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，第二洗滌采用洗滌緩沖液。本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，二抗采用辣根過氧化物酶標記。
采用樣品稀釋液稀釋二抗，制備稀釋后的二抗。
二抗與樣品稀釋液的體積比為1:10000。標記二抗具體為:取100 μ L稀釋后的二抗加入酶標板，37°C條件下放置I小時。本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，第三洗滌采用洗滌緩沖液。本發明提供的非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法中，顯色具體為:在酶標板上加入底物緩沖液，放置5min后，加入終止液。底物緩沖液的pH值為5.0。底物緩沖液的溶劑的為水，其中各組分的含量為:Na2HPO4 0.1028mol/L檸檬酸0.0486mol/L終止液采用濃度為2mol/L的H2SO4水溶液。本發明提供了一種仙臺病毒感染檢測試劑盒，包括包被有本發明提供的抗原肽的平板、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、終止液和底物緩沖液。其中，本發明提供的仙臺病毒疫苗中抗原肽為具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。包被有本發明提供的包被有本發明提供的抗原肽的平板的基質為:玻片、酶標板、多肽芯片或蛋白芯片。 包被有本發明提供的抗原肽的平板的基質為:多肽芯片。洗滌緩沖液洗滌緩沖液pH值為7.4。洗滌緩沖液的溶劑為蒸餾水。洗滌緩沖液中各組分的含量為:
KH2PO40.2 g/L
Na:HPC):.!2H:02.9 g.L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
Tween-200.00025 %樣品稀釋液為牛血清白蛋白與洗滌緩沖液的混合物。樣品稀釋液中，牛血清蛋白的含量為lg/L。終止液為濃度為2mol/L的H2SO4水溶液。底物緩沖液的pH值為5.0。底物緩沖液的溶劑的為水。底物緩沖液中各組分的含量為:Na2HPO4 0.1028mol/L檸檬酸0.0486mol/L本發明提供的仙臺病毒感染檢測試劑盒的使用方法為:首先，取樣品稀釋液稀釋待測樣品后加入包被有本發明提供的抗原肽的平板中，經孵育、第四洗滌、標記二抗、第五洗滌后顯色，獲得受檢溶液；然后，取受檢溶液，用酶標儀檢測OD45tl值，采用Cut off值法判斷檢測結果；Cut off值法判斷的標準為:受檢溶液的OD45tl值彡I +3SD為陽性，受檢溶液的OD45tl值+2SD為陰性，； +3SD彡受檢溶液的OD45tl的值彡 +2SD為可疑，重新測受檢溶液的OD450值，受檢溶液的OD45tl值小于；+3SD則判為陰性；其中， 為所有陰性對照樣品的OD45tl平均值，SD為所有陰性樣品OD45tl的標準差；陰性對照樣品與待測樣品的檢測方法一致。i值和SD值對某一物種而言為固定值，可在檢測后保存，再次檢測時可不對陰性對照進行檢測。

本發明提供的仙臺病毒感染檢測試劑盒的使用方法中，待測樣品中動物血清與樣品稀釋液的體積比為1:2。待測樣品的添加量為，每孔50 μ L。孵育具體為:在室溫條件下，放置I小時。第二洗滌采用洗滌緩沖液。二抗采用辣根過氧化物酶標記。采用樣品稀釋液稀釋二抗，制備稀釋后的二抗。二抗與樣品稀釋液的體積比為1:10000。標記二抗具體為:取100 μ L稀釋后的二抗加入酶標板，37°C條件下放置I小時。第三洗滌采用洗滌緩沖液。顯色具體為:在酶標板上加入底物緩沖液，放置5min后，加入終止液。本發明提供了一種仙臺病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。并提供了其在仙臺病毒感染檢測中的應用。本發明采用蛋白雜交技術，篩選出仙臺病毒的優勢抗原，該優勢抗原為仙臺病毒的NP (nucleocapsid protein)蛋白，仙臺病毒的NP蛋白有524個氨基酸殘基。本發明根據優勢抗原NP蛋白的氨基酸序列，采用overlapping方式設計抗原多肽陣列并合成了抗原多肽陣列芯片，篩選出了仙臺病毒特異性強而分子量小的線性表位。由于本發明提供的仙臺病毒抗原肽分子量較小，降低了與其他分子發生交叉反應的可能性，因此提高了多肽組合的特異性和針對性，從而提高了實驗動物微生物檢測的準確性。本發明還提供了一種仙臺病毒疫苗，包括本發明提供的仙臺病毒抗原肽及藥學上可接受的輔料，由于本發明提供的抗原肽是仙臺病毒的優勢抗原，所以在制備疫苗時，可減少仙臺病毒對動物的危害。通過對抗原肽與梯度稀釋的陰性及陽性血清的結合反應進行研究，結果表明:本發明提供的抗原肽與陽性血清具有良好的量效關系，且本發明提供的抗原肽與陽性血清中仙臺病毒的抗體可產生特異性的結合。本發明采用的試材皆為普通市售品，皆可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明:實施例1仙臺病毒的優勢抗原蛋白的確定
首先，配制SDS-PAGE電泳所用溶液:1.0mol/L Tris (ρΗ6.8)溶液:取 12g Tris 溶于 80mL 蒸餾水，調 pH 值至 6.8，用蒸餾水定容至IOOmL ；1.5mol/L Tris (pH8.8)溶液:取 18g Tris 溶于 80mL 蒸懼水,調 pH 值至 8.8,用蒸餾水定容至IOOmL ；10%SDS溶液:取IOg SDS溶于80mL蒸餾水，調節pH值至7.2，用蒸餾水定容至IOOmL ；10%過硫酸銨溶液:取Ig過硫酸胺溶于IOmL蒸懼水；5XTris-甘氨酸電泳緩沖液:Trisl5.lg，甘氨酸94g，完全溶于800mL蒸餾水后加入SDS5g，定容至1L，使用前稀釋至I X ；30%丙烯酰氨貯存液:取Ig亞甲基雙丙烯酰胺溶于80mL水，加熱溶解。然后加入29g丙烯酰胺攪拌溶解，用蒸餾水定容至IOOmL ；5X 上樣緩沖液:取 lmol/L Tris-Cl (ρΗ6.8)溶液 1.25mL，0.5g SDS，25mg 溴酚藍，2.5mL甘油，加入去離子水溶解定容至5mL，使用前加250 μ L β -巰基乙醇或2.5mLlmol/L DTT ； 確定仙臺病毒的優勢抗原蛋白的方法為:取仙臺病毒抗原80 μ L與20 μ L的上樣緩沖液混勻，于沸水中煮5min IOmin后上樣于聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，樣品在基層膠時采用60V電壓，到分離膠時采用120V電壓。待上樣緩沖液跑出后，根據Marker將目的條帶附近的膠切下。按照由黑到白(轉印夾)由膠到膜(硝酸纖維素膜)的順序放置好樣品，60V電壓下轉印3h。將硝酸纖維素膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉lh。分別取正常大鼠血清和感染仙臺病毒的大鼠血清用5%的脫脂奶粉以1:500稀釋，于4°C孵育過夜。第二天將膜用TBS-T溶液洗三次，每次lOmin。取二抗(羊抗鼠)IgG_HRP，用5%的脫脂奶粉以1:2000稀釋，室溫與膜孵育lh。用TBS-T溶液洗膜三次，每次lOmin。加增強發光液在暗室顯影。正常大鼠血清和感染仙臺病毒的大鼠血清與仙臺病毒抗原雜交結果如圖1所示。箭頭a指示條帶分子量為70kDa,箭頭b指示條帶分子量為57kDa。表明只有與感染仙臺病毒的大鼠血清孵育的電泳泳道才有雜交顯影條帶，而且箭頭b所指示分子量為57kDa的條帶含量最高。由于仙臺病毒NP (nucleocapsid protein)蛋白的分子量約為57kDa,而且研究表明在仙臺病毒感染過程中，動物體產生針對NP蛋白的抗體的滴度非常高，所以箭頭b所指示的條帶為仙臺病毒NP蛋白。上述實驗結果顯示仙臺病毒的優勢抗原為仙臺病毒NP蛋白。實施例2仙臺病毒優勢抗原多肽表位的篩選根據NP蛋白的524個氨基酸的蛋白序列，用多肽陣列技術制作了 2張多肽陣列。陣列芯片以overlapping方式設計，以14個氨基酸多肽長度，2個氨基酸位移來計算，每張多肽陣列上排列264條多肽，兩張陣列芯片共528條多肽。配置所需溶液:濃度為0.25mol/L的Fmoc-氨基酸溶液；封閉液I為含有2%(v/v)乙酸酐的二甲基甲酰胺溶液；封閉液II為2%(v/v)的乙酸酐及2%(v/v)的N，N- 二異丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液；Fmoc-移除液為含有20%(v/v)哌啶的二甲基甲酰胺溶液。首先，合成多肽陣列:把活化的PEG-纖維素膜放置在Autos potter上，根據程序自動添加0.1 μ L的Fmoc-氨基酸溶液到活化的PEG-纖維素膜上的特定位置與膜進行反應，反應20分鐘，再重復一遍該點膜過程；把PEG-纖維素膜先浸入封閉液I中反應5分鐘在浸入封閉液II中反應20分鐘,進行側鏈封閉，然后用DMF清洗4次。然后,把PEG-纖維素膜加入Fmoc-移除液中反應5min，重復I次，以移除氨基端的Fmoc保護基團；去保護基團后，用DMF清洗3次，每次30秒鐘，而后再用乙醇干燥；重復以上步驟，直至各個多肽全部合成。全部合成后，先用TFA cocktail去除側鏈保護基團，再用CH2Cl2清洗4次，而后用乙醇干燥。產物于_20°C保存，用于下一步免疫反應實驗。根據實驗設計，多肽自動合成儀合成多肽陣列，多肽陣列模式圖如圖2所示，每張多肽陣列橫向為11個多肽點，縱向為24個多肽點，圖中對多肽芯片上每個多肽點進行了位置編號標注，每個編號對應相應的多肽序列。以下所有多肽陣列實驗結果分析中的陽性表位數字與上述標注數字及多肽序列編號一一對應。將兩張多肽陣列芯片與兩種實驗大鼠血清，陰性對照組大鼠血清I份，陽性組大鼠血清I份，分別進行了免疫反應檢測，包括以下步驟:封閉:用含有質量分數為4%脫脂牛奶和質量分數為5%蔗糖的TBS-T緩沖液，室溫反應4小時；一抗孵育:取大鼠血清按體積比為1:500稀釋；與多肽陣列反應，4°C下過夜；洗膜:用TBS-T緩沖液漂洗3次，每次10分鐘；二抗孵育:二抗(羊抗鼠)IgG-HRP，用封閉液按1:2000的體積比稀釋，室溫下封閉2小時；洗膜:用TBS-T緩沖液漂洗3次，每次10分鐘；顯色JnAECL發光試劑，數字成像。

多肽陣列與大鼠血清結合結果如圖3所示，其中，圖3 (a)為對照血清與陣列反應后所得圖像(源自成像儀分析軟件生成圖像)，圖3 (b)為陽性血清與陣列反應后所得圖像。從多肽陣列檢測圖的整體對比來看，血清中陽性反應點主要集中于芯片的后1/3部位，表明仙臺病毒NP蛋白的主要抗原表位主要集中在該蛋白的C端。同時可以觀察到具有明顯差別的主要四個抗原表位區域，分別用1、2、3和4號框框出。通過對上述兩圖中顯色點的比較，陰性對照血清中針對229 232 (2號框)、241 243 (3號框)以及258 259 (4號框)抗原表位幾乎沒有反應，而陽性血清對上述表位反應較強烈，且為連續多個多肽點顯色，表明上述表位能夠激發較強的免疫反應，可能是主要的抗原表位。I號框的多肽表位陽性血清反應強度明顯高于陰性血清，但其未形成連續的差異顯色位點，判斷其可能為抗原表位，還需進一步驗證。針對其他表位的抗體反應，在兩組中不存在明顯的差異。針對出現的非特異性顯色點，可能是由于多肽對抗體識別位點的暴露，以及血清中抗體的交叉反應造成。由于陰性對照血清中針對229 232 (2號框)抗原表位幾乎沒有反應，而陽性血清對上述表位反應較強烈，且為連續多個多肽點顯色，表明上述表位能夠激發較強的免疫反應，所以本發明選取2號框中的4條多肽做進一步的研究。實施例3仙臺病毒抗原多肽的制備及功能鑒定采用化學合成的方法制備本發明實施例2篩選出的4條多肽，分別命名為抗原A、抗原B、抗原C、抗原D，并以lmg/mL濃度包被至ELISA反應板中，分別與仙臺病毒陽性血清和仙臺病毒陰性血清做反應，結果如圖4所示。結果表明與天然抗原SeV (仙臺病毒)相比，4條肽免疫原性弱。但抗原C仍表現出較好的免疫原性。抗原C的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。選擇抗原C包被ELISA平板，并將陰性及陽性血清按以下稀釋度稀釋:1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120,1:10240、1:20480,并將稀釋的血清與抗原肽
C做結合實驗，實驗結果結果如圖5所示，結果顯示本發明所篩選的抗原肽C與倍比稀釋的免疫血清顯示了較好的量效關系。實施例4仙臺病毒感染的檢測方法準確度檢測采用本發明實施例提供的具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗原肽C通過ELISA方法對10只感染仙臺病毒的大鼠進行檢測，另取5只沒有感染仙臺病毒的大鼠作為陰性對照，測試本發明提供的仙臺病毒感染檢測方法的準確度。首先，配制ELISA實驗中常規試劑:包被緩沖液:取1.59克Na2CO3和2.93克NaHCO·3溶解于蒸餾水，調節pH值為9.6，加蒸餾水至IOOOmL ；洗滌緩沖液:取0.2 克 ΚΗ2Ρ04、2.9 克 Na2HPO4.12Η20、8.0 克 NaCl、0.2 克 KC1、0.05%的Tween-20水溶液0.5mL,溶解與水，調節pH值為7.4，用蒸餾水定容至IOOOmL ；樣品稀釋液:取0.1克牛血清白蛋白(BSA)溶解于IOOmL配制好的洗滌緩沖液；終止液:取蒸餾水178.3mL,逐滴加入21.7mL濃硫酸(體積分數為98%)；底物緩沖液:取濃度為28.4克/L的Na2HP0425.7mL、濃度為19.2克/L的檸檬酸24.3mL，蒸餾水50mL混合均勻調節pH值至5.0 ；檢測仙臺病毒抗體的ELISA實驗步驟，如下:將本發明實施例提供的具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗原肽C包被到ELISA板上，每孔100 μ L，抗原肽C的濃度為10 μ g/mL, 4°C過夜。洗滌液清洗酶標板3次，37°C下用樣品稀釋液封閉酶標板Ih以上。準備待測樣品，抽取待測大鼠的靜脈血，離心收集血清。用樣品稀釋液按1:2的比例稀釋血清，取稀釋后的血清加入酶標板中，每孔50μ L，室溫孵育lh。每個樣品包被2個孔。洗滌液清洗酶標板3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，二抗按1: 10000的比例稀釋，分別加入孔中，每孔100 μ L，37°C孵育lh，再用洗滌液清洗3次。加辣根過氧化物酶底物緩沖液100 μ L，顯色5min后，加入終止液100 μ L，終止顯色。用酶標儀檢測OD45tl的值，采用Cut off值法判斷檢測結果；Cut off值法判斷的標準為:受檢溶液的OD45tl值≥i +3SD為陽性，受檢溶液的OD45tl值< X +2SD為陰性，X +3SD >受檢溶液的OD45tl的值≥；+2SD為可疑，重新測受檢溶液的OD45tl值，受檢溶液的OD45tl值小于I+3SD則判為陰性；其中，i為所有陰性對照樣品的OD45tl平均值，SD為所有陰性樣品OD45tl的標準差；陰性對照樣品與待測樣品的檢測方法一致。采用本發明提供的方法對大鼠感染仙臺病毒情況進行鑒定，結果如表I所示:表I本實施例對大鼠感染仙臺病毒鑒定結果
權利要求
1.一種仙臺病毒抗原肽，其特征在于，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
2.一種仙臺病毒抗原肽，其特征在于，在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。
3.一種編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。
4.一種仙臺病毒疫苗，其特征在于，包括如權利要求1 2任一項所述的抗原肽及藥學上可接受的輔料。
5.根據權利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的劑型為口服制劑或注射劑。
6.如權利要求1 2任一項所述的抗原肽在仙臺病毒感染檢測中的應用。
7.一種非診斷目的的檢測仙臺病毒感染的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:將如權利要求1 2任一項所述的抗原肽包被到酶標板上，經第一洗滌后封閉，獲得封閉后的酶標板； 步驟2:取待測樣品加入所述封閉后的酶標板中，經孵育、第二洗滌、標記二抗、第三洗滌后顯色，獲得受檢溶液； 步驟3:取所述受檢溶液，用酶標儀檢測OD450值，采用Cut off值法判斷檢測結果； 所述Cut off值法判斷的標準為: 受檢溶液的OD450值> ^ +3SD為陽性， 受檢溶液的OD450值< ;+2SD為陰性， T +3SD >受檢溶液的OD450的值> X +2SD為可疑，重新測受檢溶液的OD45tl值，受檢溶液的OD45tl值小于i +3SD則判為陰性； 其中了力陰性對照樣品的OD450平均值，SD為陰性樣品OD45tl的標準差。
8.一種仙臺病毒感染檢測試劑盒 ，其特征在于，包括包被有如權利要求1 2任一項所述抗原肽的平板、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、終止液和底物緩沖液。
全文摘要
本發明提供了一種本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種仙臺病毒抗原肽及其在仙臺病毒感染檢測中的應用。本發明提供的仙臺病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。由于本發明提供的仙臺病毒抗原肽分子量較小，降低了與其他分子發生交叉反應的可能性，因此提高了多肽組合的特異性和針對性，從而提高了實驗動物微生物檢測的準確性。
文檔編號A61K39/155GK103193865SQ20131009508
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者向志光, 楊志偉, 佟巍, 劉先菊, 李雨函, 魏強 申請人:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所, 北京華阜康生物科技股份有限公司