火木層孔菌中麥角甾酮在抗禽流感h5n1病毒上的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種從火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel（裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）發酵液和子實體中分離的具有抗禽流感活性的麥角甾酮。本發明首次公開了麥角甾酮的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。本方法較一般化合物應用的優點在于：發現了這種特殊的麥角甾酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【專利說明】火木層孔菌中麥角留酮在抗禽流感H5N1病毒上的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013年8月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC N0.8108，分類名稱為火木層孔菌Phellinusigniarius，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
【背景技術】
[0002]麥角留醇是一種重要的植物留醇(見留族化合物)，為留類化合物。存在于酵母和麥角中。CAS號:57-87-4,分子量:396.66，分子式C28H44O,相對密度1.04，，熔點168°C(含1.5摩爾水的結晶)(166~183°C)，沸點250°C。
[0003]麥角留酮是麥角留醇的輕度氧化物，具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗禽流感病毒活性的報到。

【發明內容】

[0004]本發明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的麥角甾酮。本發明首次公開了這種麥角留酮的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。
[0005]本發明的技術方案如下:
首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%`
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20~35°C溫度，搖瓶轉速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養7~15天；培養中當pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20~35°C，發酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉/分的條件，培養7~15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0006](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ；
(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90%，乙醇優選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優選為濃縮液體積的3-6倍；
(5)對步驟(4)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0007]2.分離麥角甾酮的方法:
(1)將步驟I中所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，置于通風設備處干燥并攪拌，然后進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；
(2)將步驟(1)中最后一次洗脫液等體積硅膠拌樣，進行硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(3)收集步驟(2)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；
(4)用步驟(3)得到的產物進行TLC制備，制備展開劑為氯仿:甲醇=20:1-30:1，刮板后裝柱，用洗脫劑洗脫；
(5)收集步驟(4)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為一種麥角甾酮。
[0008]優選的，提取步驟⑴中所述的硅膠為100-200目正相硅膠，洗脫劑為氯仿和/或
甲醇；
提取步驟(2)中所述的硅膠用量為1-3倍體積，洗脫劑為氯仿；
提取步驟(3)中所述的凝膠為S^hadex LH-20，洗脫劑為甲醇或丙酮；
提取步驟(4)所述的反相硅膠為反相C-8、C-18，洗脫劑為乙酸乙酯；
提取步驟(5)中TLC檢測要點是出現紅色斑點，展開劑為氯仿:甲醇=30:1-35:1。
[0009]然后使用得到的麥角留酮進行對MDCK細胞毒性的測定，確定其半數中毒濃度(CC50)及最大安全濃度；
最后在最大安全濃度范圍內進行樣品在MDCK細胞水平上對H5N1毒株的作用，計算樣品的半數毒性濃度(CC5tl)和半數有效濃度(EC5tl),得到樣品的選擇指數(SI)=CC5tl / EC50,計算抑制率。
[0010]本方法較一般化合物應用的優點在于:發現了該種麥角留酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
[0011](四)【具體實施方式】 實例1:
火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養7天；培養中當PH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度25°C，發酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養7天，即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液制備火木層孔菌粗提物。 [0012](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0013]將上述得物稱取350g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，然后進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿:甲醇=100:1，氯仿:甲醇=500:1，氯仿:甲醇=100:1.每種洗脫劑洗脫體積分別為3，3，3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1，Fr-2, Fr_3。將Fr_3等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為氯仿。收集上述洗脫液，使用TLC檢測，適度合并，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析。減壓蒸干，收集洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，合并收集出現斑點的洗脫液。進行TLC制備，制備，展開劑為氯仿:甲醇=20: 1，刮板，裝柱，乙酸乙酯洗脫，合并洗脫液，減壓干燥，即為一種麥角甾酮。進行1D-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結果為δ 6.61 (d, J= 9.4 Hz, 6H), 6.03 (d, J = 9.5 Hz, 6H)，5.74 (s, 6H)，5.23 (dd, J = 10.1, 7.6Hz, 20H), 3.06 - 2.37 (m, 31H), 2.37 - 1.98 (m, 55H)，1.90 - 1.46 (m, 83H)，
1.53 - 1.45 (m, 17H), 1.57 - 1.46 (m, 21H), 1.06 (d, J = 6.6 Hz, 21H), 1.04-0.59 (m, 170H).表明其為 4，6，8 (14)，22-四烯-3 -麥角甾酮。
[0014](7)采用 步驟(6)得到的麥角甾酮進行對MDCK細胞毒性的測定，確定其半數中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0015]在96孔板上，10(^1/孔加入4父1051111-1濃度的MDCK細胞懸液，培養24 h后，
在單層細胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重復3孔，并設正常細胞對照。置37°C，5%C02培養箱中培養48 h后，棄培養液上清，100 μ I/孔加入5 mg.ml-lMTT的維持液，繼續培養Ih后，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振蕩5_10 min，待結晶完全溶解，酶標儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。當加樣組的OD492值不顯著低于細胞對照組OD492時，此濃度即為樣品的最大安全濃度。
[0016]表1麥角甾酮各濃度對細胞生長的影響
【權利要求】
1.麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用。
2.如權利要求1所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于麥角留酮是從火木層孔菌提取的，提取步驟順序如下:: (1)制備火木層孔菌粗提物； (2)將步驟(1)中所得的沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，置于通風設備處干燥并攪拌，然后進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液； (3)將步驟(2)中最后一次洗脫液等體積硅膠拌樣，進行硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (4)收集步驟(3)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (5)用步驟(4)得到的產物進行TLC制備，制備展開劑為氯仿:甲醇=20:1-30:1，刮板后裝柱，用洗脫劑洗脫； (6)收集步驟(5)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為一種麥角甾酮。
3.如權利要求2所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于所述火木層孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20~35°C溫度，搖瓶轉速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養7~15天；培養中當pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20~35°C，發酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉/分的條件，培養7~15天，即可得到火木層孔菌菌絲體發酵全液； (2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ； (3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90% ； (4)對步驟(3)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ； (5)將將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
4.如權利要求3所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于所述液體培養基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。
5.如權利要求2所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于，提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠。
6.如權利要求2所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于，步驟(2)中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和甲醇混合液。
7.如權利要求2所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為氯仿。
8.如權利要求2所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為S^hadex LH-20，洗脫劑為甲醇或丙酮。
9.如權利要求2所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于，步驟(5)所述的TLC制備，制備展開劑為氯仿:甲醇=20:1，洗脫劑為乙酸乙酯。
10.如權利要求2所述的麥角留酮在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特征在于，步驟(6)所述的檢測要點是出現斑`點，展開劑為氯仿:甲醇=30:1-35:1。
【文檔編號】A61P31/16GK103816163SQ201310401666
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】趙晨, 宋愛榮, 孔超, 楊松, 秦丹 申請人:青島農業大學