豬殃殃中環烯醚萜苷提取物及其提取方法和醫藥用途
【專利摘要】本發明提供了一種豬殃殃中環烯醚萜苷提取物及其提取方法和醫藥用途，所述方法以植物豬殃殃為原料，經含水乙醇回流提取或浸漬提取，濃縮液經大孔吸附樹脂處理，40-60%乙醇洗脫部位經凝膠柱和反相硅膠柱純化，制得6-O-乙酰雞屎藤次苷和6α-甲氧基京尼平苷酸，純度達90%以上。該方法原料充足，操作簡便，高效環保，適合規模化制備6-O-乙酰雞屎藤次苷和6α-甲氧基京尼平苷酸。制備的兩種環烯醚萜苷在抗炎和神經保護方面活性良好，具有良好的醫藥用途。
【專利說明】豬殃殃中環烯醚萜苷提取物及其提取方法和醫藥用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥【技術領域】，具體涉及從植物豬殃殃中制備6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸，特別是涉及采用大孔吸附樹脂和凝膠或反相硅膠柱層次法制備6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸；以及化合物6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸在抗炎免疫和神經保護方面的醫藥用途。
【背景技術】
[0002]據《中華本草》記載，豬殃殃，又名八仙草，拉拉藤，鋸子草，小鋸藤，小茜草，小飛揚藤，紅絲線，血見愁，小舒筋，小血藤等，是菌草科拉拉藤屬植物豬殃殃Galium aparineL.的全草，廣泛分布于全國各地，為田間常見雜草。豬殃殃有清熱解毒，利尿通淋，消腫止痛的功效，主治癰疽腫毒，乳腺炎，闌尾炎，水腫，感冒發熱，痢疾，尿路感染等。拉拉藤屬植物含有環烯醚萜、蒽醌和黃酮類成分，前期的研究中發現豬殃殃含有蒽醌、酚酸、黃酮、三萜等成分，其環烯醚萜類成分具有抗腫瘤、抗病毒、神經保護、抗炎抑菌、降血糖等藥理活性(蔡小梅，豬殃殃化學成分的研究，貴州大學碩士論文，2009;劉凈，等.海峽藥學，2004，16(1):14-19)。京尼平苷(geniposide)具有良好的抗腫瘤、保肝利膽、降血脂、抗炎鎮痛、治療風濕、抗氧化的藥理作用，特別是營養神經和神經保護方面應用前景廣闊。京尼平苷是一種新的GLP-1受體激動劑，能夠提高細胞的抗氧化能力。京尼平苷及苷元京尼平(genipin)明顯提高AD模型動物的學習記憶能力，改善認知功能狀態,認為其在對抗Α β毒性作用、抗氧化應激、抗內質網應激及抗炎等多方面具有良好效果，并能促進神經生長，修復受損神經元(王磊，等.中國藥理學通報，2012，28 (5):604-607)。環烯醚萜類化合物在神經保護方面具有良好的 研究潛力。
[0003]豬殃殃為田間常見雜草，資源豐富，前期研究發現該植物富含環烯醚萜類成分，
6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸的良好來源。大孔吸附樹脂、凝膠、反相硅膠聯合使用是純化環烯醚萜苷類成分常用的填料，合理組合上述幾種填料是制備環烯醚萜苷的有效方法。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種成本低廉、高效環保地制備活性天然化合物6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸的方法及其在抗炎和神經保護方面的應用。
[0005]本發明通過以下技術方案實現:
[0006]一種豬殃殃中環烯醚萜苷提取物，是通過下述方法制得:以植物豬殃殃為原料，經柱層析方法得到豬殃殃中環烯醚萜苷提取物，即6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸。
[0007]本發明還公開了所述提取物的制備方法:以植物豬殃殃為原料，干燥粉碎后提取；提取液減壓濃縮至無醇味，經大孔吸附樹脂除雜，含水乙醇洗脫，含有6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸的部位蒸除溶劑后經凝膠柱或反相硅膠柱純化，或經中壓制備柱純化，得到豬殃殃中環烯醚萜苷提取物，即6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸。
[0008]具體的制備方法是:將豬殃殃全草，曬干，粉碎，用10-20倍量的50~75%(ν/ν，下同)的含水乙醇提取2~3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，靜置過夜后上DIAION ΗΡ20或AMBERLITE XAD16N或AB-8大孔吸附樹脂，依次用3~5倍體積的水梯度乙醇洗脫。其中40-60%乙醇洗脫部位減壓濃縮，回收溶劑后經Toyopeal HW-40C或S印hadex LH20初步純化，用50~90%甲醇(v/v)洗脫，含有目標成分的部位經ODS柱層析純化，5-45%甲醇梯度洗脫，TLC跟蹤，合并相同點，分別濃縮至少量液體，靜置，析出白色結晶，即分別得到6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸的單體化合物。或經ODS柱處理過得樣品經中壓制備柱純化，用10-50%甲醇洗脫，流速3-7mL/min，經HPLC或TLC檢測，純度符合要求的流分合并，蒸除溶劑得到6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 α -甲氧基京尼平苷酸。
[0009]本發明還公開了在上述提取物在制備抗炎免疫和神經保護藥物中的應用。
[0010]本發明中所制得的6-0-乙酰雞屎藤次苷和6α-甲氧基京尼平苷酸純度經HPLC歸一化法測定，含量均在90%以上。采用本方法，制備6-0-乙酰雞屎藤次苷得率為
0.08-0.11%，6α -甲氧基京尼平苷酸得率為0.016-0.021%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1兩種環烯醚萜苷的HPLC圖；(流動相甲醇:含冰醋酸5%水=15:85 ;流速
0.8mL/min ;檢測波長 235 nm)。
[0012]圖2是6-0-乙酰雞 屎藤次苷(I)和6 α -甲氧基京尼平苷酸(2)的結構。
【具體實施方式】
[0013]下面的實施例和生物活性實驗是對本發明的進一步詳細說明，以下所列舉的實施例不以任何方式構成限制。
[0014]實施例1
[0015]豬殃殃藥材10kg，干燥、粉碎后用120kg70%乙醇室溫下浸泡3次，每次48小時。合并提取液，減壓濃縮至無醇味，再上AB-8大孔樹脂，分別用水洗，40%乙醇洗脫，TLC跟蹤，合并相同點，濃縮、過濾后上S印hadex LH-20凝膠柱(70%甲醇)。TLC跟蹤，合并相同點。再上反向硅膠柱，用5%至45%甲醇梯度洗脫。其中10%甲醇部位TLC跟蹤，相同點合并，濃縮后得6-0-乙酰雞屎藤次苷(10.0克);30%甲醇部位TLC跟蹤，分別相同點合并，濃縮后得6α-甲氧基京尼平苷酸1.8克。
[0016]實施例2
[0017]豬殃殃藥材5kg，干燥、粉碎后用50kg70%乙醇回流提取3次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮至無醇味，再上DIAION HP20大孔樹脂，分別用水洗，40%乙醇洗脫，TLC跟蹤，合并相同點，濃縮、過濾后上HW-40C凝膠柱(50%甲醇)。TLC跟蹤，合并相同點。再上反向硅膠柱，用5%，30%和45%甲醇梯度洗脫。其中5%甲醇部位TLC跟蹤，相同點合并，濃縮后得6-0-乙酰雞屎藤次苷(4.3克);30%甲醇部位TLC跟蹤，相同點合并，濃縮后得6 α -甲氧基京尼平苷酸0.8克。
[0018]實施例3[0019]豬殃殃藥材2kg，干燥、粉碎后用20kg70%乙醇回流提取3次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮至無醇味后上AMBERLITE XAD16N大孔樹脂柱，依次用5倍體積的水、5倍體積的50%乙醇和3倍體積的95%乙醇洗脫。其中50%乙醇洗脫部位減壓濃縮，回收溶劑，所得流浸膏再次經AMBERLITE XAD16N大孔樹脂柱除雜，依次用5%乙醇和50%乙醇洗脫。50%乙醇部位濃縮，得到土色固體。經反相硅膠柱層析處理，用含水甲醇梯度洗脫，45%部位經中壓制備純化，洗脫液流速5mL/min，根據兩種成分的出峰時間分別收集流出液，濃縮至少量液體靜置過夜，分別析出白色結晶，6 α -甲氧基京尼平苷酸0.41g和6-0-乙酰雞屎藤次苷
2.2g。經HPLC歸一化法測定，兩種化合物純度均高于90%。HPLC圖見附圖1。
[0020]兩個化合物的結構如圖2，波譜數據如下:
[0021]6-0-乙酰雞屎藤次苷(1):白色結晶，Molish反應呈陽性。ES1-MS:m/z43L4[M-H 1-NMR (600MHz, DMS0_d6): δ 2.03 (3H, s, _C0CH3)，2.97 (1H, dd, J=8.4，5.4Hz, H_9), 3.03 (1H, td, J=9.0，5.4Hz, H_5)，3.14-3.68 (6H, m, sugar H)，4.66 (1H, dd, J=14.4，1.2Hz, H_10a)，4.62 (1H, dd, J=14.4，1.2Hz, H_10b)，4.93 (1H, d, J=5.4Hz, H_6)，4.97 (2H, dd, J=7.8，5.4Hz,H-l，), 5.53 (1H, d, J=6.6Hz, H_7)，5.80 (1H, s, H_l)，7.37 (1H, d, J=l.8Hz, H_3)。13C_NMR(150MHz, DMS0-d6): δ 93.0 (C_l)，150.5 (C_3)，106.4 (C_4)，37.5 (C_5)，85.9 (C_6)，128.9 (C_7),144.5(C-8), 45.4(C-9), 62.3(C_10), 171.8(C_11), 171.3 (C00CH3), 100.3(C_1，)，74.9(C-2’), 79.2 (C-3，),71.9 (C_4，), 78.4 (C_5，), 63.0 (C_6，), 22.4 (C00CH3)。
[0022]6α-甲氧基京尼平苷酸⑵:白色結晶，Molish反應呈陽性。ESI_MS:m/z403.1 [Μ-Η ; ^-NMR (600MHz, DMS0_d6): δ 2.94 (1H, t, J=6.6Hz, H_9), 3.01 (1H, t, J=8.4Hz, H_5)，3.14 (3H, s, 0CH3)，3.18-3.65 (6H, s, sugar H), 4.01 (1H, d, J=16.2Hz, H_10a)，4.26 (1H, d, J=5.4Hz, H-6)，4.29 (1H, d, J=16.2Hz, H_10b)，4.58 (1H, d, J=7.8Hz, H_l’ ),4.81 (1H, d, J=8.4Hz,H-7)，6.09 (1H, s, H-l)，7.5 (1H, br.s, H_3)。13C_NMR (150MHz, DMS0_d6): δ 99.3 (C_l) ,153.0(C-3)，108.1 (C-4), 41.0 (C_5)，83.5 (C_6)，126.2 (C_7)，152.4 (C_8)，45.1 (C_9)，60.3 (C_l0)，168.5 (C-ll)，100.0 (C- ), 73.9 (C_2’), 77.5 (C_3’), 70.3 (C_4’), 77.0 (C_5’)，61.2 (C-6，), 56.8 (0CH3)。
[0023]實施例4
[0024]本發明中兩種環烯醚萜苷對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用
[0025]雄性ICR小鼠60只，體重18_20g，隨機分作6組，其中一組空白對照，正常進水進食，室溫24±4°C，濕度40~70%，實驗前6h前停止進食進水。空白組灌胃0.5%吐溫水溶液，治療組分別為兩種環烯醚萜苷(1和2)和吲哚美辛(Indo)水混懸液(含有0.5%生物吐溫)。小鼠給藥30min后，右耳兩面涂二甲苯0.05mL/只致腫，左耳不涂，30min后處死，用7mm打孔器取左右耳同一部位圓片，用電子天平精確稱量兩耳重量，以左、右重量之差為腫脹度。抑制率=(空白組平均腫脹度-治療組平均腫脹度)/空白組平均腫脹度X 100%。具體數據見表1:
[0026]表1兩種環烯醚萜苷對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(x±s，n=8)
【權利要求】
1.一種豬殃殃中環烯醚萜苷提取物，其特征在于通過下述方法制得:以植物豬殃殃為原料，經柱層析方法得到豬殃殃中環烯醚萜苷提取物，即G-O-乙酰雞屎藤次苷和6 a -甲氧基京尼平苷酸。
2.權利要求1所述豬殃殃中環烯醚萜苷提取物的提取方法，其特征在于:以植物豬殃殃為原料，干燥粉碎后提取；提取液減壓濃縮至無醇味，經大孔吸附樹脂除雜，含水乙醇洗脫，含有6-0-乙酰雞屎藤次苷和6 a -甲氧基京尼平苷酸的部位蒸除溶劑后經凝膠柱或反相硅膠柱純化，或經中壓制備柱純化，得到豬殃殃中環烯醚萜苷提取物，即e-ο-乙酰雞屎藤次苷和6 a -甲氧基京尼平苷酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂是DIAIONHP20或AMBERLITE XAD16N 或AB-8。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于采用大孔吸附樹脂除雜時，收集40-60%乙醇洗脫部位。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述凝膠柱為ToyopealHW-40C或Sephadex LH20，洗脫劑為50~90%甲醇。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于反相硅膠和中壓制備柱填料為0DS，洗脫劑為5~50%甲醇。
7.權利要求1所述豬殃殃中環烯醚萜苷提取物在制備抗炎免疫和神經保護藥物中的應用。
【文檔編號】A61P37/02GK103690551SQ201310302221
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年7月18日 優先權日:2013年7月18日
【發明者】湯建, 楊守士, 龔璽 申請人:江蘇大學