一種抗人a組輪狀病毒的雞卵黃抗體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種抗人A組輪狀病毒雞卵黃抗體及其制備方法和應用，該方法包括：體外表達純化人A組輪狀病毒結構蛋白VP7或VP8，并免疫產蛋雞，收集雞蛋，分離純化出VP7或VP8卵黃抗體。制備得到的雞卵黃抗體可凍干制備成用作預防和治療輪狀病毒感染的抗體干粉。本發明的有益效果：采用基因工程技術體外大量表達重組VP7和VP8抗原，效益高，成本低，場地需求小、環保；避免了傳統卵黃抗體制備過程中使用輪狀病毒滅活或減毒疫苗所帶來的潛在散毒風險，符合動物福利要求；采用本發明制備的卵黃抗體，經無菌檢驗后，制備成抗體干粉口服生物制劑，對治療輪狀病毒感染性腹瀉具顯著效果，預防率可達95%以上，見效快、成本低。
【專利說明】一種抗人A組輪狀病毒的雞卵黃抗體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及卵黃抗體，尤其是一種高效價抗A組輪狀病毒的雞卵黃抗體及其制備方法和在預防和治療輪狀病毒感染中的應用。
【背景技術】
[0002]人A組輪狀病毒(Rotavirus, RV)是引起嬰幼兒感染性腹瀉疾病的主要原因，其發病率高、危害嚴重，嚴重影響了嬰幼兒的發育、營養要求和生存質量[Parashar UD等，2003 ;陽艷麗等，2011]。無論在發達國家還是發展中國家，輪狀病毒所致的胃腸炎都是一個嚴重的公共衛生問題，該病毒所致的腹瀉普遍流行，好發于秋冬季節，幾乎所有5歲以下的兒童均發生過RV感染。據估計，每年因輪狀病毒感染導致的門診病例有2500多萬人，住院病例200多萬人[Tate JE等，2012]，就2004年輪狀病毒致死人數據估計達到52.7萬(47.5萬-58.0萬)，并且主要發生在低收入國家。
[0003]目前，仍然缺少抗輪狀病毒的特效藥物。臨床上一方面糾正水電解質平衡，另一方面以微生態制劑為主要組分的媽咪愛和以蒙脫石為主要組分的思密達進行治療，但均不能對輪狀病毒引起的嬰幼兒腹瀉進行有效預防和治療，甚至濫用抗生素加劇腸道菌群的紊舌L進一步引起藥物較難控制的腸炎。目前使用的主要是輪狀病毒活疫苗，由于該疫苗有增加腸套疊風險和免疫保護局限等問題，致使該疫苗對輪狀病毒引起腹瀉的預防在發展中國家推廣受阻【Patel NC等，2010 ;Patel MM等，2011 ;Vesikari T等，2012】。因此研發一種高效安全，易于服用的抗體疫苗，是本病防治急需解決的問題。
[0004]卵黃抗體(immunoglobulin yolk, IgY),即產蛋雞經特定抗原免疫后,產生相應特異性抗體，并轉運、儲存于卵黃中，形成卵黃抗體。卵黃抗體相當于人的IgG，抗體親和力比較高。特異性IgY通過與病原的結合，抑制病原菌的生長、運動和粘附作用。卵黃技術近年獲得快速發展，在醫療領域具有良好的應用前景[Dias da Silva W等，2010]。IgY已經顯示出較好的抗細菌、真菌和病毒效果。口服IgY已被證明能有效替代抗生素治療因耶爾森菌、腸毒性大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、幽螺桿菌、輪狀病毒等感染引起的胃腸道疾病。在我國，IgY在獸藥領域獲得生產批文的已達到10個，同時已有很多添加IgY的功能性保健食品和衛生消毒產品等上市銷售，IgY技術在醫療診斷及治療通過臨床驗證已顯示出良好效果。
[0005]對于輪狀病毒的卵黃抗體及相關產品，中國專利申請CN1201693A和CN1435260A均公開了采用野生型輪狀病毒株，對其進行病毒細胞培養、病毒純化和滅活，而制備成滅活病毒苗，通過免疫產蛋雞獲得相應的卵黃抗體。然而，滅活疫苗具有生產要求高、存在滅活不徹底和散毒的危險，同時，由于病毒殘存等因素，這些都會對后期卵黃抗體的純化帶來困難。

【發明內容】

[0006]針對以上不足和缺陷，本發明的目的是提供一種抗A組輪狀病毒雞卵黃抗體制備方法。
[0007]本發明根據現代分子免疫學理論，分析并選擇輪狀病毒的主要抗原表位決定簇肽段VP7和VP8作為免疫原，采用基因工程技術實現在體外大量表達輪狀病毒VP7和VP8抗原，將純化的抗原與適宜的佐劑制備成疫苗免疫產蛋雞，采用常規水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法提取高效價的輪狀病毒VP7和VP8的卵黃抗體。
[0008]本發明的另一目的是提供抗人A組輪狀病毒的雞卵黃抗體在預防和治療輪狀病毒感染中的應用。[0009]本發明采用的技術方案為:
一種抗人A組輪狀病毒雞卵黃抗體的制備方法，包括:體外表達純化人A組輪狀病毒結構蛋白VP7或VP8，并免疫產蛋雞，收集雞蛋，分離純化出VP7或VP8卵黃抗體。
[0010]優選一種抗人A組輪狀病毒雞卵黃抗體的制備方法，包括:PCR擴增人A組輪狀病毒的結構蛋白VP7或VP8 DNA序列，將得到的VP7或VP8 DNA序列克隆到原核表達載體pET28a(+)上并轉化大腸桿菌表達菌株BL21，誘導表達和純化VP7或VP8重組蛋白，將VP7或VP8重組蛋白按照體積比1:1與弗氏佐劑混合乳化，肌肉或皮下注射免疫產蛋雞，每隔一個月加強免疫一次，共2次，第3次免疫后一周開始收集雞蛋，從蛋黃中分離純化出抗輪狀病毒結構蛋白VP7或VP8的特異性卵黃抗體。
[0011]更優選的一種抗A組輪狀病毒雞卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟:
(1)PCR擴增:設計引物，以包含G4P8血清型全長VP7或VP8的質粒DNA為模板，PCR擴增VP7或VP8 DNA序列；包含G4P8血清型全長VP7或VP8模板DNA序列可以從G4P8血清型人A組輪狀病毒T114株(中國科學院微生物研究所購得)中提取；
(2)蛋白表達純化:將PCR擴增得到的VP7或VP8DNA序列克隆到原核表達載體pET28a(+)上，并轉化到大腸桿菌表達菌株BL21中，通過0.1-0.7 mM IPTG誘導VP7或VP8重組抗原蛋白的大量表達，誘導表達溫度為25-37°C，時間8-12h，離心收集誘導表達后的菌體，按照體積比0.01M PBS:菌體=10:1，用0.01M PBS懸浮菌體，采用3_6次反復凍融和溶菌酶(終濃度l-10mg/ml)裂解菌體，離心收集沉淀，用含有質量百分比0.8-1.2 %的Triton和1.5-2.5 M尿素的0.01M PBS洗滌去除細胞碎片，獲得粗制的包涵體，再用0.01MPBS洗滌包涵體2-4次，最后按照含有6-8 M尿素的0.01 M PBS緩沖液:包涵體=50:1的體積比溶解包涵體，采用梯度透析的方法復性包涵體得到VP7或VP8重組抗原蛋白；
(3)免疫:將2-10mg/mlVP7或VP8重組抗原蛋白按照體積比1:1與完全弗氏佐劑乳化，2-3點肌肉或皮下注射免疫產蛋雞，初免劑量為250-500 μ g/只，每隔一個月加強免疫一次(加強免疫采用不完全弗氏佐劑)，共2次，免疫劑量為100-200 μ g/只，第3次免疫一周以后開始收集雞蛋，加強免疫后，當抗體滴度低于1:1O4時，再給予強化免疫，免疫劑量為100-200 μ g/ 只即可；
(4)分離純化卵黃抗體:用水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法從蛋黃中分離純化輪狀病毒特異性的VP7卵黃抗體或VP8卵黃抗體。
[0012]其中，0.01MPBS由以下組分組成:氯化鈉(NaCl)，8g ;磷酸氫二鈉(Na2HP04)，1.16g ;磷酸二氫鉀(KH2P04)，0.24g,加 800ml ddH20,并用 IM 的 HCI 或 NaOH 調 pH 至 7.4，
定容1L，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。
[0013]其中，VP7結構蛋白的氨基酸序列如下:SEQ ID N0.1:
【權利要求】
1.一種抗人A組輪狀病毒的雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于，體外表達純化人A組輪狀病毒結構蛋白VP7或VP8，并免疫產蛋雞，收集雞蛋，分離純化出VP7或VP8卵黃抗體。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，PCR擴增人A組輪狀病毒的結構蛋白VP7或VP8 DNA序列，將其克隆到原核表達載體pET28a(+)上并轉化大腸桿菌表達菌株BL21，誘導表達和純化VP7或VP8重組蛋白，將VP7或VP8重組蛋白溶液按照體積比1:1與弗氏佐劑混合乳化，肌肉或皮下注射免疫產蛋雞，每隔一個月加強免疫一次，共2次，第3次免疫后一周開始收集雞蛋，從蛋黃中分離純化出抗輪狀病毒結構蛋白VP7或VP8的特異性卵黃抗體。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)PCR擴增:設計引物，以包含G4P8血清型全長VP7或VP8的質粒DNA為模板，PCR擴增VP7或VP8 DNA序列； (2)蛋白表達純化:將PCR擴增得到的VP7或VP8DNA序列克隆到原核表達載體pET28a(+)上，并轉化到大腸桿菌表達菌株BL21中，通過0.1-0.7mM IPTG誘導VP7或VP8重組抗原蛋白的大量表達，誘導表達溫度為25-37°C，時間8-12 h，離心收集誘導表達后的菌體，按照體積比0.01M PBS:菌體=10:1，用0.01M PBS懸浮菌體，采用3_6次反復凍融和溶菌酶裂解的方法裂解菌體，溶菌酶的終濃度為l-10mg/ml ;離心收集沉淀，用含質量百分比0.8-1.2%的Triton和1.5-2.5M尿素的0.01M PBS洗滌去除細胞碎片，獲得粗制的包涵體，再用0.01 MPBS洗滌包涵體2-4次，最后按照體積比含有6-8 M尿素的0.01 M PBS緩沖液:包涵體=50:1加入0.01 M PBS緩沖液溶解包涵體，將溶解的包涵體加入到透析袋內，采用梯度透析的方法復性包涵體得到VP7或VP8重組抗原蛋白； (3)免疫:取2-10mg/ml VP7或VP8重組抗原蛋白按照與完全弗氏佐劑1:1體積比混勻乳化，2-3點肌肉或皮下注射免疫產蛋雞，初免劑量為250-500 μ g/只，每隔一個月加強免疫一次，共2次，免疫劑量為100 -200 μ g/只，加強免疫采用不完全弗氏佐劑，第3次免疫一周以后開始收集雞蛋，抗體滴度低于1:1O4時，再給予強化免疫，免疫劑量為100-200 μ g/只即可； (4)分離純化卵黃抗體:用水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法從蛋黃中分離純化輪狀病毒特異性VP7或VP8卵黃抗體。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)的VP7上游引物為 5’ -CCGGAATTCTTGCCAATTACTGGATCTAT-3’，VP7 下游引物為 5’-CCGCTCGAGCATTCGTTCTGTTTGTGGA-3’，所述步驟(1)的 VP8 上游引物為 5’-CCGGMTTCATGGCTTCACTCATTTAT-3 ’ 和下游引物為 5 ’ - CCGCTCGAGAACTTGTGCCCTCTTATA-3，，所述PCR的退火溫度為53-57°C ;所述步驟(2)的梯度透析的方法復性包涵體包括:按照體積比為透析緩沖液:袋內透析液=10:1，將透析袋置于包含5-6 M尿素的透析緩沖液中，進行梯度透析復性，透析4-5 h ;棄1/4-1/6體積原透析緩沖液，補充新的所棄體積的透析緩沖液，透析4-5 h，共透析6-9次；最后用0.01M PBS透析3_4 h，重復1_3次；收集透析液，4°C下12000rpm離心15分鐘,上清即為復性的VP7或VP8重組抗原,所述透析緩沖液組分為:50 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl，5%體積比甘油，1%重量比Gly，其余為超純水，pH8.1，最后利用Bradford法對純化的VP7或VP8蛋白進行定量分析，調整蛋白濃度至3mg/ml ο
5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)得到的VP7或VP8重組抗原蛋白經SDS-PAGE電泳確認有一條分子量大小為33KD或35KD的電泳帶，其中VP7復性蛋白分子量大小為33KD或VP8復性蛋白分子量大小為35KD，灰度掃描純度在90%以上則滿足進入下一步驟要求。
6.如權利要求3-5中任一權利要求所述的制備方法，其特征在于，用ELISA法檢測步驟(3)中收集的雞蛋的蛋黃中的抗體滴度，滴度達到1:20000以上即滿足進入下一步驟的要求，利用水稀釋-硫酸銨沉淀-超濾法從蛋黃中分離純化輪狀病毒特異性的卵黃抗體包括:按照蒸餾水:卵黃=8:1稀釋卵黃，用稀HCl調節pH至5.2，4°C靜置6-8 h，離心去脂，收集上清液，再用質量百分比40%和25% (NH4)2SO4分步沉淀卵黃抗體，終濃度分別為10%和30%質量百分比，收集沉淀用0.01M PBS溶解后超濾即得卵黃抗體VP7或VP8卵黃抗體，超濾的截留分子量為100kD。
7.—種卵黃抗體,其特征在于,所述卵黃抗體通過權利要求1-6中任一權利要求的方法制備得到卵黃抗體。
8.如權利要求7所述的一種卵黃抗體，其特征在于，所述卵黃抗體的純度為90%以上，抗體滴度為2 X IO4。
9.如權利要求7-8中任一權利要求所述的卵黃抗體的應用，其特征在于，所述卵黃抗體凍干制備成用作預防和治療輪狀病毒感染的抗體干粉。
10.如權利要求9所述的卵黃抗體的應用，其特征在于，所述抗體干粉為口服生物制劑原料。`
【文檔編號】A61P31/14GK103554254SQ201310542421
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】李再新, 張智, 胡衛東, 李丙超, 李天有, 鄒曉陽, 唐文才 申請人:四川理工學院