西藏綿頭雪兔子提取物在緩解果蠅腸道炎癥中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明是西藏綿頭雪兔子提取物在緩解果蠅腸道炎癥中的應用。采用水提法得到西藏綿頭雪兔子提取物，對西藏綿頭雪兔子提取物進行果蠅腸道免疫功能損傷模型修復實驗，結果發現西藏綿頭雪兔子提取物具有良好的抗炎、抗氧化活性，可用于制備抗炎藥物,尤其是抗腸道炎癥的藥物。
【專利說明】西藏綿頭雪兔子提取物在緩解果蠅腸道炎癥中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及西藏綿頭雪兔子提取物在緩解果蠅腸道炎癥方面的應用，涉及果蠅天然免疫【技術領域】。
【背景技術】
[0002]腸粘膜每天接觸大量的食物、細菌和病毒等不同的抗原類物質，在腸道中，對病原微生物產生免疫反應以及在消除病原微生物的同時，對食物抗原及其它正常的腸腔內容物產生免疫耐受等，都需腸粘膜屏障發揮作用。對抗病原微生物的腸粘膜免疫可分為先天性免疫和后天獲得性免疫，其中先天性免疫構成腸粘膜屏障的基礎。腸道先天性免疫是腸道重要的防御機制，是宿主抵御病原微生物和有害物質的第一道防線。
[0003]果蠅缺乏哺乳動物所具有的獲得性免疫系統，即體內沒有T細胞和B細胞，也沒有抗體和補體系統，只能通過天然免疫系統對病原微生物的侵染做出應答。另外，果蠅和哺乳動物的腸道具有相似的結構和功能；腸道干細胞的分化機制以及天然免疫機制也十分相似。因此可以利用果蠅作為研究哺乳動物免疫反應的模型，更重要的是可以利用其揭示與人類相關疾病的產生。當果蠅腸道受到外界環境刺激時，其腸道上皮細胞會對內部和外部因子做出應答，如產生活性氧(reactive oxygen species, R0S)和各種抗菌肽(antibacterial peptides)來清除入侵的病原微生物,從而維持其腸道內環境穩態。
[0004]綿頭雪兔子(Saussurea laniceps Hand.-Mazz.)為菊科風毛菊屬植物,又名綿頭雪蓮花、麥朵剛拉(西藏)，具有解毒除濕之功效，用于治療風濕痹癥、通經、癲癇等。綿頭雪兔子含有芹菜素、紫丁香苷、β_谷留醇、傘形花內酯、雪蓮內酯等物質。其中，芹菜素具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤和抗炎等作用；紫丁香苷具有增強免疫力、抗氧化以及抗抑郁等作用；β_谷留醇是一種良好的抗氧化劑，具有很好的清除自由基的能力。因而綿頭雪兔子具有潛在的消炎止痛，抗氧化，清除自由基等作用，而目前尚未有對西藏綿頭雪兔子提取物用于緩解腸道炎癥的相關報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是揭示出西藏綿頭雪兔子提取物在緩解腸道炎癥中的應用。
[0006]本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的:
[0007]首先分別利用病原微生物Beauveria bassiana的孢子、鹽離子NaCl、表面活性劑SDS和重金屬KAl (SO4)2喂食果蠅來建立果蠅腸道免疫功能損傷模型，即誘發果蠅腸道炎癥，將西藏綿頭雪兔子提取物進行果蠅生存率、腸道上皮細胞免疫化學染色和腸道形態學觀察等實驗，結果發現該提取物具有很好的抗炎、抗氧化、清除自由基等活性，可用于制備抗炎鎮痛藥物，尤其是治療腸道炎癥的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為西藏綿頭雪兔子提取物對B.bassiana孢子感染后果蜆生存率的影響 ；[0009]圖2為西藏綿頭雪兔子提取物對NaCl、SDS和KAl (SO4)2處理后果蠅生存率的影響；
[0010]圖3為西藏綿頭雪兔子提取物對NaCl和SDS處理后果蠅腸道上皮細胞的影響；
[0011]圖4為西藏綿頭雪兔子提取物對SDS處理后果蠅腸道形態和腸道壁厚度的影響。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實例對本發明作進一步說明:
[0013]實驗動物:野生型黑腹果蜆(Drosophila melanogaster)W1118為實驗室保存,培養溫度(25 ± I) °C、相對濕度60%~70%。
[0014]果蠅培養基的配制:對照組培養基配方為玉米粉14.2g、瓊脂1.lg、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g、丙酸0.94mL、去離子水200mL。實驗組中加入與對照組去離子水等體積的綿頭雪兔子提取液，實驗組中綿頭雪兔子提取物的濃度分別為2.5%和5%。
[0015]本實施例涉及的各實驗試劑均為市售分析純:NaCl、SDS、KAl (SO4)2、胰蛋白胨和酵母提取物等。
[0016]實施例1西藏綿頭雪兔子提取液的制備
[0017]取西藏綿頭雪兔子20g，剪碎，加入400mL去離子水浸泡24h，加熱微沸3h，過濾，再加入400mL去離子水用同樣的方法提取2次，合并3次提取的濾液并加熱濃縮至200mL，即得到質量濃度為0.1g.mL—1的綿頭雪兔子提取液，置4°C保存備用。
[0018]實施例2西藏綿頭雪兔子提取物對B.bassiana孢子感染后果蜆生存率的影響
[0019]B.bassiana孢子液的制備:將B.bassiana在LB固體培養基上培養7d(25°C )，待其產孢后，刮取孢子加入到PBS中，充分振蕩均勻，過濾，測定々_值，配制成A6c?值為40的孢子液(含5%蔗糖)。
[0020]以普通培養基中培養的果蠅作為對照組，綿頭雪兔子培養基中培養的果蠅作為實驗組。分別隨機收集對照組和實驗組羽化了 3~5d的果蠅，每組中雌雄果蠅各15只。對各組果蜆饑餓處理2h后轉移到放有5層濾紙的果蜆管中，加入B.bassiana孢子液使濾紙充分潤濕，每24h更換I次濾紙并記錄果蠅死亡數。
[0021]結果顯示:真菌B.bassiana的孢子感染6d后,對照組果蜆的生存率降到15.8%,而喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實驗組分別為26.7%和66.7%，與對照組相比分別提高了10.9%和50.9%(P〈0.01)，結果見圖1。這表明西藏綿頭雪兔子提取物可抵御真菌的感染，且隨著濃度的增加抵御能力增強。
[0022]實施例3西藏綿頭雪兔子提取物對NaCl、SDS和KAl (SO4)2處理后果蠅生存率的影響
[0023]喂食步驟同上，其中，NaCl的濃度為0.4mol.L—1，SDS的質量濃度為0.6%，KAl (SO4) 2 的濃度為 20mmol.L、
[0024]結果顯示:成體果蠅NaCl處理6d后，對照組的生存率僅為7.6%,而喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實驗組分別為63.3%(Ρ〈0.01)和53.3%(Ρ〈0.02)，提高了 7.3倍和6倍(圖2Α)。SDS處理后，喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實驗組生存率分別為45.6%(Ρ〈0.09)和75.6%(Ρ〈0.002)，是對照組(14.0%)的3.2倍和5.4倍，并且5%綿頭雪兔子效果更為顯著(圖2Β)。另外，KAl (SO4)2處理果蠅6d后，喂食5%綿頭雪兔子可顯著提高果蠅的生存率(P〈0.001)，其生存率88.9%是對照組41.1%的2.2倍，而喂食2.5%綿頭雪兔子的實驗組(38.9%)和對照組相似(圖2C)。上述結果說明，綿頭雪兔子可緩解NaCl和SDS引起的炎癥反應；綿頭雪兔子還可減弱KAl (SO4)2引起的脂質過氧化反應，提高果蠅的生存率。
[0025]實施例4西藏綿頭雪兔子提取物對NaCl和SDS處理后果蠅腸道上皮細胞的影響
[0026]分別隨機收集對照組和實驗組羽化了 3~5d的雌果蠅，連續處理NaC15d或SDS4d，顯微鏡下提取8~10條果蠅腸道于PBS中，7-AAD染色30min，多聚甲醛固定lOmin，DAPI染色lOmin，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0027]結果顯示:對照組的腸道上皮細胞均出現大量死亡，而喂食2.5%綿頭雪兔子的實驗組中腸道上皮細胞的死亡數量明顯減少，結果見圖3。
[0028]實施例5西藏綿頭雪兔子提取物對SDS處理后果蠅腸道形態和腸道壁厚度的影響
[0029]收集羽化了 3~5d的雌果蠅，SDS處理后，顯微鏡下提取8~10條果蠅腸道于PBS中，自然光下觀察腸道形態和腸道壁厚度變化。
[0030]結果顯示:SDS處理的對照組與只喂食蔗糖的果蠅腸道相比，長度明顯縮短，而且在中腸和后腸連接處出現了明顯的黑色素瘤。當喂食2.5%綿頭雪兔子時，與對照組相比腸道長度明顯增加，而且沒有發現黑色素瘤，但是比只喂食蔗糖的果蠅腸道短一部分，結果見圖4A。另外，分析了 SDS不同處理時間對果蠅腸道壁厚度的影響。隨著處理時間的增加，對照組果蠅的腸道壁厚度逐漸變薄。而喂食2.5%綿頭雪兔子的果蠅腸道壁厚度沒有明顯變化，SDS處理后的第4天和第6天，果蠅腸道壁厚度基本相似，結果見圖4B。這表明西藏綿頭雪兔子提取物可保護腸 道上皮細胞免受SDS誘導的炎癥損傷。
【權利要求】
1.西藏綿頭雪兔子提取物在緩解果蠅腸道炎癥中的應用。
2.根據權利要求1所述應用，其特征在于所述抗炎藥物為治療腸道炎癥的藥物。
3.根據權利要求1所述應用，其特征在于檢測西藏綿頭雪兔子提取物緩解腸道炎癥的方法如下: 分別利用病原微生物Beauveria bassiana的孢子、鹽離子NaCl、表面活性劑SDS和重金屬KAl (SO4)2喂食果蠅來建立果蠅腸道免疫功能損傷模型，即誘發果蠅腸道炎癥，將西藏綿頭雪兔子提取物進行果蠅生存率、腸道上皮細胞免疫化學染色、腸道形態以及腸道壁厚度的觀察等實驗，通過實驗結果的分析來驗證西藏綿頭雪兔子提取物的抗炎作用。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于構建果蠅腸道免疫功能損傷模型的B.bassiana抱子的濃度是A6QQ=40，NaCl的濃度為0.4mol.L，SDS的質里濃度為0.6%,KAl (SO4) 2 的濃度為 20mmol.L、
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于利用果蠅腸道免疫功能損傷模型檢測西藏綿頭雪兔子提取物緩解腸道炎癥的指標分別為: (1)果蠅的生存率； (2)腸道上皮細胞的死亡數量； (3)腸道整體形態變化； (4)腸道壁厚度的變化。.
【文檔編號】A61P1/00GK103463161SQ201310406703
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】金麗華, 朱彩霞, 關法春, 蘭小中 申請人:東北林業大學, 金麗華