中藥雙向發酵技術的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種中藥雙向發酵技術。具體步驟包括中藥預處理，發酵菌種的選擇及活化，最佳發酵方式的確定，通過發酵試驗分析發酵產物有效活性成分變化，以此評估新型發酵炮制中藥的藥效。本發明利用中藥及微生物所特有的藥性及功能成分，通過二者的深層次相互作用提升其抗氧化、抗自由基、增強免疫力等醫療保健功能。
【專利說明】中藥雙向發酵技術
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種以中藥為原料的微生物雙向發酵技術。【背景技術】[0002]中藥發酵技術是一種古老的傳統中藥加工技術，如傳統發酵產品有淡豆鼓、百藥煎、豆黃、六神曲、建神曲、半夏曲、沉香曲等。微生物發酵法是生物轉化的方法之一，在中藥領域中早有應用，可以提高中草藥中活性成分的含量。目前，微生物發酵中藥已成為中藥研究的新內容，利用微生物中的酶系與中藥中復雜的化學成分反應，可以改變某一成分含量或產生一些中藥中不具有的潔性成分，達到改變藥性、增強藥效、降低毒副作用、增加適應性的目的，從而為中藥有效化合物的篩選提供了新的途徑。如《飲片新參》記載，半夏加姜計、磯水和豆餅發酵成〃半夏曲〃后，藥性由〃溫辛，有毒〃變成了 〃苦辛，平〃，其原有的猛烈的藥力得到明顯緩解。發酵對中藥潔性成分的影響，可以從4個方面概括:(I)微生物在生長過程中產生生物潔性物質，包括多種酶、抗生素等。這些酶可以催化中藥成分的分解，或轉化成其他成分，如中藥淡豆鼓，經過發酵過程，其皂昔類成分發生了變化，轉化為游離的苷元，具有更強的生理潔性。(2)微生物的次生代謝過程中產生活性化合物。(3)中藥所含的某些成分可以改變微生物的代謝途徑，形成新的成分或改變各成分的相互比例。
(4)微生物的代謝可以將中藥中的有效成分轉化成新的化合物，同時微生物的次生代謝產物和中藥中的成分發生反應，也能產生新的化合物。
[0003]但直到目前，對中藥發酵的基礎理論方面及加工工藝技術上的研究仍處于起步階段，對單味藥材發酵和傳統復方發酵的深度開發非常有限，同時中藥發酵技術也面臨一些問題:安全性評估不充分、產品未標準化、功效成分不明確等。因此，對中藥發酵關鍵技術的正確把握關系到中藥產業發展方向和前景。

【發明內容】

[0004]中藥雙向發酵技術系采用不同的中藥材為底物組成不同的藥性基質，或在營養基質中加入具有潔性成分的中藥材組成全性基質，或用兩種以上中藥材經交叉組合成為多樣性(復方)基質，通過接種不同的菌種如藥用真菌，使發酵的作用從原來單向性的、僅由農副產品構成的營養基質提供微生物大量生長菌體并產生各種代謝物質所需的C、N源等營養成分，發展到應用菌種的酶使藥性基質的組織、成分分解、變化、產生新的成分，使發酵作用演變成雙向性，從而形成新的性昧、功能不同的藥性菌質或全性菌質，故具有雙向性或多樣性。再用此類菌質進行藥理模型篩選后，可以獲得不同的中藥產品。就發酵產物的類型而言，有下列幾種類型:(I)以菌種菌體為目的產物的菌體發酵；(2)以菌體代謝產物(初級和次級代謝產物)為目的產物發酵；(3)利用菌體細胞的一種或多種酶的修飾作用把一種
化合物如中藥材中的某類大分子物質轉變成結構相關的更有藥用價值的其他化合物；
(4)以菌種的酶(含蛋白)為產物的酶發酵。本發明以中藥為主要發酵基質，用菌種尤其是藥用真菌進行雙向發酵，以研究二者之間相互作用對抗氧化性的影響及其活性成分含量變化，
旨在探索出一種提高中藥發酵度及其藥效的技術和途徑。本發明的目的是按如下技術方案實現的，其特征是它包括以下步驟:
(1)中藥預處理(切片、磨粉、浸提等)；
(2)發酵種子液的制備(對選取的菌種進行擴大培養)；
(3)最適發酵培養基的確定(分別以單一中藥、中藥復合培養基為基礎；對中藥添加量、非藥物部分含量如麥麩、玉米芯及料液比進行確定)；
(4)最佳發酵方式、條件的確定(固態、液態方式及最適溫度、時間、通氧量、接種量、pH)；
(5)進行發酵試驗動態跟蹤分析發酵產物有效活性成分變化(總多糖、總黃酮、纖維素酶活性、HPLC測定發酵前后指紋圖譜變化未確定新藥效成分)，發酵最終產物的抗氧化活性(清除羥基自由基、過氧游離基、DPPH自由基試驗)及免疫力(單核吞噬細胞如肝竇內表面的吞噬細胞KupfTer細胞的數目及吞噬能力)提升；
(6)根據以上所有結果來評估新型發酵炮制中藥的藥效。
[0005]本發明的有益效果
(I)工藝簡單，設備要求不高，適于工業化推廣。
[0006](2)利用中 藥及微生物所特有的藥性及功能成分，通過二者的深層次相互作用提升其抗氧化、抗自由基、增強免疫力等醫療保健功能。
[0007](3)促進中藥產業升級和健康發展，為中藥加工企業開發新產品提供一定的技術支撐和參考依據。
【具體實施方式】
[0008]下面的實施例可以進一步說明本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0009]實施例1
液態雙向發酵--稱取干制大黃(Rheum officinale) 若干kg,通過粉碎機研磨
成粉末，然后加入8倍質量水溶液，攪拌并浸泡3小時；然后2000r/min離心15min，取上清液；以靈芝(Ganodorma Iucidum)為發酵藥用真菌種子，PDA斜面培養基活化，采用玉米粉液體培養基擴大培養；通過在設定的基礎培養基中加入30%濃度的大黃水提取液，制成全
性培養基(玉米芯:麥麩 1: 3，MgS04 (0.05% )、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2P04(0.1% )均
為質量濃度)。接入靈芝種子液，置于在28 OC、搖床轉速160r，自然ph條件下，培養7d;然后即可進行化學檢測，測量靈芝的生物量及菌絲球直徑。再對發酵液進行DPPH清除率、還原力及非特異性免疫能力測定；最后對發酵中藥的藥性做出評估。
[0010]實施例2
液態雙向發酵稱職干制黃芪(Radix Astragali)若干，通過粉碎機研磨成40目大小粉末，然后按1: 8的料液比加入水溶液，(即IOg黃芪粉末加入80mL純水)，攪拌并浸泡I小時；然后1000r-3000r/min離心15min，取上清液；以靈芝為發酵藥用真菌種子，PDA斜面培養基活化，采用玉米粉液體培養基擴大培養；通過在設定的基礎培養基中加入30% (占培養基的全重量)濃度的黃瓦水提取液，制成全性培養基(玉米芯:麥麩=1: 3，MgSO4 (0.05% )、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2PO4 (0.1% )均為質量濃度)。
[0011]接入靈芝種子液，置于在28V、搖床轉速160r，培養7d ;然后即可進行化學檢測，測量靈芝的生物量及菌絲球直徑。再對發酵液進行苯酚硫酸法測定總多糖含量，絡合一分光廣度法測定總黃酣含量，PH計測定發酵液酸度，DPPH清除固態雙向發酵稱職干制黃芪若干，通過粉碎機研磨成40目大小粉末；以靈芝為發酵藥用真菌種子，PDA斜面培養基活化，采用玉米粉液體培養基擴大培養；通過在設定的基礎培養基中加入3% (占培養基的全重量)濃度的黃芪粉末 ，制成全性培養基(玉米芯:麥款=I: 3，MgSO4 (0.05%)、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2PO4 (0.1% )均為質量濃度)。接入靈芝種子液，置于在28°C、通過機械通風來控制通氧量，自然Ph條件下，培養7d;然后即可進行化學檢測，測量靈芝的生物量及菌絲球直徑。再對發酵物進行苯酚一硫酸法測定總多糖含量，絡合一分光廣度法測定總黃酮含量，PH計測定發酵液酸度，DPPH清除率、還原力及非特異性免疫能力進行測定；最后對發酵中藥的藥性做出評估。
【權利要求】
1.中藥雙向發酵技術，其特征在于步驟如下: (1)中藥預處理(切片、磨粉、浸提等)； (2)發酵種子液的制備(對選取的菌種進行擴大培養)； (3)最適發酵培養基的確定(分別以單一中藥、中藥復合培養基為基礎；對中藥添加量、非藥物部分含量如麥麩、玉米芯及料液比進行確定)； (4)最佳發酵方式、條件的確定(固態、液態方式及最適溫度、時間、通氧量、接種量、pH)； (5)進行發酵試驗動態跟蹤分析發酵產物有效活性成分變化(總多糖、總黃酮、纖維素酶活性、HPLC測定發酵前后指紋圖譜變化來確定新藥效成分)，發酵最終產物的抗氧化活性(消進基自由基、過氧游離基、DPPH自由基試驗)及免疫力(單核吞噬細胞如肝竇內表面的吞噬細胞KupfTer細胞的數目及吞噬能力)提升； (6)根據以上所有結果來評估新型發酵炮制中藥的藥效。
【文檔編號】A61K36/481GK103565944SQ201310581627
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】不公告發明人 申請人:青島農業大學