基于微囊化化學試劑延時產生一氧化氮的系統和方法
【專利摘要】本發明公開了一種通過微囊化的水溶性化學試劑在聚合物基質中的反應、長時間持續產生和應用治療性一氧化氮氣體的組合物和方法，所述組合物包含由兩種或更多種亞毫米尺度的分別微囊化的試劑顆粒組成的混合物，包括至少一種微囊化的亞硝酸鹽顆粒、至少一種微囊化的酸顆粒和至少一種微囊化的還原劑顆粒，所述分別微囊化的試劑在通過添加足夠體積的水溶液來初期濕潤這些亞毫米尺度的顆粒時緩慢釋放，呈現足夠的量來反應而產生一氧化氮。所述微囊化試劑可以應用于水凝膠中，也可以直接或者通過醫療器械（比如治療性的敷料或繃帶）應用于治療部位。在另一些應用中，這些微囊化的化學前體在有限體積內保持物理上彼此密切接近，利用同一體積內存在的有限量的溶劑提取并處理試劑以形成NO。
【專利說明】基于微囊化化學試劑延時產生一氧化氮的系統和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于局部產生和應用一氧化氮的組合物和方法。
【背景技術】
[0002]在不限制本發明范圍的情況下，它的背景可以被描述為有關一氧化氮在醫學上的指征的應用，和局部延時產生和應用一氧化氮(NO)的組合物和方法。
[0003]NO的生物學重要性已被證實，見Lancaster JR, Proc Natl AcadSci(1996)91:8137-41;Ignarro et al， Proc Natl Acad Sci(1987)84:9265-69;reviewedin Bredt DS, J CellScience(2003) 115:9-15;reviewed in Murad F, N Engl JMed(2006) 355:2003-11。在哺乳動物中，NO在神經系統、免疫系統和心血管系統的很多生理過程中是一種內源性的生理調節物質。這些作用包括血管平滑肌松弛，導致動脈的血管舒張和血流增加。NO是一種神經遞質，與神經元的活動和各種功能有關，從回避學習到男性和女性生殖器勃起(Kim et al., J.Nutritionl34 (2004) 2873S) ? NO也具有部分調節巨噬細胞對微生物和腫瘤細胞的細胞毒性作用。NO除了介導正常的生理功能外，還涉及感染性休克、高血壓、中風和神經退行性疾病等不同的病理生理狀態。
[0004]NO 以各種形式應用在藥理學上。見 Butler and Feelisch, Circulation(2008) I17:2151-59。然而，必須注意的是，NO本身是高活性的，在空氣中或在體內是化學不穩定的。因此，其藥理應用幾乎總是涉及其產生，通過不同的各種單獨穩定的前體化合物的化學反應產生。有機和無機硝酸鹽作為NO供體，如硝酸甘油和硝普鈉，已長期用于糾正NO缺乏狀態或調節許多組織的活動。局部應用NO可以幫助創傷和燒傷的傷口愈合、毛發生長、陽痿、以及在需要的地方導致血管擴張(例如，促進由于糖尿病或其它條件受損的患者外周血流量的流通和在孕期子宮頸的成熟)。局部高濃度的NO (例如眼睛、皮膚等)會產生耐受。史密斯等人介紹了被認為是有利于促進愈合的聚合物一氧化氮源(U.S.Pat.N0.5，519，020)。
`[0005]在局部應用的范圍內，要求NO的劑量是低的、持久性的。NO作為一個強大的殺菌劑，對抗生素有抗藥性的細菌是有效的。在抗菌和其它的局部應用中，需要延長NO與皮膚接觸的時間。在抗菌應用中，NO有效治療劑量是很少的，只有百萬分之幾(ppm)(見Ghaffariet al., Nitric Oxide Biology and Chemistryl4 (2006) 21-29)),但NO 的有效性取決于維持與皮膚接觸的時間長短(Ormerod et al., BMCResearch Notes4 (2011) 458-465)。
[0006]Seitz 等的 U.S.Pat.N0.6，103，275 和一項專利申請(US Ser.N0.13/688，511，filedll-29-2012)公開了一種局部釋放NO的技術，其公開內容通過引用包含于此。然而，這種技術提供局部產生NO持續不到一小時，因此需要一個可選的方法，以提供許多治療性應用所需的長時間的NO皮膚接觸的時間。

【發明內容】

[0007]本發明公開治療上有效量的NO的局部藥物應用的組合物、方法和醫療設備，NO是通過試劑反應產生的，其中的部分或全部試劑的初始狀態是微囊化的。[0008]在一個實施方式中，微囊化試劑在膠狀組合物(包含與微囊化試劑反應的試劑的溶液)中反應，緩慢地從微囊中釋放。這個實施方式提供了一種延長時間的緩釋NO。
[0009]在另一實施方式中，公開了兩個或更多的微囊化的水溶性試劑，反應形成長時間的緩釋NO的治療劑。
[0010]目前公開的還有一個方法，在這個方法中含有水溶性試劑的微粒與一定量的水(這些水只能濕潤微粒的表面)接觸。這個方法是特別有用的，因為它大大延長了試劑的釋放時間，超出了將只有一種類型的微囊浸潰在過量水中時所觀察到的釋放時間。反過來，與緩釋的、基于直接釋放的、來源于微囊化載體的單一治療劑相比，這種方法延長了該治療劑可用的時間。
[0011]在一個實施方式中，公開了一種產生延時釋放治療性一氧化氮的方法，包括提供了由兩種或更多種亞毫米級微粒組成的混合物，其中每個類型的顆粒只包含一種微囊化試劑。該混合物包括至少一種微囊化的亞硝酸鹽，至少一種微囊化的酸，至少一種微囊包封的還原劑，和激活體積(足夠激活初期潤濕微囊試劑顆粒)的水，其特征在于，所述激活體積的水，是添加到微囊化試劑中，延長時間的NO釋放通過亞硝酸中間體來引發。在一個實施方式中，抗壞血酸同時作為酸和還原劑。
[0012]在某些實施方式中公開了在傷口敷料或繃帶上提供亞毫米級尺度微囊化試劑的混合物。這個亞毫米級微囊化試劑可以在防潮的單位劑量的容器中密封，直至使用。當需要時，打開容器，使試劑給藥到需要治療的組織部位。該容器可以是傷口敷料或繃帶，或者是可倒在或灑在組織上的干燥粉末試劑包。在一個實施方式中，配合給藥說明，激活體積的無菌水和單位劑量的試劑一起提供。在某些實施方式中，提供了多個預測量的水，包括一個激活體積和一個或多個再激活體積，按照說明書在起始激活后間隔一定時間加入再激活體積的水。在一些實施方式中根據說明提供了套裝形式的試劑和激活/再激活的水或水凝膠。
[0013]本發明中通過化學試劑的微囊化生成NO的方法是有用的，因為它公開了通過化學穩定的前體來長時間生產不穩定化合物(如NO)。多個微囊化試劑在干燥的環境中便利地儲存，混合和彼此接觸產生NO可以通過將少量的水添加到前體混合物從而簡單地引發。可選的，這樣的微囊化試劑的混合物可以被直接施加到傷口，其中傷口環境本身提供了足夠量的水，導致治療量的NO釋放。一個更大的優勢是，所用的試劑和水占據的體積相對較小，促進本發明結合到尺寸有限的物品上。這樣的物品包括傷口敷料、繃帶和其他體型薄的及同樣體型小的醫療用品，如血管支架和其他支架、導尿管、心臟起搏器、除顫器、心臟輔助裝置、人工瓣膜、電極、整形外科螺絲和銷、和其他常規植入或插入體內的醫療物品。
[0014]在另一個實施方式中，微囊化亞硝酸鹽與凝膠形態的激活試劑混合。凝膠減慢亞硝酸鹽和激活試劑之間的相互作用，產生更高水平的溶解性NO，同時延長了 NO的釋放。與將兩種或更多種分別含有適當試劑的顆粒一起浸入到過量的水或水性液體中時所觀察到的量相比，本實施方式所公開的材料和方法導致在超過幾個小時的時間內NO產生量的增加。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1A是一個實施方式中含有微囊化試劑的混合物(反應生成NO)的墊的剖視圖。
[0016]圖1B是一個包含保持微粒適當位置的內部組件的墊的剖視圖。[0017]圖1C是一個實施方式中吸收層包含微囊化試劑(反應產生NO)的墊的剖視圖。
[0018]圖2反映的是將含有亞硝酸鈉與玉米蛋白(一種植物蛋白)的微囊化顆粒IOmg加入到如實施例1中所述的抗壞血酸的酸性溶液中時NO的釋放情況。
[0019]圖3反映的是實施例3中的amiN0-700探針和所用的微囊化粉末混合物的放置情況。
[0020]圖4反映的是將乙基纖維素基質中含有抗壞血酸的微囊化顆粒IOmg與乙基纖維素基質中含有亞硝酸鈉的微囊化顆粒IOmg進行混合，在實施例3中所描述的初期潮濕時，釋放NO的情況。
[0021]圖5反映的是將玉米蛋白基質中含有抗壞血酸的微囊化顆粒IOmg與玉米蛋白基質中含有亞硝酸鈉的微囊化顆粒IOmg進行混合，在實施例4中所描述的、用200微升的水使之成為潮濕的糊狀物時，釋放NO的情況。在零(O)指定的時間，通過加入水到該混合物顆粒中，形成糊狀物。
[0022]圖6反映的是實施例5中的數據，即在第一組(圓圈)較低濃度的羥乙基纖維素和第二組(十字)較高濃度的乙基纖維素溶液中，加入實施例1中所用類型的亞硝酸鈉微粒10毫克(IOmg)后所測量得到的一氧化氮的濃度。第一組和第二組的羥乙基纖維素的濃度分別為0.73g/100ml和2.18g/100ml。第一組和第二組測得的NO濃度的峰值分別是0.022微摩爾/升和0.324微摩爾/升。如兩條曲線所示，在指定的時間零(O)時加入微囊化的亞硝酸鈉。
[0023]詳細說明
[0024]本發明公開了通過微囊化一氧化氮產生試劑來釋放長效劑量的一氧化氮在局部應用中的方法、裝置和試劑組合物。在一個實施方式中，微囊化載體是一種聚合物基質。所述試劑和基質一起置于亞毫米級的結構內(至少有一個尺度規格不到I毫米)。這種結構可以是微粒、纖維或薄膜。
[0025]本發明采用的藥學上可接受產生NO的方式依賴于亞硝酸(HNO2)的化學性質。根據下面的反應式(I)可見，通過無機亞硝酸鹽與酸(HA)反應產生亞硝酸。亞硝酸低溫時在水溶液中是穩定的，但在室溫下，它容易分解成NO和NO2，如反應式(2)所示。
[0026]在還原劑(如抗壞血酸，二羥基抗壞血酸(Asc (OH)2))的存在下，NO2很容易轉化為NO，如下面的反應式(3)所示。
[0027]2HA+NaN02 — 2HN02+2NaA (I),
[0028]HA是一種有機酸
[0029]2HN02 — N0+N02+H20 (2),
[0030]亞硝酸分解，生成二氧化氮
[0031 ] N0+N02+H20+Asc (OH)2 — 2N0+2H20+Asc02 (3),
[0032]抗壞血酸反應，除去二氧化氮
[0033]本發明的一個實施方式中，微囊化的試劑與一個組分混合，該組分為延時產生一氧化氮的試劑的釋放和反應提供了一個適當的環境。當微囊化材料與水(或水溶液)接觸時，液體緩慢滲透微粒，隨著時間的推移，產生NO的試劑被緩慢地釋放出來，然后參加反應生成NO。
[0034]本發明的一個實施方式中，利用微囊化的亞硝酸鹽和足夠酸度的酸化水凝膠接觸，轉化亞硝酸鹽為一氧化氮。優選的，在凝膠中包含還原劑，以幫助保持一氧化氮的生物活性。雖然無機酸如硼酸，也可能是合適的，但優選的酸化劑采用有機酸，如檸檬酸。其它酸化劑還可以包括乳酸、甘油酸、甲酸或那些在本【技術領域】的技術人員已知的其它的有機酸。也可以采用生物學上可接受的、有適當PKa值的無機酸(例如上述的硼酸)。酸化劑也可以是還原劑，如抗壞血酸(維生素C)或抗壞血酸衍生物。所述抗壞血酸衍生物包括但不限于3-0-乙基抗壞血酸以及其它3-烷基抗壞血酸、6-0-辛酰基-抗壞血酸、6-0-十二烷酰基-抗壞血酸、6-0-十四烷酰基-抗壞血酸、6-0-十八烷酰基-抗壞血酸和6-0-癸二酰-抗壞血酸。優選的還原劑具有防止或減慢一氧化氮氧化為二氧化氮的還原能力，并且還具有直接還原NO2為NO的能力，從而使由該組合物中釋放的氣體主要是NO。優選的還原劑包括抗壞血酸、抗壞血酸衍生物、抗壞血酸的鹽、生育酚，異抗壞血酸或α_生育酚。凝膠劑包括羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、明膠、瓊脂、天然樹膠、淀粉和果膠等物質。
[0035]溶解酸和還原劑的介質可以是水介質或非水介質。優選水介質，容易制備凝膠。酸凝膠組合物可另外含有一個或多個所使用的酸的共軛堿。雖然優選的堿是使用的酸的共軛堿，但也可以是那些本【技術領域】的技術人員已知的其它有機堿或無機堿。本發明的實施方式可直接應用于促進皮膚的循環、加快傷口愈合，在頭皮上保持一段時間作為一種治療以促進頭發生長，并且可被應用在其它局部釋放NO有益的位置。
[0036]本發明的一個實施方式公開了一種套裝的酸化的凝膠和微囊化的亞硝酸鹽。酸化的凝膠和微囊化的亞硝酸鹽，都是單獨包裝在防潮包裝中，在應用混合物前，打開包裝，將它們的內容物立即混合在一起。在另一個可供選擇的實施方式中，微囊化的亞硝酸鹽和酸化劑被一起或單獨包上防潮包裝。在應用前，打開包裝，用定量的水或中性PH的含水凝膠混合它們的內容物。
[0037]另一個實施方式，公開了兩種或兩種以上微粒的混合物，其中每個類型的微粒只包括一種微囊化試劑。該混合物中包含全部彼此反應產生NO的試劑。比如，在該混合物中，一種類型的顆粒包含亞硝酸鈉，另一種類型的顆粒包含抗壞血酸，當它們在溶液中同時釋放時反應產生NO。包含微囊化試劑的顆粒們在限定體積內保持相互接近，該限定體積內存在的限定量的水用來萃取和處理試劑，以產生醫學上的治療劑。
`[0038]限定量的水是指足夠初期潤濕干燥的微囊化的試劑顆粒從而允許試劑相互作用發生化學反應的水。初始潤濕是指干燥的試劑顆粒加入液體后，這些液體足夠潤濕試劑顆粒，不存在多余的液體。
[0039]本發明的一個實施方式，公開了微囊化的亞硝酸鹽、微囊化的酸和微囊化的還原劑。各種亞硝酸鹽，最常見的無機亞硝酸鹽如亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、亞硝酸鈣或任何的堿金屬亞硝酸鹽或堿土金屬亞硝酸鹽都是可用的。某些情況下選用還原劑從而具有防止或減慢一氧化氮氧化為二氧化氮的還原能力，并且還具有直接還原NO2為NO的能力，從而使由該組合物釋放的氣體主要是NO。合適的還原劑包括抗壞血酸、抗壞血酸鹽、生育酚(特別是包括α-生育酚)、異抗壞血酸、類胡蘿卜素、生育三烯酚和硫醇。
[0040]檸檬酸是一種可接受的有機酸。其它酸可包括乳酸、甘油酸、甲酸或其它本【技術領域】的技術人員已知的有機酸。也可以用有適當PKa值的、生物學上可接受的無機酸(例如硼酸)。一個實施方式公開了用抗壞血酸作為酸，此時抗壞血酸既作為有機酸也作還原劑。對于亞硝酸鹽,抗壞血酸(維生素C)是一種生物相容性的還原劑。[0041]微囊的一種制作方法:將一種試劑的溶解液或聚合物溶液噴霧干燥，產生細小分散的單個微粒(內部包含分散在聚合物基質內的試劑)的粉末。也可以使用其它微囊的制作方法，如鍋包衣、空氣懸浮包衣、離心擠壓、纖維紡絲、纖維擠壓、噴嘴振動、離子型凝膠化、凝聚相分離、界面交聯、原位聚合法和基質聚合。
[0042]為了適用于醫療適應征，本文公開的封裝聚合物是生物相容的聚合物。適合的聚合物包括乙基纖維素、天然聚合物如玉米蛋白(一種在某些禾本科植物如玉米和谷物中發現的醇溶種子儲存蛋白)、脫乙酰殼多糖、透明質酸、藻酸、可生物降解的聚酯、聚酐、聚乙烯(原酸酯)、聚磷腈或多糖(見 Park et al.，MoleculeslO (2005) 146-161 )。
[0043]上文所述的試劑微囊化的組合物用在藥物試劑輸送是眾所周知的。見Shalabyand Jamiolkowskij US Pat.N0.4，130，639; Buchholz and Meduskij US Pat.N0.6，491，948。然而，在所有這些組合物中，微囊化的試劑是治療劑本身，治療劑不是通過微囊化的試劑的反應產生的。涉及一氧化氮加合物/供體的一氧化氮釋放聚合物在醫學文獻中已有描述，例如Arnold, US Pat.N0.7，829，553 ( 二醇二氮烯翁碳基附著在疏水聚合物上);Knapp，USPat.N0.7，135，189 (亞硝基硫醇的前體和一氧化氮供體)。
[0044]本發明實施方式的應用包括直接應用微膠囊化試劑到傷口、傷口敷料、外科敷料、褥瘡患者(或可能發展成患者)的床上護具、襪子、適合糖尿病和其它循環障礙患者的其他服裝、骨科石膏，以及用于血管擴張劑在治療性功能障礙時的NO局部遞送。本發明還能滿足與常規植入或插入身體的醫療用品(如血管支架、導管、心臟起搏器、除顫器、心臟輔助裝置、人工閥、電極、以及骨科螺釘和引腳)相關的、對少量而持久的NO劑量的需要。
[0045]本發明可以是一個傷口敷料包或繃帶包，所述傷口敷料的一部分包含由一種微囊化試劑的顆粒和另一種含微囊化試劑的顆粒組成的混合物。這部分敷料還結合了一種有保水性能的材料，以保持使顆粒處于潮濕環境時所需的適量的水分。潤濕敷料啟動試劑反應，敷料開始釋放NO。敷料經過設計使得在傷口附近釋放NO。
[0046]本發明的一個實施方式公開了一種多用途的、源于分層襯墊的延時釋放NO技術。如圖1A所示的橫截面:兩種或多種類型的微粒混合物I包含在層2和層3之間，其中層2和層3中至少一個是面向身體層以傳輸氣態NO，同時至少一個是面朝外的層，這個面朝外的層具有不滲透或有保留水分性能(允許應用的液體傳輸到微粒里和/或維護微粒處于潮濕環境)。在希望襯墊的一側提供NO的應用中，層2或層3的其中之一是不滲透NO的。在兩種或多種的亞毫米級的微粒混合物中，每種的顆粒只包含一種微囊化試劑。在水溶液環境中，從顆粒轉化形成的試劑相互結合產生NO。當水被引入到該襯墊時，試劑開始釋放，NO開始產生。
[0047]在如圖1B所示的實施方式方式中，，外層2和3被一個隔離層4所分離，層4用于維持外層之間距以及保持微粒層的適當位置。含有的試劑微粒可被嵌入或以其它方式固定在隔離層4上，或者外層2或3中任意一個的內表面上。
[0048]如圖1所示類型的襯墊可以制備成任何指定的尺寸和形狀。圖1A-C中的垂直尺寸沒有比例，吸水材料5可以比含有試劑的襯墊厚很多。
[0049]這樣的襯墊有多種應用。它們可以通過放置于在傷口上并覆蓋一個適宜的黏合醫用膠帶層而簡單地使用。它們也可以納入預先制成的繃帶或敷料。可選的，繃帶或敷料配有一個小包，小包含有反應生成NO的微囊化試劑。此外，試劑可以被附著至不同的材料層，然后組裝在一起形成完整的繃帶或敷料。
[0050]圖1所示其它結構的襯墊可以作為長期持久的抗菌擦拭布。這種襯墊可以改編尺寸，插入到循環障礙患者的服裝如襪子或緊身褲。通過對材料邊緣和包含顆粒的襯墊結構進行合適處理，襯墊本身也可以作為循環障礙患者的襪子、手套和其它服裝的織物。這些服裝可以通過來自患者皮膚的自然水分激活或通過添加的水分激活。
[0051]本發明的另一個實施方式是圖1C所示的層墊，所述墊層由上述含有微粒的襯墊、吸收層或滲透層5和位于它下面的不透水層6組成。這種吸收層墊適合于已經或正在開始發展成褥瘡的患者。這類患者通過尿失禁和汗水，會產生適量的水分。水分將激活產生NO的襯墊，并且多余的水分會被襯墊下面的吸收層吸收。這樣的安排將褥瘡沐浴在NO中，一氧化氮刺激褥瘡愈合，防止潰瘍面積的進一步擴大。
[0052]在不同的應用中，小劑量的NO局部應用到陰莖從而快速刺激雄性大鼠陰莖勃起已被證明是非常有效的(Han et al., Journal of Sexual Medicine7 (2010) 224)。本發明公開了了用于人類的類似效果的NO的局部應用。目前性功能障礙的全身性藥物有多種副作用，而且需要一段時間才能生效。就可控制性和沒有預期的全身性副作用而言，這種速效、局部治療的藥物是非常需要的。產生NO的試劑可以被作為適于放置在勃起組織的敷料上的干燥涂層。一個實施方式是用作男用或女用避孕套的內部敷料。將應用到勃起組織的敷料潤濕從而激活所述試劑，延時釋放NO。
[0053]本發明的另一個實施方式，避孕套內表面涂有涂層，所述涂層包含由分別微囊化的試劑組成的混合物，當在水溶液中時，微囊化試劑相互反應產生NO。本實施方式的微粒尺寸范圍可以是0. 01到100微米，優選范圍為I一 10微米。較小的微粒尺寸有利于制備涂層時附著于避孕套內表面，NO釋放的時間尺度為分鐘，而不是小時。在采用這樣的實施方式中，用戶在戴上避孕套之前將一個含水化合物如K-Y膠狀物(由McNEIL-PPC，Inc.，Ft.Washington, PA生產)應用到勃起組織上，。當微粒接觸到含水化合物開始釋放NO。釋放的NO被限制在避孕套內直到其被勃起組織透皮吸收以刺激和延長勃起。
[0054]本發明的另一個實施方式，是一種性喚起的凝膠試劑套裝，包含一種類似K-Y膠狀物的含水凝膠化合物包裝和一種含分別微囊化試劑混合物的防潮包裝，所述試劑在在水溶液中一起反應產生NO。使用前，打開包裝混合含水凝膠，應用于男性/女性使用者的外生殖器，刺激其血液流動，從而促進陰莖和陰蒂勃起。這種套裝可用于治療性功能障礙，和提高男性和女性的性生活滿意度。
[0055]雖然沒有人類的臨床研究，但是對大鼠的研究表明，Seitz等(US Pat.N0.6，103，275)所描述的凝膠組合物能夠刺激毛發生長。眾所周知，局部血管擴張藥如米諾地爾可有效緩解人類的脫發和刺激頭發生長，因此持久的低劑量NO (NO是一種有效的血管舒張劑)的局部應用很可能對脫發有治療效果。因此，在這里所公開了另一個延時釋放的規劃應用在于緩解脫發和刺激頭發再生的設備和組合物。一個具體的實施方式是由如圖1所示材料組成的頭形狀的帽子，用于治療脫發。將帽子制作成適合于在病人頭部的禿頭區域應用，用水濕潤來激活它。
【具體實施方式】
[0056]實施例1:從一種類型顆粒緩釋的試劑范例[0057]通過噴霧干燥由亞硝酸鈉、玉米醇溶蛋白和揮發性溶劑組成的溶液來制備以玉米醇溶蛋白為基質的含有10% (重量百分比)亞硝酸鈉的微粒。玉米醇溶蛋白是從玉米中獲得的富含脯氨酸的蛋白質，作為包衣和封裝的基質可用于加工食品和藥品。它由美國食品藥物管理局(FDA)列為一般公認安全(GRAS)。該溶液為10%的玉米醇溶蛋白(FloChemicals, 29Puffer St., Ashburnham, MAO1430 (Lot F40000111C6))分散在由乙醇:水(90:10)組成的混合物中。將該溶液分散到使用旋轉盤霧化器的干燥器中，以這種方式形成的微粒直徑范圍在10至100微米之間，這些微粒包含亞硝酸鈉分散于其中的玉米醇溶蛋白基質。玉米醇溶蛋白是不溶于水的，當微粒暴露于水時，水慢慢地擴散到玉米醇溶蛋白基質中溶解亞硝酸鈉，含有亞硝酸鈉的溶液慢慢地從顆粒中擴散出來，從而產生了亞硝酸鈉相當長一段時間的釋放。
[0058]制備100毫升(100ml)的水溶液，其中含有5.6g檸檬酸、5.2g抗壞血酸和 0.3g 的 PE9010 (一種防腐劑，由 Schiiand Mayr 生產，30Two BridgesRoad Suite225, Fairfield, NJ07004, USA)。將 40 毫升(40ml)的該溶液放置于燒杯中，用配備amiN0-700探針的inNO-T的一氧化氮測量系統(InnovativeInstruments, Inc., Tampa, FL33637)檢測溶液中的NO濃度。將10毫克(IOmg)包含玉米醇溶蛋白微囊化的亞硝酸鈉的微粒，在指定的時間零時(O )加入到該溶液中，記錄溶液中的NO含量，結果如圖2所示。圖2的曲線顯示了在3小時的期間內，NO的產生在加入微粒后被引發，迅速上升到峰值，然后顯著減少。約20分鐘時，產生的NO從液體中形成，因此測量得到的一氧化氮輪廓線表征NO生產率，所述NO源于從微囊化顆粒中散發的亞硝酸鈉和溶液中的酸按照前述反應式(I) - (3)所發生的反應。
[0059]實施例2:當微囊化試劑暴露于過量的水中時最小限度NO產生的范例
[0060]通過噴霧干燥由抗壞血酸、玉米醇溶蛋白和揮發性溶劑組成的溶液制備以玉米醇溶蛋白為基質的10% (重量百 分比)抗壞血酸的微粒。所述微粒的直徑在10至100微米之間。將10毫克(IOmg)的抗壞血酸微粒與IOmg實施例1中所用的亞硝酸鈉微粒混合。將該混合物加入到含有40毫升去離子水的燒杯中，繼續攪拌。水中的NO含量采用與實施例1中使用的相同的裝置監測。在三個小時的監測中，沒有觀察到可檢測到的NO。
[0061]實施例3:當微囊化試劑初期潤濕時NO長期生成的范例
[0062]通過噴霧干燥由亞硝酸鈉、乙基纖維素和揮發性溶劑組成的溶液制備以乙基纖維素為基質的亞硝酸鈉的顆粒(亞硝酸鈉重量比10%)。該溶液是將12.5%的乙基纖維素(Ethocel Standard7from Dow Chemicals (LotU105013T01))分散于乙醇中制得的。將該溶液使用旋轉盤霧化器分散到干燥器中。所得微粒的直徑在10至100微米之間。此外，通過噴霧干燥由抗壞血酸、乙基纖維素和揮發性溶劑組成的溶液制備以乙基纖維素為基質的抗壞血酸的顆粒(抗壞血酸重量比10%)。該溶液是將12.5%的乙基纖維素(EthocelStandard7from Dow Chemicals (Lot U105013T01))分散于乙醇中制得的。將該溶液使用旋轉盤霧化器分散到干燥器中。所得微粒的直徑也在10至100微米之間。
[0063]將每種類型的10毫克微粒混合到一起，放置于一個有小褶皺的稱量紙上。如圖3所示，amino-700的探針針尖插入并完全由粉末混合物覆蓋。用200微升(200 μ I)的去離子水濕潤粉末混合物(在圖4標記“I”的時間)，用紙吸收多余的水。這樣微粒在處于初始濕潤狀態時，水主要駐留在微粒表面和微粒之間的狹窄間隙。接下來記錄NO信號達5個半小時。如圖4所示，在前半個小時內NO產量上升，在接下來的4個小時里慢慢地下降，在總時間為4個半小時后，NO信號突然地呈直線下降趨于零。信號中的下降是由于樣品中的水全部蒸發。信號下降之后(在圖4標記“2”的時間)，額外加入100微升(100 μ I)去離子水，信號再次升高，證實了這個結論。與實施例1中所觀察到的相比，此NO釋放的長效性的結果是令人驚奇的。
[0064]實施例4:在潮濕的糊劑中微囊化試劑NO長期生成的范例
[0065]在實施例1和實施例2中使用的每個微粒(即，玉米醇溶蛋白基質中含有10% (重量百分比)亞硝酸鈉的微粒和玉米醇溶蛋白基質中含有10% (重量百分比)抗壞血酸的微粒)各10毫克(IOmg)混合到一起,置于一個小的塑料半圓柱體中。如圖3所示,amino-700的探針針尖完全由粉末混合物覆蓋，類似實施例3中使用的布置。用200微升的去離子水濕潤混合物，達到一致的潤濕糊劑狀態，接下來記錄NO信號8小時。
[0066]如圖5所示的該記錄,第一個小時NO產量緩慢上升,然后在接下來至少7個小時(在此時中斷實驗)內保持相對穩定。與實施例1的結果相比，此NO釋放的恒定性和長效性的結果是令人驚奇的。
[0067]首先，值得注意的是，在實施例2 (其中沒有觀察到NO的釋放)、實施例3和實施例4 (大量釋放NO)之間，即使用于實驗的試劑是相同重量的，測量的NO量卻有顯著的差異。這種差異是令人驚訝的，但不被理論所限制，至于為什么出現這種情況可以考慮幾種可能性。在實施例2中的NO生產過程的環境，本質上與實施例3和4中的不同，而這些差異突出本發明的一些方面。
[0068]NO在空氣和體內是不穩定的，作為治療劑的使用要求單獨穩定的前體通過化學反應產生NO。在實施例3和實施例4中，化學前體(例如試劑微囊化的微粒)的儲層在有限的體積內保持彼此近距 離的物理接觸，存在于同一體積內的有限量的溶劑用來提取和處理試劑以形成NO。如上所述的這些化學前體被微囊化，推動持續的長時間的釋放NO。實施例2的特點是試圖通過簡單的將兩個微囊化試劑引入到具有較大體積的水性藥物制劑中，或簡單地將它們引入血液和消化道，以產生延時釋放劑量的NO。試劑從密封的載體中迅速釋放，它們之間的相互反應速率顯著減慢。此外，在如反應式(I) - (3)所示的生成NO的特定情況下，眾所周知反應速率是PH敏感的，溶液pH值接近中性7時，反應速率降低為零。在實施例2中，降低溶液pH值的試劑只有從微囊載體中釋放出的抗壞血酸。當抗壞血酸很稀時，它不能引起整個溶液的PH值降到一個允許反應以顯著的速率繼續產生NO的足夠低的值。然而，在實施例3和4 (這是本發明的實施方式)的情況下，試劑被分配到彼此靠近的顆粒中，并且溶解該試劑的溶劑量是非常小的。因此，局部的試劑濃度高于實施例2幾個數量級。產生NO的反應可以更迅速地進行，因為高的試劑濃度和使反應的pH值濃度大幅降低的高的局部抗壞血酸濃度，使得反應可以繼續以更快的速率進行，在時間單位內產生更多的NO。
[0069]進一步令人驚訝的結果是，實施例1其中NO釋放在3小時內大幅度減少)、實施例3 (其中NO釋放持續約5小時)和實施例4 (NO釋放持續相對恒定的水平至少8小時)在具有時間依賴性的NO釋放方面對比顯著。
[0070]在實施例1中，含有微囊化的亞硝酸鈉顆粒被引入到包括檸檬酸和抗壞血酸的酸溶液中。引入這些顆粒后，溶液立即開始擴散到顆粒中，溶解封裝的NaN02。其后，如反應式(O- (3)所示的產生NO的反應發生在顆粒本身內部，或者發生在溶解的NaNO2W顆粒中擴散到酸溶液中之后。這種情況下的特點是，通常應用的微囊化的、隨時間釋放活性成分的組合物中的活性成分是微囊化的，隨后活性組分被引入到一個環境，在該環境中活性成分從微囊載體中釋放，活性成分成為這種環境下的少量成分。一般情況下，隨著微囊載體的微囊包封材料供應的減少，微囊化物質的釋放速率隨時間降低。圖2展示了實施例1中時間依賴性的NO的產生情況，可以看出這種下降的特征。
[0071]在實施例1中，NO的產生基本上在3小時內顯著下降，在實施例3和4中，NO的產生在至少7小時內持續在一個相當恒定的速率。這種差異是令人驚訝的，在某些不同的應用如傷口敷料中，該差異將是特別有用的。因為人們期望保持傷口沐浴在低濃度的NO中，以促進傷口愈合以及提供防止細菌的保護。不受限于理論，這種延時釋放特性的有效改進的解釋在于化學前體(例如微囊化的試劑微粒)儲層的布置，這些化學前體在有限體積內保持物理上彼此密切接近，利用同一體積內存在的有限量的溶劑提取并處理試劑以形成NO。在此配置中，微囊化試劑提取和反應過程的動力學比實施例1所代表的微囊化試劑延遲時間釋放的傳統應用中的相應動力學更為復雜。在實施例3和4中，從亞毫米級微粒中提取微囊化試劑在極小量水時就可發生，因此在微粒表面的試劑濃度非常高。可能是這些局部升高的濃度，改變了試劑擴散出微粒的動力學，因為顆粒由內到外試劑濃度梯度較小減緩了擴散。
[0072]此外，由于高濃度的試劑存在，一種溶解的試劑擴散到另一種包含可與其反應的試劑的顆粒中將變得更為可能。在發生這種情況時，氣態的NO可能在微粒內產生。在發生擴散的通道內產生氣體可能減緩在這些通道中的液體擴散，而液體擴散對于將試劑從微囊化的顆粒中攜帶出來是必要的。因此，總NO產率可能會降低，因為少量的NO形成在顆粒內部
[0073]實施例5微囊化試劑在不同濃度的凝膠劑存在下長時間釋放NO的范例
[0074]第一組較低粘度的凝膠形式的酸溶液制備如下:0.73克羥乙基纖維素(HEC)、5.6克檸檬酸、5.2克抗壞血酸和0.3克PE9010混合，添加水至100毫升。第二組較高粘度的凝膠形式的酸溶液制備如下:2.18克羥乙基纖維素(HEC)、5.6克檸檬酸、5.2克抗壞血酸和
`0.3克PE9010混合，添加水至100毫升。這些溶液與實施例1中使用的溶液之間的唯一區別是存在的HEC凝膠，HEC是一種來源于纖維素的水溶性聚合物。在這個實施例中使用的HEC平均分子量750000，當與HEC混合后，溶液變成高粘度的凝膠。用HEC制備的兩種溶液與實施例1中使用的溶液相比，粘性增強。兩個凝膠溶液用實驗室的攪拌裝置可以很容易的攪拌，但高HEC濃度的溶液粘性更大。
[0075]制備的第一組溶液25毫升(25ml)放置在燒杯中，連續不停地攪拌。用配置amiN0-700探針的inN0_T —氧化氮測量系統檢測溶液凝膠中的NO濃度。將實施例1中所使用的10毫克(IOmg)的NaNO2微粒，弓丨入到凝膠溶液中，記錄凝膠溶液中的NO濃度3小時。當微粒被引入到凝膠溶液中，可以觀察到微粒的周圍生成小氣泡。
[0076]制備的第二組溶液25毫升(25ml)放置在燒杯中，連續不停地攪拌。用配置amiN0-700探針的inN0_T —氧化氮測量系統檢測溶液凝膠中的NO濃度。將實施例1中所使用的10毫克(IOmg)的NaNO2微粒，引入到凝膠溶液中，記錄凝膠溶液中的NO濃度8小時。當微粒被引入到凝膠溶液中，與第一組相比，觀察到的泡沫生成要少，泡沫產生的時間要短。[0077]圖6所示是在第一組(圓圈)低粘度的溶液和第二組(十字)高粘度溶液中，分別引入實施例1中使用類型的的亞硝酸鈉微粒10毫克(IOmg)后測得的NO濃度比較。較高濃度的HEC溶液釋放NO的時間明顯更長。第二組溶液(含有2.18g/100ml HEC)中的NO濃度達到的峰值超出第一組溶液一個數量級，大約在8小時衰減到其峰值的一半，而第一組溶液(含有0.73g/100ml HEC)的NO濃度大約在I小時衰減到其峰值的一半。差異是顯著的。當HEC濃度較高時，初始微囊化試劑的化學反應釋放的一氧化氮能更有效的轉移到溶液中。
[0078]不受理論約束，要理解NO濃度在高濃度和低濃度的HEC凝膠劑之間的差異，有兩種效果要考慮。這些效果是從微粒中移走NaNO2的動力學以及液體中形成的NO的轉移。
[0079]從微粒中移走NaNO2的動力學，取決于水擴散到微粒中和含有溶解NaNO2的溶液擴散到微粒外的情況。微粒溶液的擴散流動在微粒內不規則地發生，為溶液流動提供通道。HEC是大的、水溶性分子聚合物，當它存在于溶液中，它顯著地增加溶液的粘度，并抑制在微粒中通道內的溶液的擴散流動。因此，NaNO2W微粒中到溶液外的釋放是大幅度放緩的。可以預見，顆粒內外擴散的減慢和預先用于微粒中的HEC的濃度成比例，而且這樣的擴散減慢是與當顆粒被引入高HEC濃度的溶液后觀察到的微粒四周形成氣泡的數量減少相一致的。[0080]當富含NaNO2的溶液最終從微粒中擴散出來，NaNO2在酸性環境中迅速反應產生NO。NO相當緩慢地溶解到周圍的溶液中，如果NO的產生率比較高，NO填充的氣泡將形成于微粒的表面，當氣泡變得足夠大時，氣泡會遷移到液體中。一旦氣泡在液體中變得游離漂浮，它將前往液體的表面，破裂，把NO分散到液體上方的空氣中。在氣泡形成的過程和在液體的運輸過程中，NO也溶解到液體中。如果氣泡的形成過程是快速的，氣泡駐留在微粒表面的時間很短，它們被迅速釋放到液體中。如果氣泡通過液體上升迅速，它們將有效地運輸大部分NO逸出液體，這些NO是不會溶解的。
[0081]HEC減緩微粒中的NaNO2擴散(與HEC的濃度成比例)，因此，減緩了最初發生在微粒表面上的氣泡的形成過程。反過來，較慢氣泡的形成提供了氣泡中的氣態NO和液體之間一段較長時間的接觸，增加了 NO溶解到液體中的部分。事實上，如果從微粒中釋放的NO足夠慢，NO的釋放速率可能會等于或小于NO溶解在液體中的速率，沒有游離的氣泡被釋放進入到液體中，所有的NO將被溶解。因此，由于較高濃度的HEC降低NO的生產速率，更大部分的NO將溶解于較高濃度的HEC溶液中。
[0082]另一個較高濃度的HEC溶液增加溶解NO量的因素是，因為較高濃度的HEC溶液比低濃度的HEC溶液的粘性凝膠的粘性高，如果NO氣泡離開微粒的表面，成為游離的NO氣泡，它們駐留在液體中的時間更長。這種游離NO氣泡的緩慢運輸，提供了額外的NO溶解在液體中的一個額外的機會。
[0083]在較高濃度的HEC中，上述動力學效果更顯著。因此，在較高濃度的HEC溶液中，因為可減少NO的形成速率，以及隨之而來地提高了 NO向液體中的轉移，較高濃度的HEC溶液形成了一個非常顯著高的NO濃度，而且長時間的保持NO的高濃度，如圖6所示。
[0084]在此公開和要求權利保護的所有的組合物和/或方法，在目前的公開下可以不經過度的實驗而制造和執行。雖然以優選實施例的形式描述了本發明的組合物和方法，對本領域技術人員顯而易見的是，可以將變形應用于組合物和/或方法，以及本文所述方法的步驟或步驟的順序，而不脫離本發明的概念、精神和范圍。更具體地，顯而易見地，化學和生理上相關的一些藥物可以替代本文所述的藥物而達到類似的結果。所有這些對本領域技術人員顯而易見的替 代和改變都被認為是在所附權利要求所限定的本發明的精神、范圍和概念內。
【權利要求】
1.一種治療性一氧化氮的延時釋放系統，其包含由兩種或更多種亞毫米尺度的分別微囊化的試劑顆粒組成的混合物，包括至少一種微囊化的亞硝酸鹽顆粒、至少一種微囊化的酸顆粒和至少一種微囊化的還原劑顆粒，所述分別微囊化的試劑在通過添加足夠體積的水溶液來初期濕潤這些亞毫米尺度的顆粒時緩慢釋放，呈現足夠的量來反應而產生一氧化氮。
2.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述亞硝酸鹽是亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、亞硝酸鈣、堿金屬亞硝酸鹽和堿土金屬亞硝酸鹽中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述酸是下列有機酸中的一種或多種:檸檬酸、乳酸、甘油酸、甲酸和抗壞血酸。
4.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述酸是硼酸。
5.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述還原劑是抗壞血酸、抗壞血酸衍生物、抗壞血酸鹽、生育酚、異抗壞血酸、類胡蘿卜素、生育三烯酚和硫醇中的一種或多種。
6.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述酸是檸檬酸，所述還原劑是抗壞血酸。
7.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述試劑被封裝在下列一種或多種聚合物中:乙基纖維素、玉米醇溶蛋白、脫乙酰殼多糖、透明質酸、藻酸、可生物降解的聚酯、聚酐、聚乙烯(原酸酯)、聚磷腈和多糖。
8.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述微囊化的酸和微囊化的還原劑均為微囊化的抗壞血酸或微囊化的抗壞血酸衍生物。
9.根據權利要求1所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述混合物被布置在一個分層的襯墊中，分層襯墊含有由亞毫米級的微囊化試劑組成的混合物。
10.根據權利要求9所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述分層襯墊包括一個朝向外部的不滲透層、朝向身體的透水層和夾在中間的由亞毫米尺度的微囊化試劑組成的混合物層。
11.根據權利要求9所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述分層襯墊設置成適合于傷口敷料或繃帶的尺寸。
12.根據權利要求9所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述分層襯墊的尺寸設置成適合于插入到襪子、手套、帽子和其他服裝中或作為制作的襪子、手套、帽子和其他服裝的一部分。
13.根據權利要求9所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述分層襯墊設置成適合于床墊的尺寸。
14.根據權利要求9所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述分層襯墊設置成適合于抗菌抹布的尺寸。
15.根據權利要求1-8任一權利要求所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統，其特征在于，所述混合物被布置在避孕套中。
16.根據權利要求1-11中任一權利要求所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統在促進傷口愈合方面的應用。
17.根據權利要求1-10和權利要求12中任一權利要求所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統在促進脫發再生方面的應用。
18.根據權利要求1-10中任一權利要求所述的治療性一氧化氮的延時釋放系統在克服性功能障礙方面的應用。
19.一種提供延時釋放的治療性一氧化氮的方法，包括如下步驟: 將至少一種微囊化的亞硝酸鹽、至少一種微囊化的酸和至少一種微囊化的還原劑混合，制得亞毫米級的微囊化試劑的混合物； 加入足夠體積的用于激活的水溶液來初期潤濕微囊化的試劑，通過亞硝酸中間體反應來引發NO的延時釋放。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述微囊化的酸和微囊化的還原劑共同由微囊化的抗壞血酸和/或微囊化的抗壞血酸衍生物提供。
21.根據權利要求19所述的方法，其特征在于，將所述微囊化的試劑置于傷口敷料或繃帶上。
22.根據權利要求19所述的方法，其特征在于，將所述微囊化的試劑置于床墊上。
23.根據權利要求19所述方法，其特征在于，將所述微囊化的試劑置于安全套內。
24.一種為患者提供延時釋放的治療性一氧化氮的成套用品，包括: 亞毫米級微囊化試劑的混合物，所述混合物包括至少一種微囊化的亞硝酸鹽，至少一種微膠囊化的酸和至少一種微膠囊化的還原劑； 一個激活體積的水或水凝膠，足以與微囊化試劑混合； 所述微囊化的試劑通過添加水或水凝膠而緩慢釋放，和水或水凝膠呈現足夠的量來通過亞硝酸中間體反應而生成一氧化氮。
25.根據權利要求24所述的成套用品，其特征在于，所述微囊化的酸和微囊化的還原劑共同由微囊化的抗壞血酸和/或微囊化的抗壞血酸衍生物提供。
26.根據權利要求24或25所述的成套用品，其特征在于，所述微囊化試劑置于傷口敷料或繃帶上，所述一個激活體積的水或水凝膠置于一個預先測量好的容器中。
27.根據權利要求24或25所述的成套用品，其特征在于，還包括說明書，指導患者將所述亞毫米尺度的微囊化試劑混合物應用于患處，并添加激活體積的水或水凝膠于試劑。
28.根據權利要求27所述的成套用品，其特征在于，所述說明書還指導患者在試劑變干燥時加入再激活體積的水或水凝膠于試劑。
29.根據權利要求24或25所述的成套用品，其特征在于，還包括至少一個再激活體積的、置于預先測量好的容器內的水或水凝膠。
【文檔編號】A61P17/02GK103690490SQ201310356220
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年8月15日 優先權日:2012年8月23日
【發明者】陳振興, 費里德·穆拉德, 肯尼斯·史密斯, 威廉·賽茨, 威廉·梅爾, 安里克斯安德魯·巴拉班 申請人:臺灣尼奧克斯生物科技股份有限公司