人重組肝刺激因子在制備用于治療非酒精性脂肪性肝病的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及人重組肝刺激因子在制備用于治療非酒精性脂肪性肝病的藥物中的用途。發(fā)明人用飽和脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以建立脂毒性肝細(xì)胞模型，觀察到人重組肝刺激因子能夠通過(guò)穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能來(lái)對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。HSS對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用與維持SERCAs活性有關(guān)，還發(fā)現(xiàn)HSS通過(guò)發(fā)揮自由基清除劑的作用而提高鈣泵活性，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。
【專利說(shuō)明】人重組肝刺激因子在制備用于治療非酒精性脂肪性肝病的藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及肝病的治療，尤其涉及肝刺激因子(h印aticstimulator substance, HSS)在制備用于治療非酒精性脂肪性肝病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】 [0002]HSS是最初在1975年由LaBrecque和Pesch在初斷乳大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)并提取出的一種活性物質(zhì)，因其具有特異性刺激活化狀態(tài)下肝細(xì)胞(如新生動(dòng)物肝臟，肝部分切除后殘留肝臟，肝毒物損傷)增殖的特性，故將之命名為肝刺激因子。重組HSS蛋白質(zhì)的純化結(jié)果顯不，它由125個(gè)氨基酸組成,分子量為15kDa。HSS是一種熱穩(wěn)定蛋白，抗酸、耐堿，但對(duì)蛋白酶極其敏感，反映出該因子具有蛋白質(zhì)本性(LaBrecque DR和Pesch LA, 1975 ；Yang ZC等人，2007)。早期研究表明，HSS具有嚴(yán)格的器官特異性而無(wú)種屬特異性，在體內(nèi)外均可促進(jìn)肝源性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖；促進(jìn)肝切后殘留肝組織的再生。
[0003]非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD)是一類慢性代謝性疾病，是指無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積為特征的臨床病理綜合癥(Festi D，2004)。自1980年這一概念首次提出至今，NAFLD患病率在全球范圍內(nèi)幾乎增加了一倍。目前在中國(guó)，NAFLD已經(jīng)成為感染性肝炎之外的主要肝臟疾病(Szcwpaniak LS等人，2007)。臨床上，NAFLD是一個(gè)肝臟病變的疾病譜，它包含單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝臟纖維化以及肝硬化。NAFLD早期病程可逆，如果早期未加以干預(yù)則NAFLD向肝臟纖維化以及肝硬化方向發(fā)展，此階段為原則上不可逆的階段。發(fā)生NAFLD時(shí)，肝臟損傷的基本特征是:肝內(nèi)脂肪堆積，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以及大范圍肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變。肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性是NAFLD的最早期階段，此階段通常被稱為肝臟的“第一次打擊”。在這個(gè)階段，游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)聚集在肝細(xì)胞內(nèi)并發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的活性氧簇(reactive oxygen species, R0S)和自由基,又反過(guò)來(lái)又對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害(稱為“第二次打擊”)。此外，F(xiàn)FAs的毒性還可增加肝臟對(duì)環(huán)境或遺傳等因素的敏感性，最終導(dǎo)致肝臟不可逆性損傷。雖然NAFLD的病因尚不明確，越來(lái)越多的研究表明:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是脂肪酸脂毒性對(duì)肝細(xì)胞損害乃至誘發(fā)NAFLD的重要原因之一(Harmeet M，2008)。當(dāng)毒物、藥物等因素?fù)p傷細(xì)胞時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白聚積，并由此而引發(fā)的以分子伴侶表達(dá)上調(diào)為特征的一系列應(yīng)激反應(yīng)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)。
[0004]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞器，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、蛋白折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以及胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞遭遇藥物等毒物因素?fù)p傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、大量錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚積，由此而引發(fā)的以分子伴侶表達(dá)上調(diào)為特征一系列應(yīng)激反應(yīng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在一定程度上可以抑制穩(wěn)態(tài)的失衡，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，但是當(dāng)應(yīng)激因素持續(xù)存在超過(guò)了細(xì)胞自我調(diào)節(jié)的范圍時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)一系列應(yīng)答反應(yīng)會(huì)引導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡，并伴隨著細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成增加和炎癥反應(yīng)出現(xiàn)。
[0005]臨床研究表明，NAFLD的患者肝臟中均有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表現(xiàn)。肝細(xì)胞內(nèi)聚集過(guò)多的脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)(如自由基分子和R0S)，這些有害物質(zhì)不僅損傷內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，也能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)(Gentile CL，2011)。ROS可直接攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+ATPase, SERCA),|丐泵損傷后會(huì)導(dǎo)致鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔釋放到胞漿中，引發(fā)未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚積，最終內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)垮塌，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑細(xì)胞凋亡(Jiang Y,2011)o可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡是啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中最關(guān)鍵的事件之一。因此，在NAFLD病程中，人們?nèi)钥释軌蚴褂媚撤N藥物對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)減輕或者延緩NAFLD的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了人重組肝刺激因子(human hepaticstimulator substance, hHSS)在制備用于治療非酒精性脂肪性肝病的藥物中的用途。 [0007]在具體的實(shí)施方式中，人重組肝刺激因子是CN200710008293.8中所描述的人重組肝刺激因子。
[0008]在具體的實(shí)施方式中，非酒精性脂肪性肝病選自:單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝臟纖維化以及肝硬化中的一種或多種。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了人重組肝刺激因子在制備用于改善非酒精性脂肪性肝病中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥物中的用途。
[0010]在具體的實(shí)施方式中，改善非酒精性脂肪性肝病的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白選自:GRP-78、SREBP-1C和P-PERK中的一種或多種。
[0011]在具體的實(shí)施方式中，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和/或形態(tài)。
[0012]在具體的實(shí)施方式中，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)。
[0013]在具體的實(shí)施方式中，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指緩解肝臟細(xì)胞凋亡。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1A:HSS的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在HSS (HSS-Tr:轉(zhuǎn)染HSS基因的BEL-7402細(xì)胞；PDI (蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異性標(biāo)志蛋白，作為對(duì)照)。
[0015]圖1B =HSS的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位。第一排為野生型BEL-7402細(xì)胞；第二排為HSS-Tr (轉(zhuǎn)染HSS基因的BEL-7402細(xì)胞)。免疫熒光顯示HSS與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有共定位。
[0016]綠色:HSS ;紅色:ER_Tracker ;黃色:共定位點(diǎn)；藍(lán)色:DAPI。
[0017]圖2A:棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的損傷。不同濃度PA作用細(xì)胞24小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞生存率。HSS-Tr:轉(zhuǎn)染HSS基因的BEL-7402細(xì)胞；vector-Tr:轉(zhuǎn)染有空載體的BEL-7402 細(xì)胞。
[0018]圖2B:PA誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的損傷。100 μ M PA作用細(xì)胞不同時(shí)間后檢測(cè)細(xì)胞生存率。HSS-Tr:轉(zhuǎn)染HSS基因的BEL-7402細(xì)胞；vector_Tr:轉(zhuǎn)染有空載體的BEL-7402細(xì)胞，圖中標(biāo)尺為25 μ M。[0019]圖2C和圖2D:PA誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的損傷。尼氏紅染色后通過(guò)共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況，圖中標(biāo)尺為10 μ M。
[0020]圖2Ε和圖2F:ΡΑ誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的損傷。尼氏紅染色后通過(guò)電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況，圖中標(biāo)尺為10 μ Μ。
[0021]圖2G:ΡΑ誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的損傷。細(xì)胞內(nèi)的FFA含量。
[0022]圖2Η:ΡΑ誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的損傷。細(xì)胞內(nèi)的TG含量。
[0023]圖3Α至圖3C:對(duì)照試驗(yàn)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)。圖中箭頭顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔寬度和核糖體附著情況(HSS-Tr，轉(zhuǎn)染HSS基因BEL-7402細(xì)胞；Vector_Tr，轉(zhuǎn)染空載體BEL-7402細(xì)胞)。
[0024]圖3D至圖3F:PA誘導(dǎo)后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)。圖中箭頭顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔寬度和核糖體附著情況(HSS-Tr，轉(zhuǎn)染HSS基因BEL-7402細(xì)胞；Vector_Tr，轉(zhuǎn)染空載體BEL-7402細(xì)胞)。
[0025]圖3G:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP-78的檢測(cè)。
[0026]圖3H:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白SREBP-1c的檢測(cè)。
[0027]圖31:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白p-PERK的檢測(cè)。
[0028](圖3G 至 31 =HSS-Tr,轉(zhuǎn)染 HSS 基因 BEL-7402 細(xì)胞；Vector_Tr，轉(zhuǎn)染空載體BEL-7402 細(xì)胞；Mutant-Tr，轉(zhuǎn)染突變體 BEL-7402 細(xì)胞)。
[0029]圖4A:PA誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。NAC (N-乙酰半胱氨酸)和Na-DMPS(二巰基丙磺酸鈉)預(yù)處理細(xì)胞I小時(shí)后加入PA或KCl作用30分鐘，再用鈣離子熒光探針Fluo-3AM標(biāo)記胞漿內(nèi)游離鈣離子，熒光共聚焦顯微鏡觀察觀察細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)存和鈣釋放情況。
[0030]圖4B:PA誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。KCl作用后細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣負(fù)荷。
[0031]圖4C:PA誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。鈣離子波形經(jīng)過(guò)公式(Λ R/R)換算為柱形圖。
[0032]圖4D:PA誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵活性。
[0033](圖4A至圖4D:HSS_Tr，轉(zhuǎn)染HSS基因BEL-7402細(xì)胞；Vector_Tr，轉(zhuǎn)染空載體BEL-7402 細(xì)胞；Mutant-Tr，轉(zhuǎn)染突變體 BEL-7402 細(xì)胞)。
[0034]圖5A:流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)胞漿內(nèi)ROS含量。波峰右移提示熒光強(qiáng)度增加。橫坐標(biāo)代表FITC-A，縱坐標(biāo)代表計(jì)數(shù)。圖框內(nèi)數(shù)值代表熒光強(qiáng)度。
[0035]圖5B:流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)胞漿內(nèi)ROS含量。各組細(xì)胞相對(duì)熒光值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0036](圖5A 至 5B =HSS-Tr,轉(zhuǎn)染 HSS 基因 BEL-7402 細(xì)胞；Vector_Tr，轉(zhuǎn)染空載體BEL-7402 細(xì)胞；Mutant-Tr，轉(zhuǎn)染突變體 BEL-7402 細(xì)胞；Ctrl:對(duì)照。)
[0037]圖6A、圖6B和圖6C:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Hoechst33342顯示細(xì)胞核形態(tài)變化及其統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0038]圖6D:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞比例。
[0039]圖6E:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果。橫坐標(biāo)代表FITC-A，縱坐標(biāo)代表P1-A。
[0040]圖6F:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞比例。
[0041]圖6G:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)ATP含量的檢測(cè)。
[0042](圖6D 至 6G =HSS-Tr,轉(zhuǎn)染 HSS 基因 BEL-7402 細(xì)胞；Vector_Tr，轉(zhuǎn)染空載體BEL-7402 細(xì)胞；Mutant-Tr，轉(zhuǎn)染突變體 BEL-7402 細(xì)胞；Ctrl:對(duì)照)。【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，其中實(shí)施例僅僅起說(shuō)明而非限定的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以在本發(fā)明披露的具體實(shí)施方案中的技術(shù)上做出改進(jìn)，但是不超過(guò)本發(fā)明權(quán)利要求的范圍或者本發(fā)明范圍之內(nèi)所做出的改進(jìn)都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。如下實(shí)施例中所用野生型BEL-7402細(xì)胞、轉(zhuǎn)染HSS的BEL-7402細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的BEL-7402描述于中國(guó)專利申請(qǐng)CN200710008293.8，其并入此處作為參考。
[0044]實(shí)施例1.突變體HSS及其載體的制備
[0045]采用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?美國(guó)Stratagene公司),針對(duì)HSS —級(jí)肽鏈的保守基序第62位半胱氨酸和第65位半胱氨酸設(shè)計(jì)PCR引物，定點(diǎn)改變DNA的兩個(gè)堿基類型，使第62位和第65位的半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸，原來(lái)的第62位半胱氨酸和第65位半胱氨酸形成的二硫鍵在突變體HSS蛋白質(zhì)中無(wú)法形成，從而影響其生物學(xué)功能。
[0046]上游引物
【權(quán)利要求】
1.人重組肝刺激因子在制備用于治療非酒精性脂肪性肝病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述人重組肝刺激因子是中國(guó)專利申請(qǐng)CN200710008293.8中的人重組肝刺激因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述非酒精性脂肪性肝病選自:單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝臟纖維化以及肝硬化中的一種或多種。
4.人重組肝刺激因子在制備用于改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥物中的用途，其中所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指非酒精性脂肪性肝病中發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述人重組肝刺激因子是中國(guó)專利申請(qǐng)CN200710008293.8中的人重組肝刺激因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)，其中所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白選自:GRP-78、SREBP-1c和p-PERK中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和/或形態(tài)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指緩解肝臟細(xì)胞的凋亡。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK103566356SQ201310556743
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】安威, 張靜, 李媛, 俞豪 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)