一種顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及骨關節治療藥物【技術領域】，是一種蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，該蓮威阿娜奇顆粒按下述制備方法得到：將雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾和雞血藤進行醇提、濃縮后得到稠膏、對生白術進行提取揮發油、對阿納齊根、桑椹、鹿銜草、透骨草和醇提藥渣以及生白術提取揮發油后的藥渣進行水提、濃縮、醇沉后得到粗多糖，對揮發油進行包合得到包合物，將稠膏和粗多糖混合加入輔料后制粒、整粒后，加入包合物得到蓮威阿娜奇顆粒，本發明的蓮威阿娜奇顆粒具有低毒性，針對骨關節軟骨細胞破壞及炎癥有較好的效果，并且具有一定的鎮痛效果，能夠用于治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥疾病。
【專利說明】一種顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及骨關節治療藥物【技術領域】，是一種蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用。
【背景技術】
[0002]中醫對于關節炎病因病機的闡述最早見于《內經》，《素問痹論》指出“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹，其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也”，“所謂痹者，各以其時重感于風寒濕者也”。除此之外，《素問痹論》還認為“所謂飲食居處，為其病本”，痹病的產生又與飲食和生活環境有關。而在《素問評熱病論》中曰:“風雨寒熱，不得虛，不能獨傷人”，“不與風寒濕氣合，故不為痹”。可見古人對于關節炎的發病，既看到了其外部因素，同時也意識到了它的內因，概括的說，風、寒、濕、熱邪是關節炎發生發展的外部條件，而諸虛內存，正氣不足才是其發病的內在原因。中醫對于關節炎治療的理論認為“風寒濕邪，痹阻經脈，致使經脈不通，不通則痛”，所以中藥治療即當以祛風散寒、解痙通絡、活血化淤為目的，同時亦須溫腎助陽、扶正固本，以達強筋壯骨、根除關節炎癥之功效。蓮威阿那奇方劑，臨床應用十多年來，療效顯著，但也有諸多不便，湯劑口感差、煎煮、服用不太方便，而且劑量還特別大。為了順應患者用藥需要，對本處方藥材中活性成分的藥理及其理化性質進行調研，制定了較為科學的制備工藝，將蓮威阿那奇湯劑研制成為安全有保證，質量更穩定的復方無糖混懸型顆粒制劑，既能發揮了顆粒劑服用方便、比其它固體制劑，崩解快，釋藥快的特點，又能減少對胃腸道的刺激，還提高了藥物穩定性、患者服用藥物的依從性和適用性。
[0003]蓮威阿娜奇顆粒(簡稱LW)由雪蓮、肉蓯蓉、桑椹、阿納其根、骨碎補、鹿銜草、仙靈脾、土鱉蟲、威靈仙、透骨草、雞血藤、生白術等12味中藥民族藥組成。方中雪蓮微苦，性溫，溫腎助陽，祛風勝濕，通經活血，止風寒濕痹；肉蓯蓉具有補腎陽，益精血之功效；桑椹具有補肝益腎、滋陰補血、生津潤 燥作用，三者合為君藥。阿納其根干熱，味辛辣而麻舌，祛寒強筋，熱身壯陽，祛風止痛；骨碎補具有療傷止痛、補腎強骨功效；鹿銜草具有祛風濕、強筋骨、止血等功效；仙靈脾具有補腎陽，強筋骨，祛風濕功效；土鱉蟲具有破血逐瘀，續筋接骨功效；上述五味藥輔助君藥，以加強療效，合為臣藥。威靈仙具有祛風濕，通經絡功效；透骨草具有祛風濕通絡功效；雞血藤具有活血補血、舒筋通絡、調經止痛之功效，三者合為佐藥。白術健脾益氣，燥濕利水。諸藥合用，共奏補腎通絡、活血化瘀、祛風止痛之效。
[0004]單味藥現代藥理研究:雪蓮是菊科鳳毛菊屬雪蓮亞屬的草本植物。主要分布在新疆、西藏、四川、青海等省(區)，其中最著名的是生于新疆天山、阿爾泰山、昆侖山雪線附近的巖縫、石壁、冰磧碌石灘中的天山雪蓮。本品系維吾爾族習用藥材，為天山雪蓮Saus sur eainvolucrata(Kar.et Kir.) Sch.-Bip.的干燥地上部分。具有散寒除濕、活血通經、強筋助陽、抗炎、鎮痛、收縮子宮等功能，民間用于治療風濕性關節炎、婦女小腹冷痛、閉經、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、陽萎等癥。天山雪蓮含有蘆丁、槲皮素、高車前素、柯伊利素、木犀草素等黃酮類，紫丁香苷及綠原酸等苯丙素類，大苞雪蓮堿等生物堿類、大苞雪蓮內酯等內酯類、多糖類等化學成分。其中，黃酮類、生物堿和內酯類等為脂溶性有效成分；多糖和苷類等為水溶性有效成分。故其提取工藝應為醇、水雙提，以達到充分利用資源，發揮藥品最佳藥效的。目的現代藥理研究表明天山雪蓮中黃酮類和苯丙素類成分具有明顯的抗炎鎮痛和抗風濕作用。翟科峰等人將天山雪蓮70%乙醇粗提物上大孔吸附樹脂柱，用乙醇進行梯度洗脫，得到的30%乙醇洗脫液(綠原酸部位)，50%乙醇洗脫液(紫丁香苷和蘆丁部位)具有明確抗炎，鎮痛的藥效活性。劉發等人研究表明:雪蓮水液能使大鼠AA模型急性炎癥和繼發性炎癥明顯減輕，減輕角叉萊膠致大鼠足跖腫，抑制大鼠棉肉芽腫的形成，減少乙酸致小鼠的扭體次數，抑制小鼠腹腔毛細血管的滲出，還能使小鼠耳廓細動脈、細靜脈擴張，毛細血管開放量增加。肉灰蓉為列當科植物肉灰蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉灰蓉Cistanche tubulosa (Schrenk) R.Wight的干燥帶鱗葉的肉質莖。肉灰蓉的主要基源植物為管花肉蓯蓉，其次為荒漠肉蓯蓉和鹽生肉蓯蓉。甘、咸、溫。歸腎、大腸經。具有補腎陽，益精血，潤腸通便作用。常用于腎陽不足，精血虧虛，陽痿不孕，腰膝酸軟，筋骨無力，腸爆便秘。肉蓯蓉活性成分有苯乙醇苷類、多種活性多糖、環烯醚萜類、木脂素類及生物堿等。松果菊苷和麥角留苷(又名毛蕊花糖苷)是肉蓯蓉中苯乙醇總苷的主要成分。現代藥理研究表明肉蓯蓉除了補腎壯陽作用外還具有鎮痛、消炎、免疫、神經保護、通便、抗衰老和抗氧化等作用。桑椹為桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗。甘、酸、寒。歸心、肝、腎經。具有滋陰補血，生津潤燥作用。常用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，心悸失眠，津傷口渴，內熱消渴，腸燥便秘。桑椹的主要活性物質包括花色苷、白藜蘆醇、蘆丁、多糖等，此外，桑椹中還含有人體所必須的18種氨基酸和豐富的維生素。桑椹具有調節免疫、保護神經細胞、抗氧化、保護心腦血管系統、抗癌等多種藥理活性作用。阿納其根為菊科植物羅馬除蟲菊Anacycluspyrethrum (L.)DC.的干燥根。維藥名為阿卡勒卡勒哈。分布于北非或南部歐洲，我國新疆亦有分布。三級干熱，味辛辣而麻舌。具有祛寒強筋，開通阻滯清除腦中余物，熱身壯陽，通利經水，固精，祛風止痛，燥濕化痰，滋補神經等功能。民間用于治療濕寒性或黏液質性疾病，如癱瘓，面癱，肌肉松弛，麻痹，顫動，癔病，舌重，性欲減退，精液不固，經閉不暢，頭痛牙痛，多痰咳嗽，神經衰弱等癥。有研究表明除蟲菊根含有墻草堿(pellitorine)、菊糖。預試還含揮發油、黃酮、鞋質及氨基酸。骨碎補為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖。味苦、溫，歸肝、腎經。具有療傷止痛、補腎強骨功效。主治腎虛腰痛，耳鳴耳聾，牙齒松動，跌撲閃挫，筋骨折傷等癥狀。骨碎補中含有二氫黃酮、黃烷-3-醇及其衍生物、三萜類等多種化學成分，另外，骨碎補中還含有甲基丁香酚、β_2谷留醇、原兒茶酸、新北美圣草苷、骨碎雙氫黃酮苷、環木菠蘿留醇醋酸脂、環水龍骨留醇醋酸脂、環鴉片甾醇醋酸脂、9，10-環羊毛留-25-烯醇-3 β -醋酸脂、豆留醇、菜油留醇等多種化學物質，主要活性物質為柚皮苷，有研究表明柚皮苷可能是骨碎補促進骨折愈合的主要有效成分之一。現代藥理研究表明骨碎補具有補肝腎、強筋骨、防治藥物中毒性耳聾、降血脂以及強心和鎮靜作用。鹿銜草為鹿蹄草科植物鹿蹄草Pyrola calIiantha H.Andres或普通鹿蹄草Pyrola decorate H.Andres的干燥全草。甘、苦、溫。歸肝、腎經。除了兼有祛風濕、強筋骨，還有止血等功效。臨床治療腎虛腰痛、風濕痹痛和腰膝酸軟無力等病狀。活性成分為黃酮類、醌類、酚類和環烯醚萜苷類。環烯醚萜苷類化合物的代表成分水晶蘭苷，是抗炎鎮痛藥理作用的主要活性成分。臨床藥理學還發現，鹿銜草具有抗菌作用，抗炎鎮痛等活性。仙靈脾又名淫羊藿，為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿 Epimedium pubescensMaxim.、或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉。辛、甘,溫。歸肝、腎經。具有補腎陽，強筋骨，祛風濕功效。用于腎陽虛衰，陽痿遺精，筋骨痿軟，風濕痹痛，麻木拘攣等癥狀。主要含有黃酮類、多糖、生物堿、木脂素、綠原酸、萜類化合物及微量元素等多種活性物質。具有壯陽、抑制骨質疏松、抗氧化、抗抑郁、防治肥胖癥、調節免疫、抗腫瘤、防治心血管疾病、調節激素分泌、抗肝毒素等多種生物活性。淫羊藿苷為其總黃酮類中的主要成分。土鳘蟲又名地鳘，為鳘爐科昆蟲地鳘Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鳘Steleophagaphancyi (Boleny)的雌蟲干燥體。咸,寒；有小毒。歸肝經。具有破血逐瘀，續筋接骨功效。用于治療跌打損傷，筋傷骨折，血瘀經閉等癥狀。主要活性成分包括多種活性蛋白質(酶)、氨基酸、不飽和脂肪酸、微量元素、生物堿和脂溶性維生素等。其所含有的絲氨酸蛋白酶，對人體血纖溶酶原的激活作用與尿激酶相似。現代研究表明土鱉蟲具有溶解血栓、抗凝血、抗腫瘤、促進骨折愈合、調節血脂、抗突變、耐缺氧等藥理作用。威靈仙為毛茛科植物威靈仙 Clematis chinensis Osbeck、棉團鐵線蓮 Clematis hexapetala Pall.或東北鐵線蓮Clematis manshurica Rupr.的干燥根和根莖。辛、咸、溫。歸膀胱經。具有祛風濕，通經絡功效。用于風濕痹痛，肢體麻木，筋脈拘攣，屈伸不利癥狀。主要含有揮發性成分，三萜皂苷、生物堿、黃酮、香豆素、木脂素等成分。其中威靈仙總皂苷具有顯著的抗炎鎮痛作用，所含皂苷均為五環三萜類齊墩果烷型，其皂苷元為齊墩果酸和常春藤皂苷元，所結合糖主要為鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和核糖。現代藥理研究表明:威靈仙具有解熱鎮痛、抗炎、抑制腫瘤擴散等作用，此外還有抗菌滅菌、免疫抑制等作用。另有周效思等人研究發現威靈仙水提取液具有改善局部微循環的作用，為臨床上治療風濕痹痛提供了藥理學依據。透骨草基源十分混亂，同名異物現象非常嚴重，據統計，各地藥材為透骨草的原植物有19科44種之多，使用地區較為廣泛的有16科22種。迄今未載入《中國藥典》、《部頒標準》。在諸多的品種中， 珍珠透骨草、鳳仙透骨草、羊角透骨草、東北透骨草、小透骨草和透骨草等使用最為廣泛。祛風濕通絡是各種透骨草之共性，臨床多與其他祛風濕藥配伍使用。有研究報道鳳仙透骨草含有黃酮類、萘醌類、香豆素類、留醇類、多肽類化合物及蛋白質等成分。另有研究表明:羊角透骨草所含單萜生物堿之一角蒿酯堿(Incarvillateine)被發現具有很強的鎮痛活性。在福爾馬林試驗中，角蒿酯堿的鎮痛活性高于嗎啡，且作用機理不同于嗎啡，主要是通過U、K和adenosine受體發揮作用。現代藥理研究表明透骨草水提取液具有明顯的抗炎鎮痛作用，此外還具有抗菌、抗過敏等作用。雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobussuberectus Dunn的干燥藤莖，其性溫，味苦、甘，歸肝、腎經。有活血補血、舒筋通絡、調經止痛的功效，用于風濕痹痛，血虛萎黃、麻木癱瘓、月經不調等癥。含有到黃酮、三萜和甾醇等多種成分，但具體活性成分不明確。現代藥理研究表明:雞血藤有抑制血小板聚集、降低血壓、抗心律失常等作用。生白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖。苦、甘，溫。歸脾、胃經。具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎功效。用于治療脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安癥狀。主要含有揮發油、內酯類、多糖類。揮發油在白術根莖中約含1.4%，其主要成分為蒼術酮、蒼術醇等。近代藥理學研究表明白術具有免疫調節、利尿、抗腫瘤、抗菌消炎、降糖、抗衰老等作用，對神經系統、消化道、子宮平滑肌也有一定作用，還能調節免疫功能。[0005]目前已發表的3篇論文題目分別是:“蓮威阿娜奇處方水提浸膏中總糖含量測定”(發表在《中國實驗方劑學雜志》，2012第5期)與“以蘆丁為對照品對蓮威阿娜奇處方醇提工藝研究”(發表在《時珍國醫國藥》，2012第10期)以及“蓮威阿娜奇顆粒劑的工藝研究”(發表在《新疆醫科大學雜志》2012年4月)。
[0006]關于蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥的鎮痛、抗炎作用與急性毒性方面的藥物試驗，國內外均未見報道資料。[0007]世界衛生組織將骨關節疾病列為繼心腦血管疾病、癌癥、糖尿病〃三大殺手〃外對人體危害最廣泛的疾病。據世衛組織統計，全世界骨關節疾病的患病率為:50歲以上的人群中患病率超過50%，55歲以上的人群中患病率為80%，60歲以上的中老年人，幾乎都患有不同程度的骨關節疾病。目前全世界共有3.55億骨關節疾病患者。目前，在我國60歲以上的人群中，約有55%的人患有骨關節炎，在70歲以上的人群中，約有80%的人患有骨關節炎。最新的統計數據顯示，我國約有1.2億人正經受著骨關節炎的折磨。此外，我國還有
2.6億的體重超標者和肥胖癥患者成為骨關節炎的后備軍。
[0008]目前西醫對于骨關節炎的治療沒有太多良策。尚無依據證明應用化學藥:非甾體抗炎藥(NSAID)對骨關節炎有長期療效。醋氨酹(ac-etaminophen)最大劑量為lg，每日4次，能有效鎮痛，且比NSAID更安全。在疼痛反復發作或炎癥體征明顯時，可使用阿司匹林或其他NSAID，能有效地緩解癥狀(參見第50節)。C0X-2抑制劑能控制炎癥反應，減輕疼痛，副作用較小，處于最后的研究階段。當支持患病關節的肌肉受牽拉而引起疼痛時，肌肉松弛劑通常可提供暫時的療效(一般均給予小劑量)。由于藥物副作用，一般不給病人口服腎上腺皮質激素。關節內注射激素對關節有炎癥表現的病人有效，而且應間斷注射。藥物治療在最佳的治療計劃中占次要地位，其比重約占整個計劃的15%。如所有保守治療均無效，必須考慮外科治療，如椎板切除術，切骨術，全關節置換術等。在脊柱，膝，第一掌指骨關節炎，不同的支持器可使其減少負重，但必須繼以特殊訓練。其他輔助治療有經皮神經刺激和局部摩擦(如用辣椒素)。而用于保護軟骨或軟骨移植的實驗性治療仍在進一步試驗中。

【發明內容】

[0009]本發明提供了一種蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，克服了上述現有技術之不足，其能有效解決關于蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥的鎮痛、抗炎作用與急性毒性方面的藥物試驗國內外均未見報道的問題。
[0010]本發明的技術方案是通過以下措施來實現的:一種蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用。
[0011]下面是對上述發明技術方案的進一步優化或/和改進:
上述蓮威阿娜奇顆粒按下述制備方法得到:
第一步，按重量份計分別稱取骨碎補8份至12份、土鱉蟲1份至5份、雪蓮7份至11份、肉蓯蓉13份至17份、威靈仙13份至17份、仙靈脾8份至12份、雞血藤8份至12份、阿納齊根8份至12份、桑椹13份至17份、鹿銜草13份至17份、透骨草8份至12份和生白術13份至17份；第二步，將所需量的雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾和雞血藤混合在一起作為醇提藥材，向醇提藥材中加入質量是醇提藥材質量12倍的體積濃度為70%的乙醇水溶液在溶液沸騰狀態下進行醇提，提取2次，每次2.5h，醇提后得到醇提液和醇提藥渣，將醇提液在壓力為-0.098MPa、溫度為50°C至60°C條件下減壓濃縮成常溫下相對密度為1.30至1.35的稠膏；
第三步，對所需量的生白術進行提取揮發油并分別得到揮發油、白術藥液和干藥渣，然后向揮發油中加入質量是揮發油質量8倍的β_環糊精，在20°C條件下攪拌Ih得到包合物；
第四步，將所需量的阿納齊根、桑椹、鹿銜草、透骨草和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起作為水提藥材，向水提藥材中加入質量是水提藥材質量12倍的純水在水沸騰狀態下進行水提，提取3次，每次2小時，水提后得到水煎液，將水煎液在壓力為-0.098MPa、溫度為70°C至80°C條件下減壓濃縮成每Iml藥液中含有0.2g生藥的水提藥液，將水提藥液和白術藥液混合在一起后冷卻至室溫，接著向其中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液至混合液的體積含醇量達到80%，室溫下放置I小時后，密封于4°C冰箱，冷藏24小時，然后進行抽濾，抽濾后得到的濾渣即為粗多糖；
第五步，將稠膏和粗多糖混合在一起后在壓力為-0.08MPa、溫度為60°C條件下干燥6小時得到浸膏粉，將所需量的骨碎補和土鱉蟲打成150目至200目的細粉，分別稱取質量是浸膏粉質量10%的微晶纖維素細粉和質量是浸膏粉質量0.5%的羧甲基纖維素鈉，將細粉、微晶纖維素細粉、羧甲基纖維素鈉和浸膏粉混合均勻，然后向其中加入體積濃度為70%的乙醇水溶液得到手握成團、輕按即散的軟材，接著過16目篩網制粒，過篩顆粒在溫度為60°C條件下進行干燥得到干顆粒，將干顆粒和包合物混勻后得到蓮威阿那奇顆粒劑。
[0012]上述第二步中，將雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾、雞血藤粉碎至能過I號篩后，再進行醇提。
[0013]上述第三步中，用揮發油提取器或揮發油提取罐提取所需量的生白術中的揮發油。
[0014]上述先將揮發油用等體積的無水乙醇稀釋均勻得到揮發油稀釋液，然后將所需量的環糊精溶于水并加熱溶解成環糊精水溶液、冷卻后得到環糊精飽和溶液，接著在20°C條件下將揮發油稀釋液與β -環糊精飽和溶液混合在一起攪拌lh，冷藏至少24小時后，用30°C至60°C的石油醚將濾渣洗滌三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小時得到包合物。
[0015]上述第四步中，將阿納其根、桑椹、鹿銜草、透骨草剪碎成綠豆大小的顆粒狀后和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起再進行水提。
[0016]本發明的蓮威阿娜奇顆粒具有低毒性，針對骨關節軟骨細胞破壞及炎癥有較好的效果，并且具有一定的鎮痛效果，能夠用于治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]附圖1為本發明中的蓮威阿娜奇顆粒的制備工藝流程圖。
[0018]附圖2為本發明中的蓮威阿娜奇顆粒的顆粒吸濕平衡曲線。【具體實施方式】
[0019]本發明不受下述實施例的限制，可根據本發明的技術方案與實際情況來確定具體的實施方式。
[0020]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步描述:
實施例1，該蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用。
[0021]可根據實際需要，對上述蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用作進一步優化或/和改進:
實施例2，如圖1所示，實施例1中的蓮威阿娜奇顆粒按下述制備方法得到:
第一步，按重量份計分別稱取骨碎補8份至12份、土鱉蟲1份至5份、雪蓮7份至11份、肉蓯蓉13份至17份、威靈仙13份至17份、仙靈脾8份至12份、雞血藤8份至12份、阿納齊根8份至12份、桑椹13份至17份、鹿銜草13份至17份、透骨草8份至12份和生白術13份至17份；
第二步，將所需量的雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾和雞血藤混合在一起作為醇提藥材，向醇提藥材中加入質量是醇提藥材質量12倍的體積濃度為70%的乙醇水溶液在溶液沸騰狀態下進行醇提，提取2次，每次2.5h，醇提后得到醇提液和醇提藥渣，將醇提液在壓力為-0.098MPa、溫度為50°C至60°C條件下減壓濃縮成常溫下相對密度為1.30至1.35的稠膏；
第三步，對所需量的 生白術進行提取揮發油并分別得到揮發油、白術藥液和干藥渣，然后向揮發油中加入質量是揮發油質量8倍的P -環糊精，在20°C條件下攪拌Ih得到包合物；
第四步，將所需量的阿納齊根、桑椹、鹿銜草、透骨草和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起作為水提藥材，向水提藥材中加入質量是水提藥材質量12倍的純水在水沸騰狀態下進行水提，提取3次，每次2小時，水提后得到水煎液，將水煎液在壓力為-0.098MPa、溫度為70°C至80°C條件下減壓濃縮成每Iml藥液中含有0.2g生藥的水提藥液，將水提藥液和白術藥液混合在一起后冷卻至室溫，接著向其中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液至混合液的體積含醇量達到80%，室溫下放置I小時后，密封于4°C冰箱，冷藏24小時，然后進行抽濾，抽濾后得到的濾渣即為粗多糖；
第五步，將稠膏和粗多糖混合在一起后在壓力為-0.08MPa、溫度為60°C條件下干燥6小時得到浸膏粉，將所需量的骨碎補和土鱉蟲打成150目至200目的細粉，分別稱取質量是浸膏粉質量10%的微晶纖維素細粉和質量是浸膏粉質量0.5%的羧甲基纖維素鈉，將細粉、微晶纖維素細粉、羧甲基纖維素鈉和浸膏粉混合均勻，然后向其中加入體積濃度為70%的乙醇水溶液得到手握成團、輕按即散的軟材，接著過16目篩網制粒，過篩顆粒在溫度為60°C條件下進行干燥得到干顆粒，將干顆粒和包合物混勻后得到蓮威阿那奇顆粒劑。
[0022]實施例3，作為實施2的優選，第二步中，將雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾、雞血藤粉碎至能過I號篩后，再進行醇提。
[0023]實施例4，作為實施例2和實施例3的優選，第三步中，用揮發油提取器或揮發油提取罐提取所需量的生白術中的揮發油。
[0024]實施例5，作為實施例2、實施例3和實施例4的優選，先將揮發油用等體積的無水乙醇稀釋均勻得到揮發油稀釋液，然后將所需量的(6-環糊精溶于水并加熱溶解成(6-環糊精水溶液、冷卻后得到β-環糊精飽和溶液，接著在20°C條件下將揮發油稀釋液與β-環糊精飽和溶液混合在一起攪拌lh，冷藏至少24小時后，用30°C至60°C的石油醚將濾渣洗滌三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小時得到包合物。
[0025]實施例6，作為實施例2、實施例3、實施例4和實施例5的優選，第四步中，將阿納其根、桑椹、鹿銜草、透骨草剪碎成綠豆大小的顆粒狀后和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起再進行水提。
[0026]一、對根據本發明中的蓮威阿娜奇顆粒質量進行檢查:
1.水分檢測
依照中國藥典中水分測定法(2010年版一部附錄IX.H)測定蓮威阿娜奇顆粒水分，結果見表1。結果表明，顆粒水分不超過6.0%。本發明中的蓮威阿娜奇顆粒劑符合規定。
[0027]吸濕性測定
取蓮威阿娜奇顆粒2.00g，置于已稱重的扁形稱量瓶中，精密稱定重量，放入盛有氯化鈉的過飽和溶液(干燥器內的相對濕度為75%左右)的干燥器中，將扁形稱量瓶蓋揭開，分別在6h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120h后測定吸濕百分率(％)，吸濕百分率平均值結果見表2。
[0028]溶化性檢查
取蓮威阿娜奇顆粒10.0Op ,加60°C至80°C的熱水200ml，攪拌5分鐘，立即觀察，顆粒能呈混懸狀，杯底沒有沉降物出現，仔細觀察無焦屑物存在。通過觀察，本發明中的蓮威阿娜奇顆粒符合藥典規定。
[0029]粒度測定
依據2010版藥典粒度測定法(附錄X I B第二法，雙篩分法)測定:不能通過一號篩(10目)與能通過五號篩(80目)的顆粒重量占總顆粒重量的比例，不得超過15%。結果見表3。由表中數據可以看出，本發明中的蓮威阿娜奇顆粒劑符合藥典規定。
[0030]休止角測定
固定漏斗法測定休止角，將漏斗3只串聯后，固定于鐵架臺上，將最低處的漏斗口下緣降至離坐標紙的高度為1.0cm，取蓮威阿娜奇顆粒緊貼漏斗內壁倒入最上面的漏斗，使顆粒圓錐體尖端恰好接觸到漏斗口，量取直徑(2R)，算出休止角a。休止角的測定結果見表4。結果表明:蓮威阿娜奇顆粒休止角小于35°，顆粒流動性較好，符合要求。
[0031]臨界相對濕度(CRH)的測定
顆粒分裝時，容易受環境的影響，尤其是相對濕度的影響，故必須對顆粒進行平衡吸濕性試驗。
[0032]測定方法:取蓮威阿那奇顆粒成品1.00g，分置于干燥至不再增重的扁形稱量瓶中，將其放入盛有不同相對濕度溶液的干燥器中，揭開瓶蓋，25°C放置72小時，當顆粒吸濕至恒重后，及時加蓋移出后，再次精密稱重，計算吸濕百分率(%)。
[0033]設縱坐標為吸濕率，橫坐標為相對濕度，繪制吸濕曲線。將吸濕曲線直線部分的交點垂直與橫軸交點所對應的橫坐標即為臨界相對濕度(CRH)，見圖2 (顆粒吸濕平衡曲線)。臨界相對濕度(CRH)的測定結果平均值，見表5。由圖2中曲線作切線，切線相交處向橫軸做垂線，即得臨界相對濕度約為70.5%，結果提示，在制粒劑貯存時，環境濕度應控制在70.5%以下，以減少水分對藥物性質及穩定性的影響。[0034]二、蓮威阿娜奇顆粒針對治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥方面藥理作用的分析:
1、急性毒性試驗的最大耐受量(MTD)試驗:給予實驗小鼠蓮威阿那奇顆粒所能灌胃的
最高液體濃度和小鼠一次最大灌胃的耐受容積的劑量，觀察給藥后7天小鼠生存狀態，也就是急性毒性試驗的最大耐受量試驗。
[0035]動物分組:昆明種小鼠40只，體重18 g至22g，雌雄各半。檢疫3天無異常后分成雌雄2組，每組20只。試驗時雌性小鼠平均體重為:19.7g±0.3g;雄性小鼠平均體重為:20.5g±0.6g。
[0036]給藥:禁食12h后，蓮威阿那奇顆粒劑混懸液每只小鼠一次灌胃1.0ml,間隔4h重復給藥1.0ml，共計2.0ml ;其中，蓮威阿那奇顆粒劑混懸液的濃度為0.5g/ml。
[0037]記錄:每日觀察記錄小鼠有無毒性反應和死亡、精神狀態、體重變化、食物量及飲用水量的改變，至第7日結束。
[0038]試驗結果:灌胃蓮威阿那奇顆粒混懸液后，連續觀察7天，小鼠無毒性反應和死亡，精神狀態良好，進食和飲水量無異常，體重正常增長。蓮威阿那奇顆粒平均最大耐受量為:20g小鼠給藥2.0ml (0.5g/ml),即一天小鼠劑量為lg/20g=50g/kg，若等量成人體重劑量為3500g/70kg，按照成人70kg顆粒劑一天的用量30計，即相當于成人臨床用藥量的3500/30~116.67倍。由此可以看出，成人低劑量同樣不會出現毒性反應。
[0039]小鼠熱板法鎮痛實驗:以小鼠熱板法實驗評估蓮威阿那奇顆粒的鎮痛作用。
[0040]動物分組:昆明種小鼠50只，體重18_22g，雌雄各半，檢疫3天無異常后分成陰性對照組、陽性對照組、實驗低劑量組、實驗中劑量組和實驗高劑量組，每組10只。
[0041]給藥:各組小鼠禁食12小時后，分別給各組小鼠給藥:
陰性對照組:分別給予每只小鼠生理鹽水0.2ml灌胃，連續5天；
陽性對照組:分別給予每只小鼠阿司匹林90mg/kg體質量灌胃，連續5天；
實驗低劑量組:分別給予每只小鼠蓮威阿那奇顆粒2000mg/kg體質量灌胃，連續5天； 實驗中劑量組:分別給予每只小鼠蓮威阿那奇顆粒4000mg/kg體質量灌胃，連續5天； 實驗高劑量組:分別給予每只小鼠蓮威阿那奇顆粒8000mg/kg體質量灌胃，連續5天。
[0042]記錄:第5天灌藥后半小時，將每只小鼠放在預先加熱到55°C的金屬板上，以舔后足為疼痛反應指標，分別記錄每組30min和90min小鼠疼痛的反應時間平均值；90min痛閾提高百分率以下式計算，以上平均結果()進行顯著性檢驗(t檢驗)。
[0043]結果:結果見表6，由表6可以看出，蓮威阿那奇顆粒各組均可不同程度的提高痛域值，蓮威阿那奇顆粒的中劑量和大劑量組的鎮痛效果較阿司匹林組好，說明蓮威阿那奇顆粒具有較好的鎮痛作用。
[0044]小鼠足跖腫脹實驗:以小鼠足跖腫脹實驗評估蓮威阿那奇顆粒的抗炎作用。
[0045]動物分組:昆明種小鼠50只，體重18g至22g，雌雄各半，檢疫3天無異常后分成陰性對照組、陽性對照組、實驗低劑量組、實驗中劑量組和實驗高劑量組，每組10只。
[0046]給藥:各組小鼠禁食12小時后，分別給各組小鼠給藥:
陰性對照組:分別給予每只小鼠生理鹽水0.2ml灌胃，連續5天；
陽性對照組:分別給予每只小鼠醋酸潑尼松5mg/kg體質量灌胃，連續5天；
實驗低劑量組:分別給予每只小鼠蓮威阿那奇顆粒2000mg/kg體質量灌胃，連續5天； 實驗中劑量組:分別給予每只小鼠蓮威阿那奇顆粒4000mg/kg體質量灌胃，連續5天；實驗高劑量組:分別給予每只小鼠蓮威阿那奇顆粒8000mg/kg體質量灌胃，連續5天。
[0047]記錄--第5天灌藥后半小時，于小鼠左右足跖腱膜下注射1%角叉菜膠0.04ml致炎，5小時后從踝關節處對稱剪下小鼠足跖并稱重，以左右足跖重量差作為小鼠足跖腫脹度，并記錄各組小鼠足跖腫脹度平均值，通過下式計算出腫脹度和腫脹抑制率平均值，并且各組平均結果()進行顯著性檢驗(t檢驗)。
[0048]腫脹度(mg)=左后足跖重量一右后足跖重量
結果:結果見表7，由表7可以看出，蓮威阿那奇顆粒各組均可不同程度的減輕角叉菜膠所致的小鼠足跖腫脹，說明蓮威阿那奇顆粒具有抑制急性炎癥的作用。
[0049]觀察蓮威阿娜奇顆粒對大鼠骨關節軟骨細胞凋亡的影響
4.1、軟骨細胞的常規培養:將大鼠原代軟骨細胞接種于Coming塑料培養瓶，并置于DMEM培養液(含體積分數為10%胎牛血清，100KU/L青霉素和100mg/L鏈霉素)，置37°C、體積分數為5% C02飽和濕度條件下培養，培養過程中，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，首次換培養液間隔72 h，以后每間隔48 h更換新鮮培養液，一般I周左右形成細胞單層。細胞生長至亞融合狀態時，用胰蛋白酶消化法做傳代接種，取對數生長期細胞用于實驗。[0050]法測定連威阿娜奇顆粒對大鼠軟骨細胞增殖的影響:取對數生長期的軟骨細胞，用2.5g/L的胰蛋白酶消化，含體積分數10%胎牛血清的培養液調成5X IO4個的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200uL，在37°C、體積分數為5% CO2飽和濕度條件下培養24h，待細胞貼壁后，更換無胎牛血清的培養基培養24h，使細胞同步化。
[0051]分組:軟骨細胞根據處理因素不同分為陰性對照組、脂多糖損傷對照組、蓮威阿娜奇顆粒低劑量組、蓮威阿娜奇顆粒中劑量組和蓮威阿娜奇顆粒高劑量組。
[0052]給藥:陰性對照組不加任何處理因素，脂多糖損傷對照組在培養液中加入終濃度為20 ug/ml的脂多糖200 UL0
[0053]蓮威阿娜奇顆粒低劑量組在培養液中預加入終濃度為20 ug/mL的蓮威阿娜奇顆粒100 uL，60 min后加入終濃度為20 ug/ml的脂多糖100 uL。
[0054]蓮威阿娜奇顆粒中劑量組在培養液中預加入終濃度為lOOug/mL的蓮威阿娜奇顆粒100 uL，60 min后加入終濃度為20 ug/ml的脂多糖100 uL。
[0055]蓮威阿娜奇顆粒高劑量組在培養液中預加入終濃度為500ug/mL的蓮威阿娜奇顆粒100 uL，60 min后加入終濃度為20 ug/ml的脂多糖100 uL。
[0056]記錄:每組觀察點設6個復孔，培養24h后，每孔加入5mg/mL的MTT 20 uL，在37°C、體積分數為5% C02飽和濕度條件下孵育4h，棄去上清液，每孔加入150 uL DMS0，振蕩混勻使藍紫色結晶物溶解后，以空白對照孔調零，用酶標儀于570 nm測定吸光度比值。測定結果平均值見表8。
[0057]結果:測定結果見表8，由表8可以看出，蓮威阿娜奇顆粒對大鼠軟骨細胞增殖的影響:與陰性對照組相比，脂多糖損傷對照組細胞增殖量明顯降低，且差異有顯著統計學意義(P〈0.01)，不同劑量的蓮威阿娜奇顆粒可促進軟骨細胞增殖，與脂多糖損傷對照組比較，差異有顯著統計學意義(P〈0.01)，與陰性對照組比較，蓮威阿娜奇顆粒高劑量組促進軟骨細胞增殖作用明顯，且差異有顯著統計學意義(p〈0.01 )。
[0058]因此，蓮威阿娜奇顆粒針對骨關節軟骨細胞破壞及炎癥有較好的效果，并且具有一定的鎮痛效果，能夠用于治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥疾病。
[0059]以上技術特征構成了本發明的實施例，其具有較強的適應性和實施效果，可根據實際需要增減非必要的技術特征，來滿足不同情況的需求。
【權利要求】
1.一種蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用。
2.根據權利要求1所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于蓮威阿娜奇顆粒按下述制備方法得到: 第一步，按重量份計分別稱取骨碎補8份至12份、土鱉蟲1份至5份、雪蓮7份至11份、肉蓯蓉13份至17份、威靈仙13份至17份、仙靈脾8份至12份、雞血藤8份至12份、阿納齊根8份至12份、桑椹13份至17份、鹿銜草13份至17份、透骨草8份至12份和生白術13份至17份； 第二步，將所需量的雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾和雞血藤混合在一起作為醇提藥材，向醇提藥材中加入質量是醇提藥材質量12倍的體積濃度為70%的乙醇水溶液在溶液沸騰狀態下進行醇提，提取2次，每次2.5h，醇提后得到醇提液和醇提藥渣，將醇提液在壓力為-0.098MPa、溫度為50°C至60°C條件下減壓濃縮成常溫下相對密度為1.30至1.35的稠膏； 第三步，對所需量的生白術進行提取揮發油并分別得到揮發油、白術藥液和干藥渣，然后向揮發油中加入質量是揮 發油質量8倍的β -環糊精，在20°C條件下攪拌Ih得到包合物； 第四步，將所需量的阿納齊根、桑椹、鹿銜草、透骨草和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起作為水提藥材，向水提藥材中加入質量是水提藥材質量12倍的純水在水沸騰狀態下進行水提，提取3次，每次2小時，水提后得到水煎液，將水煎液在壓力為-0.098MPa、溫度為70°C至80°C條件下減壓濃縮成每Iml藥液中含有0.2g生藥的水提藥液，將水提藥液和白術藥液混合在一起后冷卻至室溫，接著向其中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液至混合液的體積含醇量達到80%，室溫下放置I小時后，密封于4°C冰箱，冷藏24小時，然后進行抽濾，抽濾后得到的濾渣即為粗多糖； 第五步，將稠膏和粗多糖混合在一起后在壓力為-0.08MPa、溫度為60°C條件下干燥6小時得到浸膏粉，將所需量的骨碎補和土鱉蟲打成150目至200目的細粉，分別稱取質量是浸膏粉質量10%的微晶纖維素細粉和質量是浸膏粉質量0.5%的羧甲基纖維素鈉，將細粉、微晶纖維素細粉、羧甲基纖維素鈉和浸膏粉混合均勻，然后向其中加入體積濃度為70%的乙醇水溶液得到手握成團、輕按即散的軟材，接著過16目篩網制粒，過篩顆粒在溫度為60°C條件下進行干燥得到干顆粒，將干顆粒和包合物混勻后得到蓮威阿那奇顆粒劑。
3.根據權利要求2所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于第二步中，將雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾、雞血藤粉碎至能過I號篩后，再進行醇提。
4.根據權利要求2或3所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于第三步中，用揮發油提取器或揮發油提取罐提取所需量的生白術中的揮發油。
5.根據權利要求2或3所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于先將揮發油用等體積的無水乙醇稀釋均勻得到揮發油稀釋液，然后將所需量的環糊精溶于水并加熱溶解成環糊精水溶液、冷卻后得到環糊精飽和溶液，接著在20°C條件下將揮發油稀釋液與β -環糊精飽和溶液混合在一起攪拌lh，冷藏至少24小時后，用30°C至60°C的石油醚將濾渣洗滌三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小時得到包合物。
6.根據權利要求4所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于先將揮發油用等體積的無水乙醇稀釋均勻得到揮發油稀釋液，然后將所需量的(6-環糊精溶于水并加熱溶解成(6-環糊精水溶液、冷卻后得到(6-環糊精飽和溶液，接著在20°C條件下將揮發油稀釋液與3 -環糊精飽和溶液混合在一起攪拌lh，冷藏至少24小時后，用30°C至60°C的石油醚將濾渣洗滌三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小時得到包合物。
7.根據權利要求2或3所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于第四步中，將阿納其根、桑椹、鹿銜草、透骨草剪碎成綠豆大小的顆粒狀后和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起再進行水提。
8.根據權利要求4所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于第四步中，將阿納其根、桑椹、鹿銜草、透骨草剪碎成綠豆大小的顆粒狀后和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起再進行水提。
9.根據權利要求5所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于第四步中，將阿納其根、桑椹、鹿銜草、透骨草剪碎成綠豆大小的顆粒狀后和醇提藥渣以及干藥渣混合在一起再進行水提。
10.根據權利要求6所述的蓮威阿娜奇顆粒在制備治療骨關節軟骨細胞破壞及炎癥藥物的應用，其特征在于第四步中，將阿納其根、桑椹、鹿銜草、透骨草剪碎成綠豆大小的顆粒狀后和醇提藥渣以及干藥渣混合在一`起再進行水提。
【文檔編號】A61P19/02GK103735649SQ201310543923
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】耿東升, 金小越, 張宏濤, 王寧 申請人:中國人民解放軍新疆軍區聯勤部藥品儀器檢驗所, 新疆醫科大學第六附屬醫院