基于山梨糖醇-多胺聚合物的基因傳遞系統用于肺癌基因治療的制作方法
【專利摘要】開發安全有效的基因傳遞系統是基因治療在臨床上廣泛應用的最大障礙。在此研究中，該發明開發了一種基于山梨糖醇-多胺聚合物的基因傳遞系統作為肺癌基因治療的可替換的基因載體。Sorbitol diacrylate和精胺通過邁克爾加成反應制備了高分子聚合物，記為SD-SPE。該聚合物SD-SPE能有效地壓縮DNA為納米顆粒并且有效保護DNA免受核酶的降解。SD-SPE/DNA復合物體內外均顯示出優良的轉染效率且毒性低。而且，肺吸入傳遞SD-SPE/Pdcd4復合物在肺癌模型小鼠K-rasLA1顯著的抑制肺腫瘤。這些結果證明SD-SPE由于具有優良的生物相容性和高的基因傳遞效率，因此將在肺癌基因治療方面將具有巨大的潛力。
【專利說明】基于山梨糖醇-多胺聚合物的基因傳遞系統用于肺癌基因 治療

【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫用材料，納米技術和基因遞送領域，特別是涉及基因納米顆粒的制 備和其特殊通路傳遞基因，來用于基因可控釋放的系統。

【背景技術】
[0002] 基因治療已漸漸地作為治療癌癥的最有希望治療手段之一（Merdan，etal.， 2002)。由于裸基因經常會遭受酶的降解，腎的過濾而清除，細胞吸收差，不能有效逃離溶 酶體而進入細胞質，因此，開發安全有效的基因傳遞系統用于有效載有治療基因進入靶點 是基因治療技術成功與否的關鍵（Gao, etal.，2003 Jiang，et al.，2007 ;Shen，etal.， 2012)。直到現在，臨床上所用的絕大多數基因治療都是以修飾后的病毒為載體。但是，病毒 載體本身的免疫原性，嚴重的毒副作用以及生產上的問題已經驅使科學家去尋找非病毒載 體（Jiang, etal. ,2007 ;Thomas，etal. ,2003)。近年來，非病毒載體受到人們的廣泛關注， 因為這些載體制備容易，且穩定，容易改造，對所載基因的大小沒有限制，而且與病毒載體 相比相對安全（Lungwitz，etal. ,2005 ;Mintzer，etal. ,2009)。但是，盡管具有這些優勢， 與病毒載體相比，現有的非病毒基因載體仍然存在轉染效率低等缺點（Jiang，etal.，2007 ; Anderson, etal. ,2003)。
[0003] 聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI)是一種使用最廣泛的非病毒基因載體之 一。由于其在很多類型細胞內具有較高的轉染效率，所以被稱為非病毒基因載體"金標 準"（Boussif，etal.，1995 ;Park，etal.，2006 ;Boussif，etal.，1996)。但是，據報道，PEI 具有很大的細胞毒性，而且其細胞毒性具有分子量依賴性；高分子量的PEI的細胞毒性較 大（Jiang，etal.，2007 ;Fischer，etal.，1999)。因此，有必要用生物相容性的人內源性的 多胺類化合物代替PEI。
[0004] 小分子多胺是基因傳遞的優良載體，但是其分子量小，壓縮核酸的能力有限，因 此有必要將其合成聚合物。精胺（spermine，SPE)是多胺小分子的典型代表。它存在于 所有的真核細胞內，在細胞內代謝中發揮一定的作用，所以它是很好的生物相容性的材料 (Allen，etal.，1983 Jiang，etal.，2011)。而且SPE具有四個胺基，分別是兩個仲胺和兩 個伯胺。這些胺基可以與乙烯基通過邁克爾加成反應生成具有高緩沖容量的聚精胺類高 分子（Jere，etal.，2009 ;Duan，etal.，2012)。在以前的研究中，我們也報道過甘油丙氧基 三丙烯酸酯（GPT)和精胺通過上述反應生成的聚精胺類高分子作為生物相容性的基因載 體-GPT-SPE (Jiang，etal.，2011)。GPT-SPE聚合物具有低的細胞毒性和血漿中穩定性好的 特點。但是其轉染效率仍然較低。
[0005] 另一方面，肺吸入式傳遞基因給肺紊亂疾病提供了治療上的希望，而且較侵入式 的給藥來說具有很多優勢，因為肺吸入式傳遞系統可以讓DNA沉淀在肺部，繞過系統循環， 延長在肺部的滯留時間（Gautam，etal.，2003)。因此，在此發明中，我們開發了一種使用山 梨糖醇乙烯基乙二酯（sorbitol diacrylate, SD)與精胺通過邁克爾加成反應合成的基于 聚山梨糖醇-精胺（SD-SPE)的改良基因傳遞系統，因為有很多研究表明基于山梨糖醇的 傳遞體可以增加吸入式肺腫瘤基因傳遞的轉染效率（Higashi, etal. ,2009 ;Maiti，etal.， 2007)。另外，山梨糖醇廣泛存在于植物中，由于其具有良好的水溶性和無毒性，在食品工業 得到廣泛的應用（Maiti，etal.，2007)。在此發明中，對SD-SPE/DNA復合物的物理化學性 質進行了表征，它們的細胞內攝取實驗，轉染效率以及細胞毒性試驗也進行了表征。而且考 察了肺吸入后的體內轉染效率和毒性。而且，SD-SPE/Pdcd4的抑制腫瘤的能力在肺癌腫瘤 模型小鼠 K-rasul上得到驗證。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種有效地介導DNA遞送到靶細胞中的聚合物。本發明制 備的基于聚山梨糖醇-精胺的高分子材料能有效地壓縮DNA而且更有效地傳遞到細胞內， 然后很好地釋放DNA。
[0007] 本發明進一步的目的在于提供一種用來有效地進行DNA遞送的生物相容性的聚 合物，從而減少載體的細胞毒性。
[0008] 本發明的更重要的一個目的在于提供一種用來把治療基因遞送到肺腫瘤模型小 鼠靶部位的方法。
[0009] 上述以及其他目的是通過合成一種聚合物來實現的，其中所述的聚合物是甘油丙 氧基三丙烯酸酯與多胺分子（包括精胺，亞精胺，二乙烯三胺，三乙烯四胺，四乙烯戊胺，五 乙烯六胺，以及低分子量的PEI300,600,1200,1800)通過邁克爾加成反應來合成山梨糖 醇-多胺聚合物。此外，該聚合物介導了 DNA或治療基因轉染到肺癌細胞和肺腫瘤模型動 物中。該轉染方法和復合物實現了這些目標，與此同時產生了較少的細胞毒性且通過STC 介導的內吞機制和納米顆粒的內吞機制顯著地提高了轉染效率。
[0010] 因此，通過將增吞片段（山梨糖醇）與多胺分子偶聯成交替聚合物。靶向片段優 選山梨糖醇，多胺分子優選精胺。采用增吞片段的目的在于使得用于基因遞送的細胞顯著 的吞噬復合物。山梨糖醇前體與多胺分子之比可通過改變反應條件來調整。本發明合成的 SD-SPE聚合物中多胺分子仍然保持著仲胺和叔胺，所以能夠與核酸一起形成穩定且可溶的 復合物，因而能有效地進行轉染。與PEI25K相比，該SD-SPE聚合物具有較低的細胞毒性。 進一步研究了 SD-SPE聚合物的基因轉染率和細胞毒性并且與PEI25K進行了比較。舉例來 說，SD-SPE/GFP復合物較PEI25K/GFP轉染效率高，這表明山梨糖醇片段充當了增加內吞機 制的角色。利用氣霧法吸入傳遞SD-SPE/Pdcd4復合物在K-ras ul肺癌模型小鼠呈現出顯 著地抑制肺腫瘤效果。
[0011] 本發明是通過以下的技術方案實現的，具體步驟如下：
[0012] SD-SPE聚合物的合成按照之前報道的邁克爾加成的方法（Jiang，etal.，2011)。 具體如下：2.5mol/L SD和2.7mol/L SPE分別溶解于2mL DMSO中，然后SD溶液慢慢滴加 到SPE溶液中，然后在80°C下攪拌24h。所得產物溶解于4°C的去離子水中，然后用截留分 子量3500的透析帶在4°C下透析24h。最后SD-SPE聚合物凍干，保存在-20°C下備用。
[0013] 所有的SD-SPE/DNA復合物均是新鮮制備，具體方法是，將DNA溶液加到等體積下 的聚合物溶液中，輕輕地潤旋Imin,室溫下保持30min。
[0014] 本發明具有如下的有益效果：本發明制備的基于聚山梨糖醇-精胺的聚合物能 有效地與核酸形成復合物，并且具有很低的細胞毒性和顯著地轉染效率，在肺癌模型小鼠 K-raSul顯著地抑制肺腫瘤，在基因投遞領域具有廣闊的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是本發明按照實施例1合成的SD-SPE聚合物的合成與表征：㈧SD-SPE反應 的示意圖，（B)SD-SPE在重水中的 1H NMR，S=1.6-1.8ppm(-CH2-，SPE)，4.2-4.3(-CH2-，SD)， (C) GPC 分析。
[0016] 圖2是本發明按照實施例3制備的SD-SPE/DNA復合物的表征：(A) SD-SPE/DNA在 不同重量比下的瓊脂糖凝膠色譜，（B)DNA的保護和釋放評價，（C)SD-SPE/DNA復合物在重 量比為10下的透射電鏡照片，⑶復合物的動態光散射，（E) SD-SPE/DNA復合物在不同重量 比下的電勢分布，（F) SD-SPE/DNA復合物在重量比為10下的粒子表面電荷。
[0017] 圖3是本發明按照實施例3制備的SD-SPE聚合物在不同濃度兩種細胞不同 時間點的細胞毒性：（A)A549細胞，24,（B) 16HBE14〇-細胞，24h，（OA549細胞，72h， (D) I6HBEHo-細胞，Mh (mean土 SD，η=3)。
[0018] 圖4是本發明按照實施例3制備的SD-SPE/DNA復合物在Α459細胞中的體外基因 轉染：(A)SD-SPE/pGL3復合物在A549細胞中在不同重量比下轉染研究（mean土SD，n=3)， (B) SD-SPE/pGL3復合物在16HBE14〇-細胞中在不同重量比下轉染研究（mean土SD，n=3)， (C) SD-SPE/GFP復合物在A549細胞上的GFP表達分析。共聚焦激光掃描顯微圖片（scale bar=20 μ m)，（D) SD-SPE/pGL3 復合物在 A549 細胞中緩沖容量研究（mean土 SD，n=3)，（E)洛 霉素 Al基因轉染的效果，（F)聚山梨醇活性被SC58236抑制的基因轉染效果。
[0019] 圖5是本發明按照實施例3制備的SD-SPE/Pdcd4復合物在肺腫瘤模型小鼠 K-rasul的體內抑制腫瘤：(A)轉染效率研究：BALB/c小鼠肺吸入不同重量比的SD-SPE/GFP 復合物后GFP表達的觀察。（magnification :200X，scale bar = 100 μ m)，治療效率研究： 肺腫瘤模型小鼠 K-raSul肺吸入不同重量比的SD-SPE/Pdcd4復合物后肺癌腫瘤數量的評 價：(B)總的腫瘤數量，（C)大于Imm的肺癌數量（n=4, **p〈0. 01)。

【具體實施方式】
[0020] 實施例1
[0021] 將SD溶解于重量體積比10-20倍量的二甲基亞砜中，SPE溶解于重量體積比 10-20倍量的二甲基亞砜中，SPE與SD的物質的量比為I : 1. 1，然后SD溶液慢慢滴加到 SPE溶液中，然后在80°C下攪拌24h。所得產物溶解于4°C的去離子水中，然后用截留分子 量3500的透析帶在4°C下透析24h。最后SD-SPE共聚物凍干，保存在-20°C下備用。
[0022] 實施例2
[0023] SD-SPE聚合物的結構鑒定和分子量表征
[0024] SD-SPE聚合物通過氫核磁鑒定結構。分子量通過凝膠滲透色譜在690nm處檢測。 柱溫為25°C，流速0. 5mL/min，流動相為0. 5M乙酸銨溶液。
[0025] 實施例3
[0026] SD-SPE/DNA復合物的制備
[0027] 所有的SD-SPE/DNA復合物均是新鮮制備，具體方法是，將DNA溶液加到等體積下 的聚合物溶液中，輕輕地潤旋Imin,室溫下保持30min。
[0028] 實施例4
[0029] 聚合物對DNA壓縮和保護能力的考察
[0030] 聚合物對DNA壓縮和保護能力通過電泳表征。聚合物/DNA的質量比為0. 1到10， 加入上樣顏料，最后的體積為12 μ L。為了評價聚合物對DNA的保護能力，DNaseI作為降解 酶。復合物被加到1%瓊脂糖凝膠中，用TAE緩沖液作為電解質，50V下跑40min。
[0031] 實施例5
[0032] 復合物的表征
[0033] 復合物的形貌通過透射電鏡觀察。取1滴SD-SPE/DNA復合物滴到銅網上，用1 % 乙酸雙氧鈾溶液染色l〇s。銅網干燥IOmin中在電鏡下觀察。
[0034] 復合物的大小和表面電荷使用動態光散射測定。每個樣品為2mL，其中DNA濃度為 40ug/mL〇
[0035] 實施例6
[0036] 細胞毒性
[0037] 采用A549和16HBE140-細胞系評價根據實施例1合成的SD-SPE的細胞毒性。A549 和16HBE140-細胞分別為人肺癌細胞和人支氣管上皮細胞。在37°C下，在5% CO2培養箱 (Thermo Scientific)的RPMI1640培養基中維持細胞。將兩種細胞IX IO4個細胞/孔的量 接種在96孔平底板中，孵育18h后，用不同濃度的聚合物處理24或72h。之后用20 μ LCell Titer96?Aqueous One Solution Reagent來處理3h后，用ELISA plate reader(GLR1000， Genelabs Diagnostics, Singapore)在 570nm 進行測試。
[0038] 實施例7
[0039] 轉染
[0040] 采用A549和16HBE14〇-細胞系評價根據實施例1合成的SD-SPE的體外轉染效率。 A549和16HBE140-細胞分別為人肺癌細胞和人支氣管上皮細胞。在37°C下，在5% CO2培 養箱（Thermo Scientific)的RPMI1640培養基中維持細胞。對轉染實驗來說，將兩種細胞 10 X IO4個細胞/孔的量接種在24孔平底板中，孵育18h后，用聚合物/pGL3復合物在無血 清或含10%血清的培養基置換，接著孵育4h。之后用新鮮的培養基替換，再于37°C下孵育 24h。熒光素酶活性測定按照生產廠家的方法。BCA蛋白測試試劑盒用于提取蛋白，其濃度 用 Che miluminometer(Autolumat，LB953 ;EG&G Berthold，Germany)測定。為了評價聚合 物的緩沖容量，用DMSO稀釋的洛霉素 Al被加到每個孔中。孵育IOmin后，評價其轉染效率。 為了弄清楚SD-SPE介導的轉染機制，一種C0X-2抑制劑SC58236被用來抑制SD-SPE的滲 透能力。使用DMSO溶解后的10 μ M SC58236預處理Ih后，再轉染SD-SPE/pGL3后測其轉 染效率。
【權利要求】
1. 一種非病毒陽離子轉基因載體，其特征是SD-SPE二元組成的聚陽離子載體，其結構 式加下?
2. 權利要求1所述的聚合物陽離子轉基因載體的合成方法，其特征是以SD和多胺分子 為結構單元，交替連接成聚合物，構建成納米聚陽離子載體結構，反應式如下：
反應式中，（1)是SD結構式，（2)是典型的多胺分子：精胺結構式，（3)是最終產物 SD-SPE的結構式。
3. 根據權利要求2所述的聚陽離子轉基因載體的合成方法，其特征是所述反應步驟如 下： 將SD溶解于重量體積比10-20倍量的二甲基亞砜中，SPE溶解于重量體積比10-20倍 量的二甲基亞砜中，SPE與SD的摩爾比例為1 : 1-1.5 : 1，然后將SD溶液慢慢滴加到SPE 溶液中，然后在4-100°C下攪拌24h。所得產物溶解于4°C的去離子水中，然后用截留分子量 3500-12000的透析帶在4°C下透析24h。最后將SD-SPE聚合物凍干，保存在-20°C下備用。 所用到的溶劑是二甲基亞砜，也可以是醇類包括甲醇、乙醇等。
4. 根據權利要求1或2或3所述的聚陽離子轉基因載體的合成方法，其特征為：多胺 分子包括精胺，亞精胺，二乙烯三胺，三乙烯四胺，四乙烯戊胺，五乙烯六胺，以及低分子量 的 PEI300,600,1200,1800。
5. 根據權利要求3所述的聚陽離子轉基因載體的合成方法，其特征為：SD為兩段為雙 鍵的山梨糖醇前體，主要山梨糖醇。SD也可以是末端含兩個以上的雙鍵的山梨糖醇前體。
6. 根據權利要求3所述的聚陽離子轉基因載體的合成方法，其特征為：透析袋的分子 量在3500-12000范圍內。
7. 根據權利要求3所述的聚陽離子轉基因載體的合成方法，其特征為：反應溫度在 4-100°C范圍內。
8. 根據權利要求1或2或3所述的聚陽離子載體作為基因載體的應用。
9. 一種含有權利要求1的聚合物與含報告基因、抗癌基因的能在真核細胞中重組表達 的核酸形成的復合物。
10. 權利要求9的復合物，其中所述的核酸含有編碼遺傳標記的DNA序列，所述的遺傳 標記選擇綠色熒光蛋白基因和PdccM基因。
11. 一種轉染帶有能增加細胞內吞的方法，所述的方法包括使所說的細胞與權利要求 9的復合物在一定條件下接觸，其中在所述的條件下所說的復合物進入到所說的細胞中并 且釋放所說的復合物的核酸。
12. 根據權利要求11的方法，其中所述的能增加細胞內吞能力的片段為含有山梨糖醇 前體的反應物。
13. 根據權利要求11的方法，其中所述的細胞為肺細胞。
14. 根據權利要求11的方法，其中所述的細胞為肺癌細胞。
15. -種通過吸入方式給藥的基因傳遞系統，所述的方法包括使所說的模型動物與權 利要求9的復合物通過呼吸吸入，將復合物進入到所說的模型動物中并且能發揮治療作 用。
16. 根據權利要求15的方法，其中所說的模型動物為肺腫瘤模型動物K-rasU1。
【文檔編號】A61K48/00GK104338148SQ201310315438
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月25日 優先權日:2013年7月25日
【發明者】姜虎林, 金有慶, 邢磊 申請人:中國藥科大學