一種天然免疫佐劑及其疫苗組合物和制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種天然免疫佐劑及其疫苗組合物和制備方法。所述天然免疫佐劑是至少包含皂甙和蜂膠兩種組分的復方佐劑，將皂甙溶于水配制皂甙溶液，將蜂膠溶于95%的乙醇配制蜂膠乙醇溶液，然后將皂甙溶液與抗原按比例混勻，再加入蜂膠乙醇溶液或用水稀釋后的蜂膠溶液，得到所述疫苗組合物。本發明首次將皂甙和蜂膠按一定比例配伍，并采用獨特工藝制備成天然復方佐劑，與單一成分天然佐劑相比極大地提高了免疫反應水平，增強了免疫效果。
【專利說明】一種天然免疫佐劑及其疫苗組合物和制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物疫苗領域,特別涉及動物疫苗佐劑。
【背景技術】
[0002]“Adjuvant”，即佐劑，最早來源于希臘語“adjuvare”，也就是幫助的意思。免疫佐劑是指與抗原同時或預先應用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫反應類型的物質。常用的免疫佐劑很多，有油乳化劑、金屬化合物、天然或人工合成的細菌產物、核酸序列、脂質體和免疫刺激復合物等，但均存在不同缺陷(如免疫效果不理想或毒副作用大等)，限制了其應用和發展。
[0003]目前國內所使用的畜禽疫苗仍以傳統油佐劑疫苗為主，存在著免疫效果差、生產工藝復雜、副作用強等一系列嚴重問題。而天然提取物佐劑以可選擇面廣，成本低廉，具水溶性，毒性作用小，綠色天然等優點日益受到重視，這類新佐劑疫苗勢必將取代傳統的油佐劑疫苗。新佐劑疫苗的安全性高，生產設備投資少，生產工藝簡單，估計每頭份成本不高于現有油佐劑滅活疫苗，如能推廣，必將產生巨大的社會、經濟效益。
[0004]對于天然提取物佐劑，目前研究較為廣泛的物質包括蜂膠、皂甙和各種脂質多糖
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[0005]皂甙(皂苷/皂草苷/皂角苷/皂素/皂苷元/肥皂草素/地奧皂甙)，是從各種天然植物中篩選到具有佐劑活性的成分。大量研究表明:皂甙為目前唯一能使外源性抗原既刺激機體Thl免疫應答，又能誘導CTL應答的佐劑。這一獨特的性質使其成為亞單位疫苗、細胞內病原體疫苗及癌癥疫苗的理想佐劑。目前應用范圍主要包括口蹄疫疫苗、狂犬疫苗等獸用疫苗。
[0006]蜂膠具有廣譜的生物學活性，是一種天然的免疫增強劑。應用蜂膠或配合抗原引入機體，既能引起特異性免疫應答，又能啟動非特異性防御機制，增加抗體產量，增強補體活性和吞噬細胞的吞噬能力。用蜂膠制成的禽霍亂菌苗具有安全可靠和無毒副作用等優點。蜂膠所含的成分極其復雜，其本身是否有抗原性值得注意。波蘭的一些學者研究表明，蜂膠本身無明顯抗原性和過敏性，毒性作用較小。
[0007]但這些佐劑成分在現有制備技術下作為抗單獨使用存在著誘導免疫反應產生水平低，免疫保護效果差等一系列問題。

【發明內容】

[0008]針對目前天然佐劑的不足，本發明的目的在于提供一種天然提取物的復方佐劑，以及利用該天然復方佐劑制備的疫苗組合物，以提高疫苗的免疫反應水平和免疫保護效
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[0009]為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案:
[0010]一種天然免疫佐劑，包含皂甙和蜂膠。
[0011]本發明的天然免疫佐劑是至少包含皂甙和蜂膠兩種組分的復方佐劑，先分別配制皂甙溶液和蜂膠溶液，然后在配制疫苗時將它們與抗原按一定比例混勻，疫苗中皂甙和蜂膠的質量比為1: 0.8~1: 2。
[0012]上述皂甙溶液是將皂甙溶于水并除菌制得；而蜂膠溶液是先將蜂膠溶于95%的乙醇配制蜂膠乙醇溶液，該蜂膠乙醇溶液可直接應用于疫苗配制，也可以進一步用水稀釋后再應用于疫苗配制。
[0013]通常，上述蜂膠乙醇溶液中蜂膠的濃度在100_350mg/ml。
[0014]基于上述天然免疫佐劑，本發明提供一種疫苗組合物，包括免疫佐劑和抗原，其中免疫佐劑至少包含皂甙和蜂膠兩種天然物質。
[0015]上述疫苗組合物中，阜式的含量為4mg/ml~30mg/ml ;蜂膠的含量為5mg/ml~30mg/ml。 [0016]本發明的疫苗組合物通過下述方法制備得到:
[0017]I)將皂甙用滅菌水配制成一定濃度的皂甙溶液并除菌；
[0018]2)將蜂膠溶于95%的乙醇配制蜂膠乙醇溶液，然后直接或用滅菌水稀釋后用于步驟3)；
[0019]3)將步驟I)制得的皂甙溶液與抗原按一定比例混合均勻，然后加入步驟2)制得的蜂
[0020]膠溶液，獲得所述疫苗組合物。
[0021]上述步驟2)配制的蜂膠乙醇溶液濃度為100_350mg/ml。
[0022]在配制疫苗時先將皂甙與抗原按一定濃度比例混勻，然后在按一定濃度范圍加入處理好的蜂膠乙醇溶液(或稀釋后的蜂膠溶液)，混勻后即可，配苗過程不需要乳化，省時省力節約成本。由于本發明佐劑是由兩種天然物質按特定濃度配制而成，而兩種成分可以配成高濃度的濃縮液，在此情況下，以抗原液為溶質配苗可以大幅提高抗原在疫苗中所占的比例，起到濃縮疫苗的效果，提高了疫苗的免疫反應水平。
[0023]本發明首次將皂甙(皂苷/皂草苷/皂角苷/皂素/皂苷元/肥皂草素/地奧皂甙)和蜂膠按一定比例配伍，并且采用獨特加工工藝將其制備成新型的天然復方佐劑，與單一成分天然佐劑相比極大地提高了免疫反應水平，增強了天然佐劑的免疫效果，而且制備過程綠色環保，不破壞佐劑成分的純天然結構，在國內外尚屬首創。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是實施例1不同佐劑新城疫疫苗免疫雞后的HI抗體滴度實驗結果，其中a、b、c和d分別對應免疫后I周、2周、3周和4周的實驗結果。
[0025]圖2是實施例2復方天然佐劑新城疫抗原濃縮疫苗免疫雞后的HI抗體滴度實驗結果，其中a、b、c和d分別對應免疫后I周、2周、3周和4周的實驗結果。
[0026]圖3是實施例3不同濃度的佐劑新城疫疫苗免疫雞后的HI抗體滴度實驗結果，其中a、b、c和d分別對應免疫后I周、2周、3周和4周的實驗結果。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例僅是說明性的，應該明白，本發明并不受這些實施例的限制。
[0028]實施例1[0029]將提純蜂膠塊(黃酮含量> 98%)20g磨成細粉后，加入95%的乙醇60ml中(此例僅為配比比例)制得濃度為280mg/ml的蜂膠乙醇溶液，使蜂膠顆粒大小均一穩定，取上述溶液IOml緩慢加入低溫滅菌水中(溫度低于8°C )，并不停攪拌，定容至200ml，其終濃度為14mg/ml作為復合佐劑的蜂膠成分備用。另稱取280mg的皂甙,用滅菌水定容為20ml，其終濃度為14mg/ml,除菌過濾后作為佐劑的阜式成分備用。
[0030]為了證明本發明的新型復方天然佐劑免疫效果好于以往天然佐劑，我們以新城疫(ND)滅活疫苗為例，進行免疫學比較，對比佐劑的免疫效果。
[0031]新型復方天然佐劑疫苗配制步驟為:先將上述皂甙成分與滅活新城疫抗原以體積比1: 2進行混合均勻后，再加入I體積的上述蜂膠成分溶液即可完成疫苗配制(A組)，疫苗中的蜂膠和皂甙成分濃度均為7mg/ml，抗原含量占到疫苗體積的50%。同時以單獨蜂膠成分佐劑疫苗(B組，蜂膠成分濃度為7mg/ml，抗原含量占到疫苗體積的50%)和單獨皂甙成分佐劑疫苗(C組，皂甙成分濃度為7mg/ml，抗原含量占到疫苗體積的50%)為對照。在第O天免疫30日齡SPF雞(5只/組)，免疫方式為肌肉注射，免疫劑量為0.4ml/只。免疫后第7天、14天、21天、28天采血清測HI抗體滴度，實驗結果見圖1。結果表明新城疫復方天然佐劑滅活疫苗(A組)免疫后可產生較高水平的HI抗體，并且抗體持續時間長，免疫效果顯著高于目前的天然佐劑(B組和C組)。
[0032]實施例2
[0033]本發明的復方佐劑是由兩種天然物質按特定濃度配制而成，而兩種成分可以配成高濃度的濃縮液，在此情況下，以抗原液為溶質配苗可以大幅提高抗原在疫苗中所占的比例，起到濃縮疫苗的效果， 提高了疫苗的免疫反應水平。為了驗證佐劑此項優勢進行如下實驗:
[0034]將提純蜂膠塊(黃酮含量> 98%)20g磨成細粉后，加入95%的乙醇60ml中(此例僅為配比比例)制得濃度為280mg/ml的蜂膠乙醇溶液，使蜂膠顆粒大小均一穩定，作為復合佐劑的蜂膠成分備用。另稱取2800mg的皂甙，用滅菌水定容為10ml，其終濃度為280mg/ml，除菌過濾后作為佐劑的皂甙成分備用。
[0035]在此以新城疫(ND)滅活疫苗為例，進行免疫學比較，對比佐劑的抗原濃縮效果。疫苗配制步驟為:先將上述皂甙成分與滅活新城疫抗原以體積比1: 40進行混合均勻后，再加入I體積的上述蜂膠成分溶液即可完成疫苗配制(A’組)，疫苗中的蜂膠和皂甙成分濃度均為7mg/ml，抗原含量占到疫苗體積的95%。此外設立對照組，對照組疫苗為實施例1中復方佐劑組(A組)，即疫苗中的蜂膠和皂甙成分濃度均為7mg/ml，抗原含量占到疫苗體積的50%。在第O天免疫30日齡SPF雞(5只/組)，免疫方式為肌肉注射，免疫劑量為0.4ml/只。免疫后第7天、14天、21天、28天采血清測HI抗體滴度，實驗結果見圖2。結果表明新城疫復方天然佐劑抗原濃縮效果明顯，A’組免疫后可產生更高的HI抗體水平，且持續時間更長。
[0036]實施例3
[0037]本發明的復方佐劑是由兩種天然物質按特定濃度配制而成，為了說明佐劑的免疫增強效果與佐劑中蜂膠和皂甙濃度之間的關系，進行如下實驗:
[0038]將提純蜂膠塊(黃酮含量> 98%)20g磨成細粉后，加入95%的乙醇60ml中(此例僅為配比比例)制得濃度為280mg/ml的蜂膠乙醇溶液，使蜂膠顆粒大小均一穩定，取上述溶液IOml緩慢加入低溫滅菌水中(溫度低于8°C )，并不停攪拌，定容至100ml，其終濃度為28mg/ml作為復合佐劑的蜂膠成分備用。另稱取280mg的皂甙,用滅菌水定容為10ml，其終濃度為28mg/ml，除菌過濾后作為佐劑的皂甙成分備用。將上述皂甙成分與滅活新城疫抗原以體積比1: 2進行混合均勻后，再加入I體積的上述蜂膠成分溶液即可完成疫苗配制(A組)，A組中抗原含量占到疫苗體積的50%，疫苗中的蜂膠和皂甙成分濃度均為14mg/ml，
[0039]取280mg/ml的蜂膠乙醇溶液IOml緩慢加入低溫滅菌水中(溫度低于8°C )，并不停攪拌，定容至200ml,其終濃度為14mg/ml作為復合佐劑的蜂膠成分備用。另稱取280mg的皂甙，用滅菌水定容為20ml，其終濃度為14mg/ml，除菌過濾后作為佐劑的皂甙成分備用。將上述皂甙成分與滅活新城疫抗原以體積比1: 2進行混合均勻后，再加入I體積的上述蜂膠成分溶液即可完成疫苗配制(B組)，B組中抗原含量占到疫苗體積的50%，疫苗中的蜂膠和皂甙成分濃度均為7mg/ml。
[0040]第O天免疫30日齡SPF雞(5只/組)，免疫方式為肌肉注射，免疫劑量為0.4ml/只。免疫后第7天、14天、21天、28天采血清測HI抗體滴度，實驗結果見圖3。結果表明新城疫復方天然佐劑抗原濃縮效果明顯，A組免疫后可產生更高的HI抗體水平，且持續時間更長。證明在一定濃度范 圍內增加佐劑中蜂膠和皂甙成分的濃度可以提高佐劑的免疫增強效果。
【權利要求】
1.一種天然免疫佐劑，包含皂甙和蜂膠。
2.如權利要求1所述的天然免疫佐劑，其特征在于，所述天然免疫佐劑由皂甙和蜂膠兩種組分組成，皂甙和蜂膠的質量比為1: 0.8~1: 2。
3.一種疫苗組合物，包括免疫佐劑和抗原，其中免疫佐劑包含皂甙和蜂膠。
4.如權利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物的免疫佐劑由皂甙和蜂膠兩種組分組成，先分別配制皂甙溶液和蜂膠溶液，然后將它們與抗原按一定比例混合均勻，得到所述疫苗組合物。
5.如權利要求 3或4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物中皂甙和蜂膠的質量比為1: 0.8~1: 2。
6.如權利要求3或4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物中皂甙的含量為4mg/ml ~30mg/ml,蜂膠的含量為 5mg/ml ~30mg/ml。
7.一種制備權利要求3所述疫苗組合物的方法，包括以下步驟: 1)將皂甙用滅菌水配制成一定濃度的皂甙溶液并除菌； 2)將蜂膠溶于95%的乙醇配制蜂膠乙醇溶液，然后直接或用滅菌水稀釋后用于步驟3)； 3)將步驟I)制得的皂甙溶液與抗原按一定比例混合均勻，然后加入步驟2)制得的蜂膠溶液，獲得所述疫苗組合物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)配制的蜂膠乙醇溶液濃度為100_350mg/ml。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所用皂甙和蜂膠的質量比為1:0.8~I: 2。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述疫苗組合物中皂甙的含量為4mg/ml~30mg/ml,蜂膠的含量為 5mg/ml ~30mg/ml。
【文檔編號】A61K36/00GK103520219SQ201310481946
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月15日 優先權日:2013年10月15日
【發明者】胡艷欣 申請人:胡艷欣