抑制新生淋巴管生成的方法和藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制受試者中新生淋巴管生成的方法，包括：給予受試者治療有效量的CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑。本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的方法，包括：聯(lián)合給予受試者(a)治療有效量的CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，以及(b)治療有效量的VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑。
【專利說明】抑制新生淋巴管生成的方法和藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，更具體地說，涉及抑制新生淋巴管生成的方法和藥物。【背景技術(shù)】
[0002]在體內(nèi)，血管負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣、營養(yǎng)等物質(zhì)到各個(gè)組織，并由毛細(xì)血管與周圍組織進(jìn)行物質(zhì)交換，血壓的存在導(dǎo)致血漿連續(xù)不斷的從毛細(xì)血管滲漏到組織間隙，稱為組織間液。淋巴管的主要功能就是收集這些富含蛋白質(zhì)的液體回流到血液循環(huán)。淋巴管盲端的毛細(xì)淋巴管(Lymphatic Capillary)可以吸收水分、大分子和細(xì)胞,形成淋巴液,淋巴液通過收集淋巴管(Collecting Lymphatic Vessel)最后在淋巴管與靜脈的交接處回流到血液,從而維持體液平衡。在這過程中，淋巴液會(huì)在淋巴結(jié)(Lymph Node)中被過濾，在淋巴結(jié)中外源物質(zhì)能被抗原遞呈細(xì)胞所識(shí)別引發(fā)特異的免疫反應(yīng)。在小腸絨毛內(nèi)乳中的淋巴管還能能吸收食物中的脂肪形成乳糜顆粒。毛細(xì)淋巴管存在于皮膚和大部分內(nèi)臟器官，除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓以及無脈管的組織，如軟骨、角膜、表皮[1]。
[0003]早在17世紀(jì)初淋巴管就被描述了，但由于缺少可以區(qū)分血管和淋巴管的特異標(biāo)志物，關(guān)于淋巴管的生成和功能的深入研究還不到20年。目前，已有一些淋巴管特異的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，比如:1) 一種名為Prox-1 (Prospero Homeobox Proteinl)的轉(zhuǎn)錄因子，對發(fā)育過程中淋巴管的生成至關(guān)重要，在人的組織中可以作為淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物[2]; 2)Podoplanin，是淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的一種腎小球足膜粘蛋白[3]，對于淋巴管發(fā)育也是必需的，盡管在一些非內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)，Podoplanin在血管上卻不表達(dá)可以作為毛細(xì)淋巴管的標(biāo)志物；3)淋巴管透明質(zhì)酸受體I (LymphaticVessel Endothelial HyaluronanReceptorl, LYVE-1)，是⑶44蛋白的同源物，在胚胎和成體的淋巴管上都有表達(dá)[4]，盡管在肝臟和脾臟的血竇以及巨噬細(xì)胞上有表達(dá)，LYVE-1是識(shí)別人以及小鼠淋巴管的一個(gè)標(biāo)志物；4)血管內(nèi)皮生長因子受體 3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3,VEGFR-3)，是細(xì)胞膜表面的酪氨酸激酶受體，是新生淋巴管生成的信號(hào)通路，主要表達(dá)在成體的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上，但在一些血管表面也表達(dá)[5]，血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR-3在腫瘤的淋巴管中不能作為標(biāo)志物，因?yàn)橐恍┠[瘤的血管表面會(huì)上調(diào)表達(dá)VEGFR-3。這些淋巴管特異的分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，使我們可以鑒定組織中的淋巴管，研究病理?xiàng)l件下淋巴管生長的調(diào)控機(jī)制。
[0004]在成人體內(nèi)，通常成熟的淋巴管處于靜息狀態(tài)，在一些生理和病理?xiàng)l件下，會(huì)發(fā)生新生淋巴管生成(Lymphangiogenesis),即從原有的淋巴管長出新的淋巴管。生理?xiàng)l件下，黃體的發(fā)育以及傷口的愈合，都會(huì)引發(fā)新生淋巴管生成[1]。在一些病理?xiàng)l件下，包括腫瘤生長與轉(zhuǎn)移、炎癥和移植排斥反應(yīng)，也會(huì)引發(fā)淋巴管生長[6]。盡管有少量報(bào)道稱，骨髓來源的細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞，可以分化成淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，但是成體的新生淋巴管生成主要通過從已有的淋巴管出芽長出新的淋巴管的方式發(fā)生[7]。
[0005]腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥致死的最主要原因，腫瘤細(xì)胞可以通過多種途徑發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中就包括淋巴管。腫瘤細(xì)胞利用淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)以及遠(yuǎn)端器官，腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移往往是癌細(xì)胞擴(kuò)散的第一步，可以作為惡性腫瘤進(jìn)展的一個(gè)主要診斷指標(biāo)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織能激活淋巴內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)形成新的淋巴管，即腫瘤新生淋巴管生成，在動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移模型中，腫瘤新生淋巴管生成能促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9]。越來越多的臨床數(shù)據(jù)也顯示，在多種腫瘤類型中，腫瘤新生淋巴管生成與腫瘤進(jìn)一步轉(zhuǎn)移正相關(guān)[1°]。
[0006]關(guān)于新生淋巴管生成是如何被調(diào)控的，目前已發(fā)現(xiàn)一系列的生長因子能誘發(fā)新生淋巴管生成。其中，血管內(nèi)皮生長因子C(Vascular Endothelial Growth Factor C，VEGF-C)和血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)是最主要的淋巴管生成促進(jìn)因子，它們都是糖蛋白，可以激活血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)[11’12]。血管內(nèi)皮生長因子受體3 (VEGFR-3)特異表達(dá)在成體的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上。激活血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)能體外誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖并在體內(nèi)誘發(fā)新生淋巴管生成[13’14]。反過來，在一些人遺傳性的淋巴水腫病人中，血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)發(fā)生錯(cuò)義突變，酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域不能被激活從而影響了信號(hào)通路[15]。類似的，如果人為的表達(dá)可溶性的血管內(nèi)皮生長因子受體3 (VEGFR-3)片段可以拮抗血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)和血管內(nèi)皮生長因子D (VEGF-D)，從而抑制轉(zhuǎn)基因小鼠中的淋巴管生成并導(dǎo)致淋巴水腫[13]。全長的血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)和血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)特異作用于新生淋巴管生成[16，17]，而成熟形式的片段可以同時(shí)誘導(dǎo)血管和淋巴管的生長[18’19]。
[0007]最近，一系列其它新生淋巴管生成相關(guān)的生長因子被報(bào)道。比如:(1)血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)，Cueni研究組報(bào)道血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)能通過血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)通路在新生淋巴管生成中起作用[2°]。(2)促血管生成素(Angiopoietin)，促血管生成素的酪氨酸激酶受體Tie-2特異表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上，促血管生成素I (Angiopoietin-1)過量表達(dá)在小鼠角膜模型中能誘導(dǎo)新生淋巴管生成[21]。小鼠中同時(shí)處理可溶性的血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)片段能抑制促血管生成素I的功能，表明促血管生成素I是通過血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)通路間接起作用的[21]。另外，促血管生成素2(Angi0p0ietin-2)是淋巴管發(fā)育中必需的因子，缺陷促血管生成素2的小鼠缺少正常的淋巴管組織[22]。(3)肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)，是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)有效的淋巴管生成促進(jìn)因子，轉(zhuǎn)基因小鼠過量表達(dá)肝細(xì)胞生長因子或者皮內(nèi)給藥都能促進(jìn)淋巴管增生，并且抗內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體3(VEGFR-3)的抗體并不能抑制肝細(xì)胞生長因子的活性，表明肝細(xì)胞生長因子可以直接促進(jìn)新生淋巴管生成
[23]ο (4)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF),在小鼠角膜模型中，堿性成纖維細(xì)胞生長因子也能促進(jìn)淋巴管的生長，可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)的方式[24]。(5)血小板衍生因子BB (Platelet-DerivedGrowth Factor-BB, PDGF-BB), Cao研究組報(bào)道血小板衍生因子BB體外能促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，在體內(nèi)小鼠角膜模型中能誘導(dǎo)新生淋巴管生成，并且通過血小板衍生因子受體(TOGFR)發(fā)揮作用。血小板衍生因子BB誘導(dǎo)的淋巴管生成也能被內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體3(VEGFR-3)的拮抗劑所抑制，表明血小板衍生因子BB可以直接和間接作用于淋巴管
[25]ο (6)膜島素樣生長因子 1/2 (Insulin-like Growth Factor-1/2, IGF-1/2), Bjorndahl研究組報(bào)道胰島素樣生長因子1/2能在體內(nèi)誘導(dǎo)新生淋巴管生成[26]。
[0008]人趨化因子家族目前包含40個(gè)趨化因子(Chemokine)和18個(gè)趨化因子受體(Chemokine Receptor)。趨化因子是具有化學(xué)趨化作用的,約8_15千道爾頓的小分子細(xì)胞因子，根據(jù)氨基酸序列氮端保守半胱氨酸的排列位置，分為4個(gè)亞類:CXC，CC, CX3C和C[27]。趨化因子能激活細(xì)胞表面的趨化因子受體，發(fā)揮趨化作用，誘導(dǎo)細(xì)胞沿著沿著趨化因子濃度梯度高的方向遷移運(yùn)動(dòng)。趨化因子受體通常是細(xì)胞膜表面的七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體。趨化因子受體最初在免疫細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)免疫細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位，后來發(fā)現(xiàn)在很多血源性細(xì)胞和非血源性細(xì)胞表面都發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，表達(dá)在不同組織微環(huán)境中的趨化因子受體與相應(yīng)的趨化因子相互作用，通過趨化作用負(fù)責(zé)幫助協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)和組織細(xì)胞到各種組織部位[28’29]。在腫瘤組織中，趨化因子能通過影響新生血管生成、腫瘤細(xì)胞-炎癥細(xì)胞間的作用、以及直接影響腫瘤的轉(zhuǎn)化、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等方式調(diào)控腫瘤進(jìn)展。[0009]趨化因子CXCL12，又稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I a (Stromal-Derived Factor-1 α，SDF-1 α )，能結(jié)合趨化因子受體CXCR4[3°]。趨化因子CXCL12是一個(gè)高度保守的趨化因子，在人和小鼠中有99 %的同源性，使得趨化因子CXCL12能跨種屬作用，趨化因子CXCL12-趨化因子受體CXCR4通路在進(jìn)化過程中可以在不同物種間作用，如斑馬魚和小鼠。趨化因子受體CXCR4是一個(gè)含352個(gè)氨基酸的視紫紅質(zhì)樣G蛋白偶聯(lián)受體[31]。最初的研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR4在艾滋病毒感染過程中發(fā)揮作用，趨化因子受體CXCR4是某種艾滋病毒進(jìn)入⑶4陽性的T細(xì)胞的共同受體[32]，從而引起了廣泛的研究。
[0010]趨化因子CXCL12-趨化因子受體CXCR4在腫瘤發(fā)生過程中也起著明顯作用，它們介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到特定的組織器官[33]。趨化因子CXCL12-趨化因子受體CXCR4能促進(jìn)腫瘤新生血管生成，幫助腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到特定的器官，這在多種腫瘤類型中都有報(bào)道，如:乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[34_39]。表達(dá)趨化因子受體CXCR4的腫瘤細(xì)胞傾向于轉(zhuǎn)移到高表達(dá)趨化因子CXCL12的組織，如肺、肝臟、淋巴結(jié)和骨髓等組織。在乳腺癌中，腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞能分泌大量的趨化因子CXCL12，分泌的趨化因子CXCL12既可以直接促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長，又可以促進(jìn)新生血管生成刺激腫瘤生長。另外，缺氧環(huán)境是改變腫瘤轉(zhuǎn)移行為的一個(gè)重要調(diào)控機(jī)制，隨著腫瘤組織氧濃度降低，缺氧環(huán)境能通過缺氧誘導(dǎo)因子I a (Hypoxia-1nducible Factor-1 a ,HIF-1 α )上調(diào)腫瘤細(xì)胞趨化因子受體CXCR4的表達(dá)[4°],而在正常生理?xiàng)l件下,腫瘤抑制蛋白Von Hippel-Lindau能通過降解缺氧誘導(dǎo)因子Ia下調(diào)趨化因子受體CXCR4的表達(dá)[41]。同時(shí)，缺氧環(huán)境也能增加腫瘤組織中趨化因子CXCL12的分泌，幫助腫瘤細(xì)胞存活。趨化因子CXCL12也參與腫瘤細(xì)胞的侵襲，通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶13 (MMP13)，趨化因子CXCL12促進(jìn)人基底細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲[42]。鑒于趨化因子CXCL12和趨化因子受體CXCR4在腫瘤中的重要作用，它們很有可能是抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。
[0011]趨化因子和趨化因子受體在腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因而趨化因子家族可以作為治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)。有些趨化因子能促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，有些趨化因子能抑制腫瘤進(jìn)展，我們可以通過調(diào)控特定的趨化因子或趨化因子受體對腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程進(jìn)行干預(yù)。
[0012]綜上所述，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤組織會(huì)激活淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管，誘發(fā)原有的淋巴管長出新的淋巴管，我們稱之為腫瘤新生淋巴管生成(Tumor Lymphangiogenesis)。腫瘤新生淋巴管生成與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，新生淋巴管為腫瘤細(xì)胞提供了一條便捷的轉(zhuǎn)移途徑，腫瘤細(xì)胞可以通過淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)以及遠(yuǎn)端器官。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)都證實(shí)在很多腫瘤類型中，腫瘤新生淋巴管生成可以作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指針。但是，腫瘤組織是如何誘發(fā)新生淋巴管生成的，其調(diào)控機(jī)理目前還未完全研究清楚。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列的生長因子，被腫瘤組織分泌后，能激活淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新生淋巴管生成，其中就包括血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)，是最主要的淋巴管生成促進(jìn)因子。這些生長因子激活淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和遷移能力，但是這些被激活的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞是如何被招募到腫瘤組織的目前還不明確。趨化因子家族包含多個(gè)趨化因子以及趨化因子受體，趨化因子通過激活表達(dá)在特定細(xì)胞表面的趨化因子受體，行使趨化功能，促進(jìn)細(xì)胞向趨化因子濃度梯度高的地方遷移運(yùn)動(dòng)，從而招募細(xì)胞到特定的組織部位。趨化因子家族在腫瘤組織中也大量存在，其中就有一些能促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在腫瘤組織尤其是缺氧條件下大量表達(dá)的趨化因子，是否能招募被生長因子激活的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，從而參與調(diào)控腫瘤新生淋巴管生成，目前還不明確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]在本發(fā)明中，發(fā)明人完成了以下研究:
[0014]篩選了趨化因子家族中表達(dá)在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表面的趨化因子受體，并證明血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C激活的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞特異上調(diào)表達(dá)趨化因子受體CXCR4 ；
[0015]證明CXCR4的配體趨化因子CXCL12是一個(gè)新的淋巴管生成促進(jìn)因子，通過趨化因子受體CXCR4能直接作用于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，體外招募淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，體內(nèi)促進(jìn)新生淋巴管生成；
[0016]證明了趨化因子CXCL12促進(jìn)新生淋巴管生成是直接起作用的，不依賴于血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C信號(hào)通路；
[0017]發(fā)現(xiàn)同時(shí)抑制趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C通路的聯(lián)合多靶點(diǎn)治療可以更有效的抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。
[0018]這些工作表明趨化因子家族直接參與腫瘤新生淋巴管生成的調(diào)控，證明了趨化因子CXCL12是一個(gè)新的淋巴管生成促進(jìn)因子，并發(fā)現(xiàn)同時(shí)封閉趨化因子和生長因子通路的聯(lián)合多靶點(diǎn)治療將更有效的抑制淋巴轉(zhuǎn)移，可成為臨床上控制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的一個(gè)新策略。
[0019]基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種抑制受試者中新生淋巴管生成的方法，包括:給予受試者治療有效量的CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑。所述受試者可以患有腫瘤、炎癥和/或移植排斥反應(yīng)等。所述CXCR4抑制劑和CXCL12抑制劑可以單獨(dú)給予，也可以同時(shí)給予。
[0020]本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的方法，包括:給予受試者治療有效量的CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑。
[0021]本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的方法，包括:聯(lián)合給予受試者(a)治療有效量的CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，以及(b)治療有效量的VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑。
[0022]在該方法中，(a)CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑用于阻斷CXCL12通路，(b)VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑用于阻斷VEGFR-3通路，這兩類物質(zhì)的聯(lián)合給藥可以更有效的控制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。
[0023] 值得注意的是，在該方法中，(b)中提到的VEGF-C抑制劑、VEGF-D抑制劑和VEGFR-3抑制劑可以各自單獨(dú)給藥，也可以兩種或三種組合在一起聯(lián)合給藥。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，抗趨化因子CXCL12中和抗體和抗生長因子VEGF-C中和抗體通過腹腔注射給予小鼠，可以有效抑制腫瘤新生淋巴管生成和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。
[0025]另一方面，本發(fā)明提供了 CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑在制備用于抑制受試者中新生淋巴管生成的制劑中的用途。
[0026]本發(fā)明還提供了 CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑在制備用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
[0027]本發(fā)明還提供了(a)CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，以及(b)VEGF_C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑在制備用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
[0028]本發(fā)明還提供了用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥物組合物，包括:作為活性成分的:(a) CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，和(b) VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑，以及任選的可藥用載體。
[0029]本發(fā)明還提供了用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥盒，包括:(a)CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，以及(b) VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑。
[0030]所述的藥盒中還可以包括使用說明書以及用于輔助患者用藥的器具，例如注射器。
[0031]上文所述腫瘤的包括但不限于:腦星形細(xì)胞瘤、食道鱗狀細(xì)胞癌、胃腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、膀胱秘尿上皮癌、心臟粘液瘤、腎透明細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、胰腺癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、乳腺非特殊性浸潤性導(dǎo)管癌、卵巢透明細(xì)胞癌、前列腺癌和睪丸精原細(xì)胞瘤。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1.1顯示了反轉(zhuǎn)錄PCR檢測小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子受體表達(dá)的結(jié)果。提取小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA后，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測趨化因子家族受體的mRNA水平。如圖所示PCR產(chǎn)物電泳圖，趨化因子家族受體包括趨化因子受體CCR1-10，CXCR1-7，CX3CR1，GAPDH為陽性對照。M為DNA標(biāo)志物，C為未加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照，T為靶基因，bp為DNA分子量單位。結(jié)果顯示正常培養(yǎng)的小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多個(gè)趨化因子受體，其中，趨化因子受體 CCR5、CCR9、CXCR4、CXCR6 和 CXCR7 高表達(dá)。
[0033]圖2.1顯示了 qRT-PCR檢測VEGF-C激活的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體的結(jié)果。VEGF-C刺激的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞與未刺激的相比，熒光定量實(shí)時(shí)PCR檢測在小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的趨化因子受體mRNA水平的變化情況，包括CCR4-6，CCR8-10, CXCR3-4，CXCR6-7，CX3CR1。結(jié)果顯示，VEGF-C激活的小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞特異性的上調(diào)表達(dá)趨化因子受體CXCR4。
[0034]圖2.2顯示了流式細(xì)胞檢測VEGF-C上調(diào)CXCR4的表達(dá)的結(jié)果。流式細(xì)胞方法檢測血清饑餓的細(xì)胞和VEGF-C刺激的細(xì)胞膜表面趨化因子受體CXCR4的表達(dá)。VEGF-C刺激上調(diào)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)。[0035]圖2.3顯示了免疫印跡檢測VEGF-C上調(diào)CXCR4的表達(dá)的結(jié)果。用血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C刺激小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，處理相應(yīng)時(shí)間后，免疫印跡方法檢測細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1a)和對照核纖層蛋白(Lamin B)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示VEGF-C能上調(diào)CXCR4和HIF-1 α的表達(dá)。
[0036]圖2.4顯示了小RNA干擾HIF-1 α對CXCR4的影響。用小RNA敲低小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1a)的表達(dá)，血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C分別刺激轉(zhuǎn)染了陰性對照小RNA (N.C.)或HIF-1 α小RNA的細(xì)胞后，免疫印跡檢測細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1a)以及對照肌動(dòng)蛋白(Actin)的表達(dá)情況。結(jié)果表明HIF-1 α介導(dǎo)了VEGF-C 上調(diào) CXCR4。
[0037]圖3.1顯示了趨化因子受體CXCR4在體內(nèi)分布的情況。激光共聚焦顯微鏡觀察正常小鼠的結(jié)腸組織和淋巴結(jié)組織、黑色素瘤荷瘤小鼠的腫瘤組織和腫瘤相關(guān)淋巴結(jié)組織中淋巴管(Podoplanin，紅色)上趨化因子受體CXCR4 (綠色)的表達(dá)情況，DAPI染色細(xì)胞核(藍(lán)色)，標(biāo)尺為20 μ m。結(jié)果顯示趨化因子受體在腫瘤相關(guān)的新生淋巴管上高表達(dá)。
[0038]圖3.2顯示了趨化因子受體CXCR4在體內(nèi)分布的情況。激光共聚焦顯微鏡觀察正常人的結(jié)腸癌組織、直腸癌組織和皮膚鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中，腫瘤新生淋巴管上趨化因子受體CXCR4的表達(dá)情況。淋巴管(Podoplanin，紅色)，趨化因子受體CXCR4 (綠色)，DAPI染色細(xì)胞核(藍(lán)色)，標(biāo)尺為200μπι。結(jié)果顯示趨化因子受體在腫瘤相關(guān)的新生淋巴管上聞表達(dá)。
[0039]圖4.1顯示了趨化因子CXCL12促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。如圖顯示細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，趨化因子CXCL12誘導(dǎo)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，成濃度依賴性，VEGF-C(100ng/mL)為陽性對照，***代表P < 0.001。
[0040]圖4.2顯示了趨化因子CXCL12促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞成管能力。如圖顯示細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)，趨化因子CXCL12誘導(dǎo)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，成濃度依賴性，VEGF-C(100ng/mL)為陽性對照，***代表P < 0.001。
[0041]圖4.3顯示了趨化因子CXCL12促進(jìn)新生淋巴管生成。如圖顯示體內(nèi)基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)，不同濃度的趨化因子CXCL12混入基質(zhì)膠，皮下接種小鼠，取出后檢測基質(zhì)膠中的新生淋巴管情況，Podoplanin代表淋巴管(紅色)，DAPI為細(xì)胞核染色(藍(lán)色)。趨化因子CXCL12在小鼠體內(nèi)能誘促進(jìn)新生淋巴管生成，成濃度依賴性，血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C為陽性對照。(圖4.3上)為激光共聚焦結(jié)果，標(biāo)尺為100 μ m，(圖4.3下)為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，***代表 P < 0.001。
[0042]圖5.1顯示了趨化因子受體CXCR4的抗體對淋巴內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。如圖顯示抗趨化因子受體CXCR4抗體對趨化因子CXCL12激活蛋白激酶B (Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)的影響，在同時(shí)有抗趨化因子受體CXCR4抗體(5 μ g/mL)或同種免疫球蛋白對照(IgGAyg/mL)存在時(shí)，用趨化因子CXCL12 (100ng/mL)處理小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，免疫印跡檢測蛋白激酶B(Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)的蛋白水平，以及他們的磷酸化水平(p-Akt, p-Erk)。
[0043] 圖5.2顯示了 Erk和Akt的拮抗劑對CXCL12招募淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的影響。在體外細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)中，用Akt通路的拮抗劑(LY294002)和Erk通路的拮抗劑(U0126)處理小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，檢測這些拮抗劑對趨化因子CXCL12(100ng/mL)招募淋巴內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。(圖5.2上)紫色的為遷移的小鼠淋巴淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，標(biāo)尺為100 μ m，(圖5.2下)為遷移的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)后的結(jié)果，***代表P < 0.001。
[0044]圖6.1顯示了人腫瘤組織芯片檢測趨化因子CXCL12表達(dá)的結(jié)果。如圖所示，人腫瘤組織芯片包含多種腫瘤類型，共54個(gè)樣本，組織免疫熒光檢測趨化因子CXCL12表達(dá)水平和淋巴管密度(LV)，根據(jù)它們的信號(hào)強(qiáng)弱將樣本分成4組，統(tǒng)計(jì)各組的樣本數(shù)。(圖6.1左)為激光共聚焦結(jié)果代表圖，DAPI為細(xì)胞核染色(藍(lán)色)，CXCL12染綠色，Podoplanin代表淋巴管(紅色)，共定位為各熒光的疊加，標(biāo)尺為50 μ m。(圖6.1右)為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，CXCL12(高)代表趨化因子CXCL12高表達(dá)，CXCL12 (低)代表趨化因子CXCL12低表達(dá)，LV (高)代表淋巴管密度高，LV(低)代表淋巴管密度低。
[0045]圖7.1顯示了抑制CXCR4對趨化因子CXCL12的影響。如圖所示細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，用抗CXCR4抗體和CXCR4拮抗劑(AMD3100)處理細(xì)胞，趨化因子CXCL12的活性被抑制，VEGF-C的活性不受影響。細(xì)胞因子為只含趨化因子CXCL12或VEGF-C的對照，IgG為同種免疫球蛋白對照。(圖7.1上)為細(xì)胞遷移結(jié)果,標(biāo)尺為100 μ m,(圖7.1下)顯示統(tǒng)計(jì)結(jié)果,***代表 P < 0.001。
[0046]圖7.2顯示了抑制VEGFR-3對趨化因子CXCL12的影響。如圖所示細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，用抗血管內(nèi)皮生長因子受體-3抗體(VEGFR-3Ab)處理細(xì)胞，趨化因子CXCL12的促進(jìn)細(xì)胞遷移的活性不受影響，VEGF-C的活性被抑制，IgG為同種免疫球蛋白對照，***代表P< 0.001。
[0047]圖7.3顯示 了體內(nèi)基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CXCL12和VEGF-C的關(guān)系。如圖所示基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)，基質(zhì)膠中混入相應(yīng)藥物，皮下接種小鼠，組織免疫熒光檢測基質(zhì)膠中的新生淋巴管情況。AMD3100為CXCR4拮抗劑，細(xì)胞因子為只含趨化因子CXCL12或VEGF-C的對照，IgG為同種免疫球蛋白對照，DAPI為細(xì)胞核染色(藍(lán)色)，Podoplanin代表淋巴管(紅色)。(圖7.3上)顯示激光共聚焦結(jié)果，標(biāo)尺為50 μ m，(圖7.3下)為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，***代表 P〈 0.01 。
[0048]圖8.1顯示了細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測CXCL12與VEGF-C的加和作用。如圖所示細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，用趨化因子CXCL12和血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C單獨(dú)或同時(shí)處理小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞，檢測細(xì)胞遷移能力，PBS為對照組。(圖8.1上)顯示細(xì)胞遷移結(jié)果，標(biāo)尺為100 μ m，(圖8.I下)顯示統(tǒng)計(jì)結(jié)果，*林代表P < 0.001。用趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C一起比單獨(dú)使用更能有效促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。
[0049]圖8.2顯示了細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測CXCL12與VEGF-C的加和作用。如圖所示基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)，用趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C —起比單獨(dú)使用更能有效促進(jìn)體內(nèi)新生淋巴管生成。
[0050]圖9.1顯示了人乳腺癌裸鼠模型腫瘤組織中淋巴管密度。如圖所示在構(gòu)建的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)標(biāo)記的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠模型中，用抗趨化因子CXCL12抗體和抗VEGF-C抗體單獨(dú)或聯(lián)合處理小鼠，組織免疫熒光檢測腫瘤組織中的新生淋巴管情況。IgG為同種免疫球蛋白對照，***代表P <0.001。結(jié)果顯示聯(lián)合封閉趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C，比單獨(dú)封閉一種因子能更好的抑制腫瘤組織的新生淋巴管生成。
[0051]圖10.1顯示了人乳腺癌荷瘤裸鼠淋巴結(jié)。如圖所示人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠的淋巴結(jié)組織，每組6只裸鼠，用抗趨化因子CXCL12抗體和抗VEGF-C抗體單獨(dú)或聯(lián)合處理小鼠，IgG為同種免疫球蛋白對照，分離近瘤旁的腹股溝淋巴結(jié)，標(biāo)尺為2cm。可見藥物處理組的小鼠淋巴結(jié)的腫大情況明顯好于對照組的小鼠淋巴結(jié)。
[0052]圖10.2顯示了人乳腺癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)是用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)標(biāo)記的細(xì)胞株(MDA-MB-231/eGFP)，用激光共聚焦顯微鏡可以直接觀察淋巴結(jié)組織中的人乳腺癌細(xì)胞。(圖10.2左)為激光共聚焦結(jié)果示意圖，DAPI為細(xì)胞核染色，231/eGFP為綠色熒光蛋白標(biāo)記的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231/eGFP，標(biāo)尺為50 μ m，局部放大圖，標(biāo)尺為20 μ m。(圖10.2右)為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，*林代表P < 0.001。結(jié)果顯示聯(lián)合封閉趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C，能更有效的抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
【具體實(shí)施方式】
[0053]本文中使用的術(shù)語“受試者”，指任意哺乳動(dòng)物，例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、牛，特別是靈長類動(dòng)物，如人。“受試者”可以指患病的哺乳動(dòng)物，例如患有癌癥的哺乳動(dòng)物，特別是人；也可以指未患病的健康的哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式中，“受試者”是人。
[0054]本文所用的術(shù)語“任選”(optional)表示“可有可無”或“非必需”等含義。例如，“任選的可藥用載體”是指可以含有該可藥用載體，也可以不含有該可藥用載體。這可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)情況進(jìn)行選擇。
[0055]本文所用的術(shù)語“治療有效量”指的是足以在動(dòng)物或人體內(nèi)引起獸醫(yī)或臨床醫(yī)師所尋找的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的活性化合物的量。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到給藥劑量將隨著所用的化合物、給藥方式、所需的治療和病情等因素而變化。有待治療的哺乳動(dòng)物接受的典型的日劑量范圍可以為每kg體重0.01mg至IOOmg活性成分,例如lmg/kg或2 mg/kg。如果需要的話,該日劑量可以以分割劑量的形式給藥。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的原則，所給予的活性成分的精確數(shù)量和給藥途徑取決于被治療受試者的體重、年齡、性別以及被治療的特定狀況。
[0056]本發(fā)明的活性化合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式方便地給予受試者，例如口服、靜脈注射、腹腔注射或者肌肉注射。
[0057]本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明藥物組合物的方法，其包括將活性成分與任選的可藥用載體進(jìn)行混合。本發(fā)明的組合物可以用現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的常規(guī)載體通過常規(guī)方法獲得。因此，用于口服應(yīng)用的組合物可包含例如一種或多種著色劑、甜味劑、矯味劑和/或防腐劑。
[0058]本文中使用的術(shù)語“CXCR4”指的是趨化因子受體CXCR4，是一個(gè)含352個(gè)氨基酸的視紫紅質(zhì)樣G蛋白偶聯(lián)受體。
[0059]本文中使用的術(shù)語“CXCL12”指的是趨化因子CXCL12，又稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I a (Stromal-Derived Factor-1 α , SDF-1 α ),能結(jié)合趨化因子受體CXCR4。趨化因子CXCL12是一個(gè)高度保守的趨化因子，在人和小鼠中有99%的同源性，使得趨化因子CXCL12能跨種屬作用。
[0060]本文中使用的術(shù)語“ VEGFR-3 ”指的是血管內(nèi)皮生長因子受體3 (VascularEndothelial Growth Factor Receptor-3,簡稱VEGFR-3),是細(xì)胞膜表面的酪氨酸激酶受體。[0061]本文中使用的術(shù)語“VEGF-C”指的是血管內(nèi)皮生長因子C(Vascular EndothelialGrowth Factor C，簡稱VEGF-C)，是最主要的淋巴管生成促進(jìn)因子，可以激活血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)。
[0062]本文中使用的術(shù)語“VEGF-D”指的是血管內(nèi)皮生長因子D。[0063]本文中使用的術(shù)語“CXCR4抑制劑”指的是能夠特異結(jié)合CXCR4并抑制其生物學(xué)功能的試劑，例如抗CXCR4抗體或其活性片段、CXCR4拮抗劑例如AMD3100。
[0064]本文中使用的術(shù)語“抗體”可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。
[0065]本文中使用的術(shù)語抗體的“活性片段”是指具有該抗體的結(jié)合特異性的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制備出抗體的活性片段。
[0066]本文中使用的術(shù)語“CXCL12抑制劑”指的是能夠特異結(jié)合CXCL12并抑制其生物學(xué)功能的試劑，例如抗CXCL12抗體或CXCL12拮抗劑或能競爭性結(jié)合CXCL12的CXCR4的可溶性片段。
[0067]本文中使用的術(shù)語“VEGFR-3抑制劑”指的是能夠特異結(jié)合VEGFR-3并抑制其生物學(xué)功能的試劑，例如抗VEGFR-3抗體，或抑制VEGFR-3酪氨酸激酶活性的拮抗劑，例如SAR131675、MA751、BAY57-9352、Vandetanib (凡德他尼)等。
[0068]本文中使用的術(shù)語“VEGF-C抑制劑”指的是能夠特異結(jié)合VEGF-C并抑制其生物學(xué)功能的試劑，例如抗VEGF-C抗體或VEGF-C拮抗劑或能競爭性結(jié)合VEGF-C的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段。
[0069]本文中使用的術(shù)語“VEGF-D抑制劑”指的是能夠特異結(jié)合VEGF-D并抑制其生物學(xué)功能的試劑，例如抗VEGF-D抗體或VEGF-D拮抗劑或能競爭性結(jié)合VEGF-D的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段。
[0070]為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給出本發(fā)明的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是出于解釋和說明的目的，不應(yīng)該被理解為是對本發(fā)明范圍的限制。
[0071]實(shí)施例1
[0072]淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種趨化因子受體
[0073]實(shí)驗(yàn)方法
[0074]1、細(xì)胞總RNA提取和RT-PCR檢測淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上趨化因子受體的表達(dá)
[0075]細(xì)胞總RNA的分離提取利用TRIZOL試劑(購自Invitrogen),并按照試劑說明書的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行。往離心收集的原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(約IXlO6)中加入lmLTRIZOL，用槍頭反復(fù)吹吸30次，室溫放置5分鐘。10000g，4°C離心10分鐘，輕輕吸取上清。加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩15秒左右，室溫靜置3分鐘。10000g，4°C離心15分鐘，樣品分成三層:黃色的有機(jī)相、中間層和無色的水相，水相包含我們所要的RNA，體積約為所用TRIzol試劑的60%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.5mL異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘。10000g，4°C離心
10分鐘，吸除上清，在管側(cè)和管底可見透明膠狀沉淀。加入lmL75%乙醇洗滌沉淀，乙醇用DEPC處理過的水配制。7500g，4°C離心5分鐘，棄上清。沉淀在室溫晾干，溶于50 μ LDEPC水備用。
[0076]合成第一鏈互補(bǔ)DNA 用 Fermentas 試劑盒(RevertAid? First Strand cDNASynthesis Kits)，反應(yīng)按照說明書標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。取RNAl μ g，反應(yīng)體系為20 μ L，引物用試劑盒自帶的Oligo(ClT)15，運(yùn)行程序:42°C，50分鐘；95°C，5分鐘；4°C，10分鐘。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于后續(xù)的PCR和熒光定量RT-PCR，剩余的產(chǎn)物可放置于_80°C冰箱保存。
[0077]PCR檢測淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子受體的表達(dá)譜，PCR運(yùn)行程序:95°C變性，30秒；56°C退火，30秒；72°C延伸，40秒，反應(yīng)體系為20 μ L，反應(yīng)循環(huán)數(shù)40個(gè)循環(huán)，最后是72°C保持5分鐘。內(nèi)參為GAPDH。PCR產(chǎn)物跑DNA電泳膠觀察。反應(yīng)引物如下:
[0078]CCRl 正向引物(5，-3，):CACCATCTTCCAGGAGCG
[0079]CCRl 反向引物(5，-3’):CAGTGAGCTTCCCGTTCAG
[0080]CCR2 正向引物(5，-3，):GAGCCTGATCCTGCCTCTACTTG
[0081]CCR2 反向引物(5，-3’):CCTGCATGGCCTGGTCTAAGTGC
[0082]CCR3 正向引物(5，-3，):GCTTTGAGACCACACCCTATG
[0083]CCR3 反向引物(5 ’ -3 ’): TTCAGGCAATGCTGCCAGTCC
[0084]CCR4 正向引物(5 ’ -3 ’): CCAAAGATGAATGCCACAGAG
[0085]CCR4 反向引物(5 ’ -3 ’): CGAACAGCAAATCCGAGATG
[0086]CCR5 正向引物(5，-3，):GCTGAAGAGCGTGACTGAT
[0087]CCR5 反向引物(5，_3’):GAGGACTGCATGTATAATG
[0088]CCR6 正向引物(5，-3，):GTGCCAATTGCCTACTCC [0089]CCR6 反向引物(5，-3，):GGCTCACAGACATCACGATC
[0090]CCR7 正向引物(5，-3，): TTCCAGCTGCCCTACAATGG
[0091]CCR7 反向引物(5，-3’):GAAGGTTGTGGTGGTCTCCG
[0092]CCR8 正向引物(5 ’ -3 ’): CAGGACCAGAGCCATCAAG
[0093]CCR8 反向引物(5，_3’):GATGTCATCCAGGGTGGAAG
[0094]CCR9 正向引物(5，-3’):GCTGATCTGCTCTTTCTTG
[0095]CCR9 反向引物(5，-3，):GTGCTTGGATGACTTCTTGG
[0096]CCRlO 正向引物(5，-3，):GTACGATGAGGAGGCCTATTC
[0097]CCRlO 反向引物(5，-3’):CGTGCGATGGCCACATAG
[0098]CXCRl 正向引物(5，-3，):CGTCATGGATGTCTACGTGC
[0099]CXCRl 反向引物(5，-3，):GTAGCAGACCAGCATAGTG
[0100]CXCR2 正向引物(5，-3’):AACAGTTATGCTGTGGTTGTA
[0101]CXCR2 反向引物(5，-3’):CAAACGGGATGTATTGTTACC
[0102]CXCR3 正向引物(5，-3，):GAACGTCAAGTGCTAGATGCCTCG
[0103]CXCR3 反向引物(5，-3’):GTACACGCAGAGCAGTGCG
[0104]CXCR4 正向引物(5，-3，): CTGTAGAGCGAGTGTTGC
[0105]CXCR4 反向引物(5，-3’):GTAGAGGTTGACAGTGTAG
[0106]CXCR5 正向引物(5 ’ -3 ’): CGAAGCGGAAACTAGAGCC
[0107]CXCR5 反向引物(5，-3，): CCAGCTTGGTCAGAAGC
[0108]CXCR6 正向引物(5 ’ -3 ’): CAGCTCTGTACGATGGGCAC
[0109]CXCR6 反向引物(5 ’ -3 ’): CGGTTGAAGGCCTTGGTAGC
[0110]CXCR7 正向引物(5，-3，):GACTATGCAGAGCCTGGC
[0111]CXCR7 反向引物(5 ’ -3 ’): CTTATAGCTGGAGGTGCC
[0112]CX3CR1 正向引物(5，-3’):GACGATTCTGCTGAGGCCTG[0113]CX3CR1 反向引物(5，-3’):GCCCAGACTAATGGTGAC
[0114]GAPDH 正向引物(5 ’ _3 ’): CAAGGTCATCCATGACAACTTTG
[0115]GAPDH 反向引物(5，_3，):GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG
[0116]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0117]為了研究趨化因子家族在新生淋巴管生成中的作用，首先，我們需篩選淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)了哪些趨化因子受體。趨化因子受體是表達(dá)在特定細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體，通過與細(xì)胞外配體趨化因子結(jié)合，產(chǎn)生細(xì)胞趨化反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞到特定部位。目前已發(fā)現(xiàn)的趨化因子受體主要包括:CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CXCR8、CXCR9、CXCRlO ;CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7 ;CX3CR1。利用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR的方法，我們檢測了正常培養(yǎng)的小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)這些趨化因子受體信使RNA(messenger RNA, mRNA)水平的情況。PCR的結(jié)果顯示小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體 CCR5、CCR9、CXCR4、CXCR6 和 CXCR7，低表達(dá)趨化因子受體 CCR4、CCR6、CCR8、CCR10、CXCR3和CX3CR1，而不表達(dá)其他的趨化因子受體(圖1.1)。說明淋巴內(nèi)皮細(xì)胞確實(shí)也表達(dá)趨化因子受體，趨化因子家族有可能參與調(diào)控淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性。
[0118]實(shí)施例2
[0119]趨化因子受體CXCR4在VEGF-C激活的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上特異高表達(dá)
[0120]實(shí)驗(yàn)方法
[0121]1、RT-PCR檢測淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上趨化因子受體的表達(dá)
[0122]突光定量Real-Time PCR 使用 Stratagene 試劑盒(Brilliant II SYBR?GreenQRT-PCR Master Mix)，熒光定量 PCR 儀器為 MX3000P (購自 Stratagene)，熒光染料為 SYBRGreen,反應(yīng)體系為20 μ L，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40個(gè)。內(nèi)參為GAPDH，根據(jù)儀器給出的熒光圖得到Δ Ct值，計(jì)算出相對Δ (ΔCt)值，從而計(jì)算相應(yīng)基因水平的相對變化。
[0123]2、流式細(xì)胞法驗(yàn)證血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4的表達(dá)
[0124]選取第2-3代狀態(tài)良好的小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，種植到4個(gè)6cm的培養(yǎng)皿中。兩組細(xì)胞正常培養(yǎng)，另兩組細(xì)胞當(dāng)長到80%的密度時(shí)，換成無血清無生長因子培養(yǎng)基，饑餓過夜，其中一組細(xì)胞換成含有100ng/mL VEGF-C的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)。這四組細(xì)胞進(jìn)一步流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4的表達(dá)水平，其中正常培養(yǎng)的一組細(xì)胞用作陰性對照。
[0125]用0.25 % 的乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraacetic Acid DisodiumSalt，EDTA)處理細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞。懸浮細(xì)胞并低速離心(600g，3分鐘，該實(shí)驗(yàn)低速離心均指該 速度和時(shí)間)，將細(xì)胞用1uL含10%山羊血清的PBS重懸，孵育15分鐘。
[0126]低速離心，用1mL含2%山羊血清的PBS重懸各組細(xì)胞，陰性對照組細(xì)胞中加入對照抗體，其他三組細(xì)胞中加入1μ g的CXCR4抗體(購自Abeam)。孵育30分鐘。低速離心細(xì)胞，用1mL的PBS重懸細(xì)胞并重復(fù)一次該操作，清洗未結(jié)合的抗體。
[0127]將每組細(xì)胞用ImL含2%山羊血清的PBS重懸，分別加入1ug熒光素標(biāo)記的二抗。低速離心細(xì)胞，用ImL的PBS重懸細(xì)胞并重復(fù)一次該操作，清洗未結(jié)合的二抗。最后用500 μ L PBS 重懸。利用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur Flow Cytometry System,購自 BectonDickinson)分析表面CXCR4的表達(dá)情況。[0128]3、免疫印跡法(Immuno-blotting，IB)檢測VEGF-C誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4的表達(dá)
[0129]選取第2-3代狀態(tài)良好的小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，換成無血清無生長因子的新鮮培養(yǎng)基后，饑餓過夜。換成含100ng/mL VEGF-C的培養(yǎng)基，分別處理6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后，胰酶消化離心收集細(xì)胞，用于免疫印跡檢測細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)水平。
[0130]將樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度為15% )，利用電轉(zhuǎn)儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜(購自Millipore)上，電轉(zhuǎn)儀置于冰浴中，于IOOmA轉(zhuǎn)膜3小時(shí)。配制TBST緩沖液(20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.1% Tween-20)，用于配制封閉液、一抗溶液和二抗溶液。PVDF膜進(jìn)一步在用含有5%脫脂牛奶的封閉液中室溫孵育I小時(shí)，輕輕搖動(dòng)，然后用TBST洗膜5次，每次5分鐘。
[0131]根據(jù)一抗說明書將一抗稀釋成一抗稀釋液(含有1%脫脂牛奶的TBST)，一抗包括抗 CXCR4 抗體(購自 Abeam)、抗缺氧誘導(dǎo)因子 I a (Hypoxia-1nducible TranscriptionFactorl α , HIF-1 α )抗體(購自 Santa Cruz Biotechnology)、抗 Lamin B 抗體(購自Santa Cruz Biotechnology)和抗 Actin 抗體(購自 Santa Cruz Biotechnology),與 PVDF膜孵育，輕輕搖動(dòng)，4°C過夜，TBST室溫洗膜5次，每次5分鐘。
[0132]根據(jù)說明書，將對應(yīng)種屬的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋成二抗稀釋液(含有
I%脫脂牛奶的TBST)，加入PVDF膜孵育，室溫輕輕搖動(dòng)I小時(shí)，然后用TBST洗膜5次，每次5分鐘。
[0133]成像利用ECL 檢測試劑盒(SuperSignal West Pico/Femto ChemiluminescentSubstrate,購自Thermo Scientific),在暗室中，用X光膠片(購自Kodak)進(jìn)行曝光、顯影和定影，掃描結(jié)果保存。
[0134]4、RNA干擾缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 α驗(yàn)證HIF-1 α參與VEGF-C誘導(dǎo)的CXCR4上調(diào)表達(dá)
[0135]用于干擾HIF-1a化學(xué)合成的小RNA購自Santa Cruz Biotechnology,陰性對照的小RNA購自上海GenePharma公司，RNA干擾所用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine2000 (購自Invitrogen) 0轉(zhuǎn)染過程按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。選取第2_3代狀態(tài)良好的小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞種植于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，密度達(dá)到40-50%，轉(zhuǎn)染前30分鐘換成無血清培養(yǎng)基ECM(購自Sciencell)。然后配置轉(zhuǎn)染溶液:將IOOnM的小RNA加入到100 μ L的ECM中，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，將8 μ L的Lipofectamine2000稀釋到100 μ L的ECM中，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，將小RNA稀釋液逐滴緩慢的加入轉(zhuǎn)染試劑稀釋液中，輕輕混勻，室溫靜置15分鐘。將配制好的小RNA轉(zhuǎn)染溶液逐滴緩慢的加到6孔板中，邊加邊輕輕晃動(dòng)6孔板，使其均勻分布。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6小時(shí)后，加入等量的無血清培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)過夜后，將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的正常ECM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時(shí)，免疫印跡檢測HIF-1 α干擾效率。
[0136]將分別轉(zhuǎn)染了 HIF-1 α小RNA和陰性對照小RNA的小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，換成無血清培養(yǎng)基ECM饑餓過夜后，再次換成只含100ng/mL VEGF-C的無血清培養(yǎng)基ECM和不含VEGF-C的無血清培養(yǎng)基ECM，細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理6小時(shí)。收集細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡檢測CXCR4和HIF-1a的表達(dá)情況。
[0137]實(shí)驗(yàn)結(jié)果[0138]由于腫瘤組織會(huì)分泌很多的生長因子激活淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和遷移以及新生淋巴管生成，那么被生長因子激活的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞是否會(huì)表達(dá)異常的趨化因子受體呢？淋巴內(nèi)皮細(xì)胞處于激活狀態(tài)時(shí)趨化因子受體的表達(dá)譜又是怎樣的呢。血管內(nèi)皮生長因子C(Vascular Endothelial Cell Growth Factor C,VEGF-C)是腫瘤組織中目前已發(fā)現(xiàn)的最主要的新生淋巴管生成促進(jìn)因子。我們用VEGF-C處理小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，用熒光定量實(shí)時(shí)PCR (qRT-PCR)的方法檢測能在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體的mRNA水平的變化情況。與未處理的細(xì)胞相比，熒光定量實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示當(dāng)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞被VEGF-C激活時(shí)，只有趨化因子受體CXCR4的mRNA水平明顯上調(diào)3倍左右，其他趨化因子受體沒有變化(圖 2.1)。
[0139]熒光定量實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明在mRNA水平上，VEGF-C能特異上調(diào)趨化因子受體CXCR4水平。我們進(jìn)一步從蛋白水平來證明該結(jié)果。小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞被饑餓過夜后，用VEGF-C處理，利用流式細(xì)胞方法檢測細(xì)胞表面CXCR4的蛋白水平。結(jié)果顯示VEGF-C處理確實(shí)能上調(diào)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)水平(圖2.2)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果，CXCR4處理小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞能上調(diào)CXCR4的表達(dá)水平(圖2.3)。那么VEGF-C是如何上調(diào)CXCR4的表達(dá)水平呢？作為細(xì)胞外生長因子有可能通過調(diào)控相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控趨化因子受體CXCR4的表達(dá)。已有報(bào)道表明趨化因子受體CXCR4是缺氧誘導(dǎo)因子 I a (Hypoxia-1nducible Transcription Factorl a ,HIF-1 α )的革巴基因[41]。我們的免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C確實(shí)能上調(diào)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 α的表達(dá)水平(圖2.3)。
[0140]為了進(jìn)一步驗(yàn)證缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a參與血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C上調(diào)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，我們用RNA干擾的方法敲低小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a的水平。免疫印跡結(jié)果顯示，血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了陰性對照小RNA的小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中的趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 α被RNA干擾后，血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C的刺激不能再誘導(dǎo)趨化因子受體CXCR4的表達(dá)(圖2.4)。結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 α參與了血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C上調(diào)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)。
[0141]實(shí)施例3
[0142]CXCR4在體內(nèi)新生淋巴管表面特異高表達(dá)
[0143]實(shí)驗(yàn)方法
[0144]1、組織免疫熒光法檢測趨化因子CXCR4在體內(nèi)淋巴管上的分布情況
[0145]取8只健康狀況良好的C57BL/6小鼠(6-8周齡，雌性，購自北京維通利華公司)，分為兩組，一組為正常飼養(yǎng)的小鼠3只，一組為皮內(nèi)接種5X106B16/F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞(American Type Culture Collection,ATCC)的荷瘤小鼠5只。接種14天后,取出荷瘤小鼠的腫瘤組織和瘤旁腋窩淋巴結(jié)組織，以及正常小鼠的結(jié)腸和淋巴結(jié)組織。
[0146]固定包埋。將取出的組織用4%的甲醛溶液固定過夜，然后用自來水將組織清洗過夜，洗凈甲醛(可以用紗布將組織塊包裹后，放于燒杯中，置于自來水龍頭下滴水清洗過夜)；取清洗過夜的組織進(jìn)行酒精濃度梯度脫水，酒精濃度梯度分別為:50%乙醇，70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，以上各步驟各一次，每次2小時(shí)，之后在100%乙醇中脫水2次，每次I小時(shí)，然后在二甲苯中2次，每次I小時(shí)，在液態(tài)石蠟(60°C )中2次，每次30分鐘；將脫水后的組織塊進(jìn)行石蠟包埋，包埋后可以放置于室溫長久保存；利用切片機(jī)將石蠟組織塊切成8μπι厚的切片，在37°C水中展平后，平鋪在防脫載玻片(中杉金橋公司)上，在干燥環(huán)境下55°C烤片2小時(shí)，或37°C烤片過夜。
[0147]組織復(fù)水和抗原修復(fù)。將經(jīng)過烤片的切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水，順序?yàn)?二甲苯2次，每次3分鐘；100 %乙醇2次，每次2分鐘；95 %乙醇，90 %乙醇，80 %乙醇，70 %乙醇，各I次，每次2分鐘。在PBS中清洗后，進(jìn)行檸檬酸鈉熱修復(fù)。將組織切片放在切片架上并置于大燒杯中，大燒杯中裝有IOmM檸檬酸鈉修復(fù)液(pH = 6.0)約I升，液面至少?zèng)]過組織切片2cm。在微波爐中加熱至剛好沸騰，注意不能劇烈沸騰防止組織脫片，然后調(diào)至微波爐“解凍”狀態(tài)即水溫在90-95°C之間保溫15分鐘，取出燒杯緩慢冷卻至室溫(約I小時(shí)降溫時(shí)間)，用PBS清洗一下。
[0148]組織免疫熒光染色。取經(jīng)過抗原修復(fù)的組織切片，用封閉液在濕盒中室溫封閉I小時(shí)，封閉液為含10%正常山羊血清的PBS。吸除封閉液。按照抗體說明書，直接加抗Podoplanin 一抗和抗趨化因子受體CXCR4—抗(購自Abeam)，抗體稀釋液為含1%正常山羊血清的PBS，在濕盒中室溫孵育I小時(shí)。吸除一抗液體，用PBS清洗5次，每次5分鐘。按抗體說明書，加熒光素標(biāo)記的二抗，抗體稀釋液為含I %正常山羊血清的PBS，濕盒中室溫孵育I小時(shí)。吸除二抗液體，用PBS清洗3次，每次5分鐘。用DAPI染核。用PBS清洗2次，每次5分鐘。用水溶性封片劑(Clearmount,北京中杉金橋公司)封片。通過激光共聚焦顯微鏡(Nikon Al)觀察并成像，成像軟件為NIS-Elements AR3.0。
[0149]人腫瘤組織的免疫熒光染色方法同上。
[0150]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0151]以上結(jié)果表明，小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞被生長因子VEGF-C激活時(shí)能特異上調(diào)趨化因子受體CXCR-4的表達(dá)。我們進(jìn)一步檢測趨化因子受體CXCR4在體內(nèi)淋巴管上的分布情況，尤其是正常成熟淋巴管和新生淋巴管上的表達(dá)差異。組織免疫熒光結(jié)果顯示小鼠的正常組織如結(jié)腸組織和淋巴結(jié)組織中的成熟淋巴管上沒有趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，而小鼠黑色素瘤腫瘤組織和荷瘤小鼠的前哨淋巴結(jié)組織中的腫瘤相關(guān)淋巴管高表達(dá)趨化因子受體CXCR4(圖3.1)。當(dāng)我們檢測人的腫瘤組織，包括人結(jié)腸癌組織、直腸癌組織和皮膚鱗狀上皮細(xì)胞癌組織，也同樣發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的新生淋巴管高表達(dá)趨化因子受體CXCR4(圖3.2)。有可能腫瘤激活的新生淋巴管上調(diào)表達(dá)趨化因子受體CXCR4，與我們的體外結(jié)果一致，說明趨化因子受體CXCR4在新生淋巴管上被上調(diào)表達(dá)。
[0152]實(shí)施例4
[0153]趨化因子CXCL12是一個(gè)新的淋巴管生成促進(jìn)因子
[0154]實(shí)驗(yàn)方法
[0155]1、細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)
[0156]檢測小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力使用8 μ m孔徑的Transwell吊籃(購自Costar)。吊籃放入24孔板中。選取狀態(tài)良好的第2_3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(mLECs)，分為5組，每組4個(gè)平行，每個(gè)平行樣品約2 X IO4細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來，后用200 μ L無血清新鮮內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endothelial Cell Culture Medium, ECM,購自 Sciencell)重懸，后接種到Transwell內(nèi)側(cè)小室中。外側(cè)小室中各添加800 μ L無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，外側(cè)小室的培養(yǎng)基中分別混有l(wèi)ng/mL、20ng/mL、100ng/mL的趨化因子CXCL12 (購自R&DSystems)，lOOng/mL的VEGF-C (購自R&DSystems)，以及PBS對照。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%二氧化碳，37°C正常培養(yǎng)6小時(shí)。
[0157]取出培養(yǎng)板，將Transwell放入4%多聚甲醒溶液中固定15分鐘。取出Transwell在PBS中潤洗兩次后，用0.1 %結(jié)晶紫溶液染色30分鐘，再用PBS洗凈非特異結(jié)合的結(jié)晶紫溶液。用醫(yī)用棉簽輕輕擦拭掉Transwell膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，注意膜的邊緣也要擦拭干凈，以防影響細(xì)胞計(jì)數(shù)。將Transwell吊籃放至顯微鏡(Olympus 1X71顯微鏡)下,鏡檢觀察外側(cè)膜上遷出的細(xì)胞，每組隨機(jī)拍攝8個(gè)視野并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。
[0158]2、細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)
[0159]提前在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中均勻的鋪一層無生長因子基質(zhì)膠(Matrigel，購自Becton-Dickinson Biosciences，貨號(hào):354230)，每孔約 150 μ L, 37°C放置 30 分鐘，待基質(zhì)膠凝結(jié)。選取狀態(tài)良好的第2-3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，接種到鋪有基質(zhì)膠的24孔培養(yǎng)板中，每孔約2 X IO4細(xì)胞，共5組，每組3個(gè)平行。培養(yǎng)基為含有無血清新鮮ECM培養(yǎng)基，每組分別含有 lng/mL、20ng/mL、100ng/mL 的趨化因子 CXCL12 (購自 R&D Systems)，IOOng/mL的VEGF-C (購自R&D Systems)以及PBS對照。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%二氧化碳，37°C正常培養(yǎng)6小時(shí)。在有細(xì)胞外基質(zhì)存在情況下，內(nèi)皮細(xì)胞之間會(huì)自動(dòng)連接形成管腔狀結(jié)構(gòu)。用奧林巴斯顯微鏡(Olympus 1X71顯微鏡)觀察小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，用NIH Image J軟件統(tǒng)計(jì)內(nèi)皮細(xì)胞形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的長短[43]，代表小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔狀結(jié)構(gòu)的能力。
[0160]3、體內(nèi)基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)
[0161]基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)根據(jù)之前的報(bào)道進(jìn)行[44]。準(zhǔn)備BABL/c小鼠(5周齡，雌性，購自北京維通利華公司)，共5組，每組5只小鼠。無生長因子基質(zhì)膠(Matrigel，9-10mg/mL，購自 Becton-Dickinson Biosciences)中分別混有 20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL 的趨化因子CXCL12 (購自 R&D Systems)，500ng/mL 的 VEGF-C (購自 R&D Systems)，以及 PBS 對照。將基質(zhì)膠沿著小鼠腹膜中線皮下注射入BABL/c小鼠，基質(zhì)膠在小鼠體內(nèi)成固態(tài)形成栓塞，藥物從基質(zhì)膠中緩慢釋放出來刺激小鼠新生淋巴管生成并長入基質(zhì)膠。8天后，小心取出基質(zhì)膠。
[0162]基質(zhì)膠在PBS中清洗后，在30%蔗糖溶液中4°C固定過夜。進(jìn)行冰凍切片，切片厚度約為1(^111，切片保存在-20°(:。冰凍切片用封閉液在濕盒中室溫封閉I小時(shí),封閉液為含10%正常山羊血清的PBS。吸除封閉液后，按照抗體說明書，直接加抗Podoplanin —抗(購自Santa Cruz Biotechnology),抗體稀釋液為含1%正常山羊血清的PBS,在濕盒中室溫孵育I小時(shí)。吸除一抗液體，用PBS清洗5次，每次5分鐘。按照抗體說明書，加熒光素標(biāo)記的二抗,抗體稀釋液為含1%正常山羊血清的PBS，濕盒中室溫孵育I小時(shí)。吸除二抗液體，用PBS清洗3次，每次5分鐘。用DAPI染核。之后再用PBS清洗2次，每次5分鐘。用水溶性封片劑(Clearmount，北京中杉金橋公司)封片。通過激光共聚焦顯微鏡(NikonAl)觀察并成像，成像軟件為NIS-Elements AR3.0。
[0163]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0164]前面的結(jié)果表明小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，并且在血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)激活時(shí)CXCR4表達(dá)上調(diào)，我們推斷CXCR4的配體趨化因子CXCL12能直接作用于小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)遷移。于是，我們構(gòu)建了淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的體外趨化模型。Transwell?實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的趨化因子CXCL12均可以明顯促進(jìn)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移(圖4.1)。
[0165]在新生淋巴管生成過程中，新生淋巴管從原有淋巴管“出芽”增生，遷移出來的以及新增殖的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞之間建立連接形成淋巴管的管腔。體外形成管腔狀結(jié)構(gòu)是內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)重要特點(diǎn)，也是新生淋巴管生成的重要一步。我們從管腔狀結(jié)構(gòu)形成能力的角度，體外研究趨化因子CXCL12對于新生淋巴管生成的影響。結(jié)果顯示(圖4.2)，在鋪有基質(zhì)膠(Matrigel)的培養(yǎng)皿中，趨化因子CXCL12能顯著促進(jìn)小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞形成規(guī)則的管腔結(jié)構(gòu)，并且成濃度依賴性。[0166]體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了趨化因子CXCL12能直接作用于小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力和成管能力，這兩面都是新生淋巴管生成的重要步驟。那么在體內(nèi)，趨化因子CXCL12是否能促進(jìn)新生淋巴管生成呢？我們構(gòu)建了基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)，將混有趨化因子CXCL12的基質(zhì)膠皮下注射入小鼠體內(nèi)，讓其誘導(dǎo)新生淋巴管生成，一段時(shí)間后，取出基質(zhì)膠栓塞，檢測基質(zhì)膠中新生淋巴管的情況。免疫熒光結(jié)果顯示基質(zhì)膠中混有趨化因子CXCL12時(shí)，能招募更多的小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，形成明顯的管腔結(jié)構(gòu)，并且成濃度依賴性(圖
4.3)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果也證明了趨化因子CXCL12可以有效的誘導(dǎo)新生淋巴管生成。
[0167]實(shí)施例5
[0168]CXCL12激活淋巴內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路
[0169]實(shí)驗(yàn)方法
[0170]1、抗體封閉CXCR4對趨化因子CXCL12信號(hào)通路的影響
[0171]選取狀態(tài)良好的第2-3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞,分為4組,處理前一晚換成無血清ECM培養(yǎng)基，饑餓過夜。其中I組作為對照組一直都是無血清ECM培養(yǎng)，另外3組分別換成含抗CXCR4中和抗體(5 μ g/mL,購自北京Bioss公司)，同種IgG對照(5 μ g/mL,實(shí)驗(yàn)室制備)或PBS對照的無血清ECM培養(yǎng)基，預(yù)處理30分鐘。這3個(gè)處理組細(xì)胞中加入IOOng/mL的CXCL12(購自R&D Systems)處理10分鐘。收集細(xì)胞用于免疫印跡檢測細(xì)胞中蛋白激酶B (Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)的磷酸化水平。
[0172]2、抑制信號(hào)通路對趨化因子CXCL12功能的影響
[0173]檢測小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力使用8 μ m孔徑的Transwell吊籃(購自Costar)。吊籃放入24孔板中。選取狀態(tài)良好的第2_3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(mLECs)，分為6組每組4個(gè)平行，每個(gè)平行樣品約2 X IO4細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來，后用200 μ L無血清新鮮內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endothelial Cell Culture Medium, ECM,購自 Sciencell)重懸。分別用二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide, DMS0)對照、蛋白激酶B (Akt)拮抗劑LY294002(10yM，購自 Sigma-AIdrich)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)拮抗劑 U0126 (10 μ M，購自Sigma-Aldrich)預(yù)處理30分鐘，后接種到Transwell內(nèi)側(cè)小室中。外側(cè)小室中各添加800 μ L無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM，外側(cè)小室的培養(yǎng)基中分別混有二甲基亞砜(DMSO)對照、蛋白激酶B(Akt)拮抗劑LY294002 (10 μ Μ)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)拮抗劑U0126(10yM)，又分別有一組細(xì)胞同時(shí)加入100ng/mL的趨化因子CXCL12 (購自R&DSystems)。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%二氧化碳，37°C正常培養(yǎng)6小時(shí)。染色并計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。
[0174]實(shí)驗(yàn)結(jié)果[0175]體外實(shí)驗(yàn)證明了趨化因子CXCL12能招募淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了趨化因子CXCL12能促進(jìn)新生淋巴管生成，我們進(jìn)一步檢測小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路。Hu研究組在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12能激活細(xì)胞中蛋白激酶 B(Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase, Erk)磷酸化[45]。在我們的小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞模型中，免疫印跡結(jié)果也得到了一致的結(jié)果，趨化因子CXCL12刺激能激活小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中的蛋白激酶B (Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)，但并不影響它們的蛋白水平(圖)。那么趨化因子CXCL12激活小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中的蛋白激酶B(Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)通路，是通過趨化因子受體CXCR4介導(dǎo)的么？我們用抗CXCR4中和抗體封閉趨化因子受體CXCR4，再用趨化因子CXCL12刺激小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，免疫印跡結(jié)果顯示抗CXCR4中和抗體同時(shí)也抑制了趨化因子CXCL12的活性，蛋白激酶B(Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)通路不能被趨化因子CXCL12激活，在同種免疫球蛋白IgG對照組中，趨化因子CXCL12依然能刺激蛋白激酶B (Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)的磷酸化(圖5.1)。 [0176]前面的結(jié)果表明趨化因子CXCL12能激活小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶B(Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)通路，那么蛋白激酶B(Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)是否介導(dǎo)了趨化因子CXCL12促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。在趨化實(shí)驗(yàn)中，我們分別用蛋白激酶B (Akt)通路的拮抗劑LY294002和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)的拮抗劑U0126處理細(xì)胞，這兩個(gè)拮抗劑也同時(shí)抑制了趨化因子CXCL12誘導(dǎo)的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移(圖5.2)。結(jié)果表明蛋白激酶B(Akt)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)通路參與了趨化因子CXCL12促進(jìn)新生淋巴管生成。
[0177]實(shí)施例6
[0178]CXCL12表達(dá)水平與人腫瘤組織新生淋巴管生成正相關(guān)
[0179]實(shí)驗(yàn)方法
[0180]1、組織免疫熒光檢測人腫瘤組織芯片中CXCL12表達(dá)水平和淋巴管密度
[0181]人多腫瘤組織芯片購自西安奧美公司，包含54個(gè)臨床樣本，平均年齡為55.6歲，年齡范圍為15歲到81歲，男女比例為31: 23。腫瘤類型包括:腦星形細(xì)胞瘤、食道鱗狀細(xì)胞癌、胃腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、膀胱泌尿上皮癌、心臟粘液瘤、腎透明細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、胰腺癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、乳腺非特殊性浸潤性導(dǎo)管癌、卵巢透明細(xì)胞癌、前列腺癌和睪丸精原細(xì)胞瘤，每種腫瘤類型包含3個(gè)臨床樣本。
[0182]將人腫瘤組織芯片進(jìn)行組織復(fù)水和抗原修復(fù)，用于組織免疫熒光染色，使用抗趨化因子CXCL12 —抗(購自北京Bioss公司)和抗Podoplanin —抗(購自Biolegend公司)分別檢測組織中CXCL12的表達(dá)水平和淋巴管的密度。通過激光共聚焦顯微鏡(NikonAl)觀察并成像，成像和統(tǒng)計(jì)軟件為NIS-ElementsAR3.0。
[0183]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0184]前面的研究結(jié)果表明趨化因子CXCL12是一個(gè)新生淋巴管生成促進(jìn)因子，那么在臨床上，腫瘤組織中的趨化因子CXCL12水平也應(yīng)該和新生淋巴管相關(guān)。我們使用人多腫瘤組織芯片，包含腦星形細(xì)胞瘤、食道鱗狀細(xì)胞癌、胃腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、膀胱秘尿上皮癌、心臟粘液瘤、腎透明細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、胰腺癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、乳腺非特殊性浸潤性導(dǎo)管癌、卵巢透明細(xì)胞癌、前列腺癌和睪丸精原細(xì)胞瘤等18種腫瘤組織，共54個(gè)臨床樣本，組織免疫熒光檢測趨化因子CXCL12水平和淋巴管密度，淋巴管用抗人Podoplanin抗體識(shí)別。然后根據(jù)結(jié)果將這些臨床樣本分為4組:
[0185]趨化因子CXCL12高表達(dá)和淋巴管密度高
[0186]趨化因子CXCL12低表達(dá)和淋巴管密度低
[0187]趨化因子CXCL12高表達(dá)和淋巴管密度低
[0188]趨化因子CXCL12低表達(dá)和淋巴管密度高
[0189]分別統(tǒng)計(jì)各組的臨床樣本數(shù)。結(jié)果顯示在54個(gè)臨床樣本中，各組樣本數(shù)為:
[0190]趨化因子CXCL12高表達(dá)和淋巴管密度高(21/54，占38.9% )
[0191]趨化因子CXCL12低表達(dá)和淋巴管密度低(29/54，占53.7% ) [0192]趨化因子CXCL12高表達(dá)和淋巴管密度低(2/54，占3.7% )
[0193]趨化因子CXCL12低表達(dá)和淋巴管密度高(2/54，占3.7% )
[0194]結(jié)果表明，54個(gè)臨床樣本中，有超過92%的病人腫瘤組織中趨化因子CXCL12水平與新生淋巴管密度正相關(guān)(圖6.1)，并且這一結(jié)果在多種腫瘤類型中具有普遍意義。與我們的體外和體內(nèi)結(jié)果一致。
[0195]實(shí)施例7
[0196]趨化因子CXCL12/CXCR4促進(jìn)新生淋巴管生成的活性不依賴于生長因子VEGF-C/VEGFR-3 通路
[0197]實(shí)驗(yàn)方法
[0198]1、抗體封閉CXCR4對趨化因子CXCL12趨化活性的影響
[0199]檢測小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力使用8 μ m孔徑的Transwell吊籃(購自Costar)。吊籃放入24孔板中。選取狀態(tài)良好的第2_3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(mLECs)，分為10組每組4個(gè)平行，每個(gè)平行樣品約2 X 104細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來，后用200 μ L無血清新鮮內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endothelial Cell Culture Medium,ECM,購自Sciencell)重懸。實(shí)驗(yàn)分組為:
[0200]無任何處理的對照組X2;
[0201]100ng/mL的趨化因子CXCL12處理組；
[0202]同時(shí)有同種免疫球蛋白(Immunoglobulin G, IgG)對照(5 μ g/mL)；
[0203]同時(shí)有抗CXCR4中和抗體(5 μ g/mL)；
[0204]同時(shí)有CXCR4 拮抗劑 AMD3100 (25 μ g/mL)；
[0205]100ng/mL的生長因子VEGF-C處理組；
[0206]同時(shí)有同種免疫球蛋白(IgG)對照(5 μ g/mL)；
[0207]同時(shí)有抗CXCR4中和抗體(5 μ g/mL)；
[0208]同時(shí)有CXCR4 拮抗劑 AMD3100 (25 μ g/mL)。
[0209]其中有CXCR4中和抗體組、同種免疫球蛋白組和AMD3100處理組均提前30分鐘預(yù)處理。預(yù)處理方法為:將細(xì)胞分別用抗CXCR4中和抗體(5 μ g/mL,購自北京Bioss公司)、同種免疫球蛋白(IgG)對照(5μ g/mL，實(shí)驗(yàn)室制備)和CXCR4拮抗劑AMD3100(25y g/mL，購自Sigma-Aldrich)孵育30分鐘,孵育后接種到Transwell內(nèi)側(cè)小室中。外側(cè)小室中各添加800 μ L無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM，外側(cè)小室的培養(yǎng)基按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加相應(yīng)的藥物。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%二氧化碳，37°C正常培養(yǎng)6小時(shí)。染色并計(jì)數(shù)。
[0210]2、抗體封閉VEGFR-3對趨化因子CXCL12趨化活性的影響
[0211]檢測小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力使用8 μ m孔徑的Transwell吊籃(購自Costar)。吊籃放入24孔板中。選取狀態(tài)良好的第2_3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(mLECs)，分為7組每組4個(gè)平行，每個(gè)平行樣品約2 X IO4細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來，后用200 μ L無血清新鮮內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endothelial Cell Culture Medium,ECM,購自Sciencell)重懸。實(shí)驗(yàn)分組為:
[0212]無任何處理的對照組；
[0213]100ng/mL的趨化因子CXCL12處理組；
[0214]同時(shí)有同種免疫球蛋白(Immunoglobulin G, IgG)對照(5yg/mL)；
[0215]同時(shí)有抗VEGFR-3中和抗體(5 μ g/mL)；
[0216]100ng/mL的生長因子VEGF-C處理組；
[0217]同時(shí)有同種免疫球蛋白(IgG)對照(5 μ g/mL)；
[0218]同時(shí)有抗VEGFR-3中和抗體(5 μ g/mL)；
[0219]其中有VEGFR-3中和抗體組、同種免疫球蛋白組提前30分鐘預(yù)處理。處理方法為:將細(xì)胞分別 用抗VEGFR-3中和抗體(5μ g/mL，購自北京Bioss公司)、同種免疫球蛋白(IgG)對照(5yg/mL，實(shí)驗(yàn)室制備)孵育30分鐘，孵育后接種到Transwell內(nèi)側(cè)小室中。外側(cè)小室中各添加800 μ L無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM，外側(cè)小室的培養(yǎng)基按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加相應(yīng)的藥物。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%二氧化碳，37°C正常培養(yǎng)6小時(shí)。染色并計(jì)數(shù)。
[0220]3、基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證VEGFR-3通路對趨化因子CXCL12的影響
[0221 ] 在基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)備BABL/c小鼠(5周齡，雌性，購自北京維通利華公司)，共12組，每組5只小鼠。實(shí)驗(yàn)分組為
[0222]PBS 對照組 X2;
[0223]500ng/mL 的趨化因子 CXCL12 組(購自 R&D Systems)；
[0224]同時(shí)有同種免疫球蛋白(ImmunoglobulinG, IgG)對照(10yg/mL)；
[0225]同時(shí)有抗CXCR4中和抗體(10 μ g/mL)；
[0226]同時(shí)有抗VEGFR-3中和抗體(10 μ g/mL)；
[0227]同時(shí)有CXCR4 拮抗劑 AMD3100 (50 μ g/mL)；
[0228]500ng/mL 的生長因子 VEGF-C 組(購自 R&D Systems)；
[0229]同時(shí)有同種免疫球蛋白(IgG)對照(10 μ g/mL)；
[0230]同時(shí)有抗CXCR4中和抗體(10 μ g/mL)；
[0231]同時(shí)有抗VEGFR-3中和抗體(10 μ g/mL)；
[0232]同時(shí)有CXCR4 拮抗劑 AMD3100 (50 μ g/mL)。
[0233] 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，無生長因子基質(zhì)膠(Matrigel,9-10mg/mL,購自Becton-DickinsonBiosciences)中分別均勻混入相應(yīng)的藥物。將基質(zhì)膠沿著小鼠腹膜中線皮下注射入BABL/c小鼠，基質(zhì)膠在小鼠體內(nèi)成固態(tài)形成栓塞，藥物從基質(zhì)膠中緩慢釋放刺激小鼠新生淋巴管生成并長入基質(zhì)膠。8天后小心取出基質(zhì)膠。[0234]免疫熒光檢測基質(zhì)膠中的新生淋巴管情況。通過激光共聚焦顯微鏡(NikonAl)觀察并成像，成像和統(tǒng)計(jì)軟件為NIS-Elements AR3.0。
[0235]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0236]前面的結(jié)果證明了趨化因子CXCL12是一個(gè)新的淋巴管生成促進(jìn)因子，能招募淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。那么趨化因子CXCL12是通過趨化因子受體CXCR4直接發(fā)揮作用還是也通過其他通路間接發(fā)揮作用呢？首先，體外細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)證明了趨化因子CXCR4通路能介導(dǎo)趨化因子CXCL12招募小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，用趨化因子CXCR4中和抗體或者拮抗劑AMD3100能抑制趨化因子CXCL12誘導(dǎo)的小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，但并不影響生長因子VEGF-C的活性(圖7.1)。
[0237]目前已報(bào)道的新生淋巴管生成促進(jìn)因子中，生長因子VEGF-C/D是最特異和最主要的淋巴管生成促進(jìn)因子，他們通過結(jié)合到受體VEGFR-3發(fā)揮作用。而且，VEGFR-3也能介導(dǎo)其他的淋巴管生成促進(jìn)因子如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic Fibroblast GrowthFactor, bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)的功能。那么，趨化因子CXCL12是否也會(huì)通過VEGFR-3通路間接發(fā)揮作用呢？在這里，我們檢測封閉VEGFR-3通路是否也影響趨化因子CXCL12的活性。在趨化實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)用抗VEGFR-3中和抗體處理小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，VEGF-C的活性被明顯抑制，但是并不影響趨化因子CXCL12招募小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(圖7.2)。
[0238]為了進(jìn)一步證明這一點(diǎn)，我們構(gòu)建了體內(nèi)的基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)，免疫熒光檢測基質(zhì)膠中的淋巴管密度得到了與體外趨化實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果，抗VEGFR-3中和抗體也不能抑制趨化因子CXCL12誘導(dǎo)的新生淋 巴管生成，而CXCR4中和抗體或者拮抗劑AMD3100能明顯降低趨化因子CXCL12的活性(圖7.3)。以上結(jié)果說明趨化因子CXCL12促進(jìn)新生淋巴管生成的活性不依賴于VEGF-C通路，而通過趨化因子受體CXCR4直接作用于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。
[0239]實(shí)施例8
[0240]CXCL12與VEGF-C促進(jìn)新生淋巴管生成具有加和作用
[0241]實(shí)驗(yàn)方法
[0242]1、細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測CXCL12與VEGF-C的聯(lián)合作用
[0243]檢測小鼠淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力使用8 μ m孔徑的Transwell吊籃(購自Costar)。吊籃放入24孔板中。選取狀態(tài)良好的第2_3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(mLECs)，分為4組每組4個(gè)平行，每個(gè)平行樣品約2 X IO4細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來，后用200 μ L無血清新鮮內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endothelial Cell Culture Medium,ECM,購自Sciencell)重懸，后接種到Transwell內(nèi)側(cè)小室中。外側(cè)小室中各添加800 μ L無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，外側(cè)小室的培養(yǎng)基中分別混有100ng/mL的趨化因子CXCL12 (購自R&D Systems)，100ng/mL的VEGF-C (購自R&D Systems)，或同時(shí)加入趨化因子CXCL12和VEGF-C，以及PBS對照。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%二氧化碳，37°C正常培養(yǎng)6小時(shí)。染色并計(jì)數(shù)。
[0244]2、基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)檢測CXCL12與VEGF-C的聯(lián)合作用
[0245]在基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)中。準(zhǔn)備BABL/c小鼠(5周齡，雌性，購自北京維通利華公司)，共12組，每組5只小鼠。實(shí)驗(yàn)分組為
[0246]PBS 對照組 X2;
[0247]500ng/mL 的 CXCL12 組(購自 R&D Systems)；[0248]500ng/mL 的生長因子 VEGF-C 組(購自 R&D Systems)；
[0249]同時(shí)有500ng/mL 的 CXCL12 和 500ng/mL 的生長因子 VEGF-C 組
[0250]按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),無生長因子基質(zhì)膠(Matrigel,9-10mg/mL,購自Becton-DickinsonBiosciences)中分別均勻混入相應(yīng)的藥物。將基質(zhì)膠沿著小鼠腹膜中線皮下注射入BABL/c小鼠，基質(zhì)膠在小鼠體內(nèi)成固態(tài)形成栓塞，藥物從基質(zhì)膠中緩慢釋放刺激小鼠新生淋巴管生成并長入基質(zhì)膠。8天后小心取出基質(zhì)膠。
[0251]免疫熒光檢測基質(zhì)膠中的新生淋巴管情況。通過激光共聚焦顯微鏡(NikonAl)觀察并成像，成像和統(tǒng)計(jì)軟件為NIS-Elements AR3.0。
[0252]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0253]既然趨化因子CXCL12是一個(gè)新生淋巴管生成促進(jìn)因子，并且臨床結(jié)果也表明趨化因子CXCL12的表達(dá)量與腫瘤新生淋巴管密度正相關(guān)(圖6.1)，提示趨化因子CXCL12有可能是一個(gè)很好的靶點(diǎn)，用于抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。考慮到趨化因子CXCL12與生長因子VEGF- C是兩個(gè)獨(dú)立淋巴管生成促進(jìn)因子，有可能他們主要扮演著不同的角色，腫瘤組織分泌生長因子VEGF-C來激活正常的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，而腫瘤組織中大量存在的趨化因子CXCL12可以招募這些激活的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其往腫瘤組織遷移運(yùn)動(dòng)。我們推測趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C在促進(jìn)新生淋巴管生成方面具有加和作用。
[0254]為了研究這一點(diǎn)，我們首先在體外驗(yàn)證趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C同時(shí)存在具有加和作用或是協(xié)同作用。細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C分別都可以促進(jìn)小鼠淋巴內(nèi)皮的遷移，而同時(shí)用趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C處理能取得更好的效果，約是單個(gè)因子作用效果的2倍(圖8.1)。我們又在體內(nèi)新生淋巴管生成的基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)中，分別將CXCL12和VEGF-C單獨(dú)或者同時(shí)混入基質(zhì)膠中，檢測基質(zhì)膠中新生淋巴管生成的情況。與體外細(xì)胞遷移結(jié)果一致，趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C —起作用能更明顯的促進(jìn)新生淋巴管生成(圖8.2)。
[0255]實(shí)施例9
[0256]同時(shí)封閉趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C能更有效抑制腫瘤新生淋巴管生成
[0257]實(shí)驗(yàn)方法
[0258]1、人乳腺癌裸鼠原位瘤模型
[0259]人乳腺癌細(xì)胞株為MDA-MB-231 (購自 American Type Culture Collection,ATCC),利用增強(qiáng)型綠色突光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)慢病毒試劑盒(購自上海Gen印harma公司)構(gòu)建穩(wěn)定的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的MDA-MB-231細(xì)胞株(MDA-MB-231/eGFP)，構(gòu)建方法按試劑盒說明書進(jìn)行。
[0260]以24孔板為例,選取狀態(tài)良好的第2-3代小鼠原代淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(mLECs),每孔加入細(xì)胞5 X IO4個(gè)，0.5mL正常的含胎牛血清的ECM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)過夜。配備病毒稀釋液:含10%胎牛血清、終濃度5 μ g/mL的聚凝胺(Polybrene，可有效提高轉(zhuǎn)染效率)、ECM培養(yǎng)基，將提前確定好滴度的慢病毒10 μ L按10倍稀釋3-5個(gè)梯度。移去過夜的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入配備好的病毒稀釋液0.5mL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)，8-12小時(shí)以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，若與對照組無明顯差異，表明毒性作用低，可不換液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，再次將細(xì)胞培養(yǎng)基換成ImL正常的含胎牛血清ECM培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)。由于是原代細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)染4天后觀察綠色熒光蛋白GFP熒光，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞I周以上適時(shí)的換液和傳代，保證細(xì)胞狀態(tài)良好，最后即可得到穩(wěn)定的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的MDA-MB-231細(xì)胞株(MDA_MB_231/eGFP)。
[0261]準(zhǔn)備健康良好的裸鼠(Nude Mice,購自北京維通利華公司)，雌性、6_8周齡。收集增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記MDA-MB-231細(xì)胞株(MDA_MB_231/eGFP)，與基質(zhì)膠(Matrigel，購自Becton-Dickinson Biosciences)等比例混合均勻，按照每只裸鼠接種3X IO6細(xì)胞懸液IOOyL,皮下接種到小鼠靠近腹股溝的乳房脂肪墊。分為4組，每組6只小鼠，實(shí)驗(yàn)分組為:
[0262]同種免疫球蛋白(IgG)對照組(2mg/kg)；
[0263]抗趨化因子CXCL12中和抗體組(2mg/kg)；
[0264]抗生長因子VEGF-C中和抗體組(2mg/kg)；
[0265]同時(shí)含抗趨化因子CXCL12中和抗體(lmg/kg)和抗生長因子VEGF-C中和抗體(lmg/kg)組。
[0266]按照實(shí)驗(yàn)分組，每天給裸鼠腹腔注射相應(yīng)藥物。3周后，取出腫瘤組織和近瘤旁的腹股溝淋巴結(jié)，拍片。
[0267]將取出的腫瘤和淋巴結(jié)組織，固定包埋，組織復(fù)水和抗原修復(fù)。
[0268]組織免疫熒光染色。取經(jīng)過抗原修復(fù)的腫瘤組織切片，組織免疫熒光染色抗Podoplanin 一抗(購自 Santa Cruz Biotechnology),通過激光共聚焦顯微鏡(NikonAl)觀察并成像，成像和統(tǒng)計(jì)軟件為NIS-Elements AR3.0。
[0269]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0270]既然趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C是兩種獨(dú)立的作用機(jī)制，都參與調(diào)控新生淋巴管生成，并且聯(lián)合使用在促進(jìn)新生淋巴管生成方面具有加和作用，我們嘗試用抗體同時(shí)封閉趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C，希望能有效抑制腫瘤新生淋巴管生成，從而治療腫瘤轉(zhuǎn)移。我們構(gòu)建了人乳腺癌裸鼠原位模型，來研究聯(lián)合阻斷趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C控制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移的情況。先利用慢病毒構(gòu)建了穩(wěn)定的增強(qiáng)型綠色突光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)標(biāo)記的 MDA-MB-231細(xì)胞株(MDA-MB-231/eGFP)，可用于體內(nèi)觀察乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況。裸鼠乳房脂肪墊接種腫瘤后，小鼠腹腔給藥，注射抗趨化因子CXCL12中和抗體和抗生長因子VEGF-C中和抗體。分離小鼠腫瘤組織，組織免疫熒光檢測腫瘤淋巴管密度情況，激光共聚焦的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示抗趨化因子CXCL12中和抗體能明顯降低乳腺癌腫瘤組織中新生淋巴管密度，而同時(shí)封閉趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C可以比它們單獨(dú)封閉能更好的抑制腫瘤新生淋巴管生成(圖 9.1)。
[0271]實(shí)施例10
[0272]同時(shí)封閉趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C能更有效抑制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移
[0273]實(shí)驗(yàn)方法
[0274]人乳腺癌裸鼠原位瘤模型中，淋巴結(jié)組織切片，可用于直接觀察轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)中的帶強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞。不需要經(jīng)過免疫熒光染色，直接用DAPI染核，用PBS清洗5次，每次5分鐘。用水溶性封片劑(Clearmount，北京中杉金橋公司)封片。通過激光共聚焦顯微鏡(Nikon Al)觀察并成像，成像和統(tǒng)計(jì)軟件為NIS-ElementsAR3.0。[0275]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0276]在人乳腺癌裸鼠原位模型中，我們?nèi)〕龊闪鲂∈蟮陌┡愿构蓽狭馨徒Y(jié)，分析乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。觀察荷瘤小鼠的癌旁淋巴結(jié)，抗體處理組小鼠的腹股溝淋巴結(jié)的腫大情況要明顯好與同種免疫球蛋白(IgG)對照組的小鼠(圖10.1)。
[0277]因?yàn)槿橄侔┘?xì)胞株是綠色熒光蛋白標(biāo)記的，可以在共聚焦顯微鏡下直接觀察淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步觀察顯示同時(shí)封閉趨化因子CXCL12和生長因子VEGF-C組的小鼠淋巴結(jié)幾乎沒有轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞(圖10.2)。該結(jié)果證實(shí)了我們的設(shè)想，一方面封閉趨化因子CXCL12能抑制乳腺癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移，另外，同時(shí)阻斷趨化因子CXCL12通路和生長因子VEGF-C通路的抗體聯(lián)合多靶點(diǎn)治療可以更有效的控制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。
[0278]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑在制備用于抑制受試者中新生淋巴管生成的制劑中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述CXCR4抑制劑選自:抗CXCR4抗體或其活性片段、CXCR4拮抗劑AMD3100， 所述CXCL12抑制劑選自:抗CXCL12抗體、CXCL12拮抗劑和競爭性結(jié)合CXCL12的CXCR4的可溶性片段。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述受試者患有腫瘤、炎癥和/或移植排斥反應(yīng)。
4.CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑在制備用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述CXCR4抑制劑選自:抗CXCR4抗體或其活性片段、CXCR4拮抗劑AMD3100， 所述CXCL12抑制劑選自:抗CXCL12抗體、CXCL12拮抗劑和競爭性結(jié)合CXCL12的CXCR4的可溶性片段。
6.(a) CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，以及(b) VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑在制備用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述CXCR4抑制劑選自:抗CXCR4抗體或其活性片段、CXCR4拮抗劑AMD3100， 所述CXCL12抑制劑選自:抗CXCL12抗體、CXCL12拮抗劑和競爭性結(jié)合CXCL12的CXCR4的可溶性片段， 所述VEGF-C抑制劑選自:抗VEGF-C抗體、VEGF-C拮抗劑和競爭性結(jié)合VEGF-C的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段， 所述VEGF-D抑制劑選自:抗VEGF-D抗體、VEGF-D拮抗劑和競爭性結(jié)合VEGF-D的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段， 所述VEGFR-3抑制劑選自:抗VEGFR-3抗體和抑制VEGFR-3酪氨酸激酶活性的拮抗劑。
8.用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥物組合物，包括: 作為活性成分的:(a) CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，和(b) VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑，以及 任選的可藥用載體。
9.用于抑制腫瘤患者中的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的藥盒，包括: (a)CXCR4抑制劑和/或CXCL12抑制劑，以及 (b)VEGF-C抑制劑和/或VEGF-D抑制劑和/或VEGFR-3抑制劑。
【文檔編號(hào)】A61K45/06GK103736092SQ201310340853
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月9日
【發(fā)明者】羅永章, 卓巍, 賈琳, 付彥, 常國棟 申請人:清華大學(xué), 北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司