縮短肽鏈的Exendin4及其基因工程應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于多肽基因工程綜合技術，涉及縮短肽鏈的Exendin4及其基因工程應用。本發明首次揭示了一種縮短肽鏈的Exendin4(1-34)變體，還應用該變體成功地進行了基因工程生產，為糖尿病患者提供一個高效、廉價的治療糖尿病的藥物。
【專利說明】縮短狀鏈的Exend in4及其基因工程應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于多肽基因工程綜合技術；更具體地，本發明涉及縮短肽鏈的Exendin4及其基因工程應用。
【背景技術】
[0002]中國是世界上糖尿病大國之一，2012年糖尿病患者9000萬，其中90%為2型糖尿病，迫切需要高效、廉價的抗糖尿病藥物的治療。[0003]英國的UKPDS對現有的6種抗糖尿病藥物評價如下:沒有一個能阻止胰臟β -細胞，不斷進行性地凋亡，不能恢復β -細胞的功能，不能阻止糖尿病綜合征的發生，心臟病，腎衰竭(Diabetes，1995，44，1249)。美國NIH的報告指出，盡管嚴格控制血糖，糖尿病患者心臟病死亡率仍高于非糖尿病患者2-4倍。這些結果說明，需要能阻止β細胞凋亡，增加β-細胞總量的治療藥物。
[0004]目前，一些新一代的抗糖尿病多肽已經進入中國，包括El1-Lilly的Extendin4(39aa)，丹麥 Novo Nordisk 的 liraglutid(31aa_C16 月旨肪酸衍生物)，法國Sanofi的GLP lyxumia(44aa)。這些藥物代謝產物為氨基酸，隨著血糖的降低至正常，停止作用，不產生低血糖休克，較為安全，減少跟蹤進行血糖測定的麻煩。還能增加β_細胞總量，增加胰島素分泌和敏感性等。但是，這些多肽藥物都是化學合成品，合成過程需要經過30-44步完成，價格十分昂貴，每人每年約需花費2萬元醫藥費。
[0005]Exendin4是一條長度為39aa的多肽。盡管Exendin4已經被研究多年,然而美國FDA在2005才正式批準其作為臨床藥物。從臨床數據看，Exendin4比glargin, liraglutid,lyxumia,GLP-1臨床效果好,Exendin4維持降血糖時間相對比GLP-1長,用藥劑量比GLP-1低，注射次數比GLP-1少。
[0006]但是，Exendin4肽鏈比較長，具有免疫原性，終身用藥對于健康極其不利。并且，ExendiM的基因工程難度比較大，基因工程量產困難。為了除去免疫原性，需要縮短肽鏈長度，但NIH的報告指出；EXendin4C-端9個氨基酸殘基一個也不能少，都是必需的(Regulatory Peptides2003, vol.114,153-158)。上述問題給Exendin4 的臨床應用帶來極大阻礙。
[0007]因此，本領域非常有必要進行進一步的抗糖藥物的研究和改良，研發出副作用更低且更為廉價的藥物。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在于提供縮短肽鏈的ExendiM及其基因工程應用。
[0009]在本發明的第一方面，提供一種縮短肽鏈的Exendin4變體,該Exendin4變體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]在本發明的另一方面，提供一種編碼所述的縮短肽鏈的EXendin4變體的多核苷酸，該多核苷酸的SEQ ID NO:2中第16-117位所示的核苷酸序列。[0011]在本發明的另一方面，提供一種重組表達載體，所述的重組表達載體包含所述的多核苷酸。
[0012]在一個優選例中，所述的重組表達載體中包括12拷貝的所述的多核苷酸。
[0013]在本發明的另一方面，提供一種重組宿主細胞，所述的宿主細胞中包含有所述的重組表達載體，或其基因組中整合有所述的多核苷酸；較佳地，整合12拷貝的所述的多核苷酸。
[0014]在一個優選例中，所述的重組宿主細胞是大腸桿菌細胞；優選地是JM103或JM109。
[0015]在本發明的另一方面，提供一種重組表達所述的縮短肽鏈的Exendin4變體的方法，所述的方法包括:培養所述的重組宿主細胞，從而表達所述的縮短肽鏈的ExendiM變體。
[0016]在一個優選例中，所述表達方法中，培養基含:蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，K2HPO4.3H2012g/L, NaH2PO4.3H202g/L，50% 甘油 7ml/L ；
[0017]培養條件:37°C，攪拌速度500rpm，PH6.5~7.5，通氣量30L/min。發酵過程中不斷取液，離心后稱重，在Log phase中期加入IPTG，終濃度0.3mM,繼續發酵4小時后停止發酵；4000rpm離心收集菌體；
[0018]收集的菌體在冷卻條件下，利用超聲波破碎菌體。離心分離包涵體，再經2M尿素洗漆一次；
[0019]之后，用20mM Tris-HCl緩沖液(PH7.0-8.0)將包涵體溶解；在表達獲得的肽為12拷貝的情況下，還包括:按照100g濕重包涵體加1-1Omg的比例加入Clostripain, 3(TC,保溫，從而切割為單拷貝的Exendin4變體；
[0020]之后，將獲得的產物進`行制備型HPLC純化。
[0021]在本發明的另一方面，提供所述的縮短肽鏈的Exendin4變體的用途，用于制備改善或治療糖尿病(包括2型糖尿病)的藥物。
[0022]在本發明的另一方面，提供一種用于改善或治療糖尿病的藥物，所述的藥物包括:所述的縮短肽鏈的Exendin4變體，以及藥學上可接受的載體。
[0023]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1、序列的串聯方法的示意圖。
[0025]圖2、對照組以及縮短肽鏈的Exendin4給藥組c57BL/6小鼠在不同時間點的血糖維持情況。
[0026]圖3、體外血衆中截短型Exendin4的穩定性研究，以GLP-1作為對照。
【具體實施方式】
[0027]本發明人經過深入的研究，首次揭示了一種縮短肽鏈的Exendin4(l-34)變體，其從ExendiM的C端截短5個氨基酸。本發明人還應用該變體成功地進行了基因工程生產，為糖尿病患者提供一個高效、廉價的治療糖尿病的藥物。[0028]美國NIH曾經報告指出:Exendin4C-端9個氨基酸殘基一個也不能少，都是必需的(Regulatory Peptides2003, vol.114,153-158)。然而，本發明人分析了 NIH 的報告結論，認為該結論是在in vitro實驗基礎上作出的，并不能完全反映體內實際狀況。在試管中利用胰島瘤細胞，測定多肽與受體的結合能力(IC50)，cAMP合成(EC50)和胰島素的合成，卻忽略了多肽在體內的穩定性問題，因此對其結論，需要驗證。本發明人建立了具有臨床實際意義的in vivo評價測試方法,合成一系列不同長度的Exendin4多肽,測定其維持降血糖時間，確定縮短肽鏈的極限。除降血糖之外，還檢查ExendiM的其它藥理功能，如恢復胰島素第一相分泌，降空腹血糖功能，提高胰島素的敏感性等。最終確定了 C端截短5個氨基酸的Exendin4在體內具有良好的降糖活性。
[0029]促胰島素分泌肽
[0030]促胰島素分泌肽(Exendin-4)是一種最初發現于Heloderma suspectum(Gila畸形突變體)唾液分泌物中的多肽，其與哺乳動物胰高血糖素樣肽家族的一些成員相似，與GLP-1的在氨基酸序列上具有46%的同源性。天然的Exendin-4多肽具有如下所示的氨基酸序列:
[0031]HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEff LKNGG PSSGA PPPS-NH2
[0032]如本發明所用縮短肽鏈的Exendin4變體”是指C端截短5個氨基酸的Exendin4多肽；較佳地，其20位氨基酸是K，第34位是R。
[0033]作為本發明的最優選方式，所述的縮短肽鏈的Exendin4變體具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其編碼基因具有SEQ ID N0:2中第16-117位所示的核苷酸序列。
[0034]本發明所述的“縮短肽鏈的Exendin4變體”，較佳地其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。此外，在SEQ ID NO:1基礎上，部分位點上還可以進行適當的氨基酸的替換，例如，如下序列:HGEGT FTSDL SKQME EEAVK LFIEff LKNGG PSSR，其中，第 14 位:M 或 L ;第 27 位:K或R ;第34位:R或G。
[0035]縮短肽鏈的Exendin4變體的表達
[0036]在獲得了編碼本發明新重組蛋白的DNA序列之后，將其克隆入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后，培養轉化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的重組蛋白。
[0037]在本發明中，可選用本領域已知的各種原核表達載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明新重組蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
[0038]在本發明中，術語“宿主細胞”包括大腸桿菌細胞。作為本發明的更優選的方式，本發明適用的菌株為采用大腸桿菌(E.coli);優選地是JM103或JM109。E.coli細胞在重組表達后，細胞內包括結構蛋白、功能蛋白、外源蛋白。其中結構蛋白，功能蛋白，為了生存與繁殖，它的組成，含量不會變，只有表達的外源蛋白，有多有少，上限在30%左右，改變重組表達載體和其他因素，對提高產能影響不多，這是由E.coli細胞所決定的。
[0039]將重組質粒轉化宿主細胞可以采用本領域常用的方法。在獲得轉化的宿主細胞后，可在適合表達本發明重組蛋白的條件下培養該細胞，從而表達出重組蛋白；然后再分離出表達的重組蛋白。
[0040]為了進一步提高宿主 細胞的表達量，可以對本發明的重組蛋白的編碼序列進行改造，例如采用宿主細胞使用頻率較多的密碼子，以提高表達水平，消除不利于基因轉錄及翻譯的序列。
[0041]在構建本發明的重組表達載體時，本發明人發現，多個完整表達單元克隆到一個質粒中，并不能顯著提高產量，因為表達產物中仍然含有大量載體蛋白。因此，本發明人采用了多肽基因12拷貝串聯重組表達的策略，使得表達產物中載體蛋白含量顯著少。本發明人采用的這一拷貝數可使表達的蛋白產物形成穩定的包涵體，對于較大規模的發酵是有利的，能夠得到最優的表達效果。在獲得重組表達的產物后，應用Clostripain進行切割，使得串聯的蛋白產物被切斷為單拷貝目的多肽。
[0042]本發明還優化了發酵方法，最優的方法如下:
[0043]培養基含:蛋白胨20g/L，酵母抽提物 10g/L，K2HPO4.3H2012g/L，NaH2PO4.3H202g/L, 50% 甘油 7ml/L ；
[0044]培養條件:37°C，攪拌速度500rpm，PH6.5~7.5，通氣量30L/min。發酵過程中不斷取液，離心后稱重，在Log phase中期加入IPTG，終濃度0.3mM,繼續發酵4小時后停止發酵；4000rpm離心收集菌體；
[0045]收集的菌體在冷卻條件下，利用超聲波破碎菌體。離心分離包涵體，再經2M尿素洗漆一次；
[0046]之后，用20mM Tris-HCl緩沖液(PH7.0-8.0)將包涵體溶解；在表達獲得的肽為12拷貝的情況下，還包括:按照100g濕重包涵體加1-1Omg的比例加入Clostripain, 3(TC,保溫，從而切割為單拷貝的Exendin4變體；
[0047]之后，將獲得的產物進行制備型HPLC純化。
[0048]縮短肽鏈的Exendin4變體的用途及其組合物
`[0049]本發明提供了所述縮短肽鏈的Exendin4變體的用途，其可被用于制備治療糖尿病的組合物。
[0050]本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.0001-10wt%)的所述的縮短肽鏈的Exendin4變體，以及藥學上可接受的載體。
[0051]本發明的組合物可直接用于糖尿病的治療。此外，還可同時與其它治療劑或輔劑聯合使用。
[0052]通常，可將本發明的重組蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。
[0053]如本文所用，術語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。
[0054]如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在 Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.C0.,N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。[0055]本發明的組合物含有安全有效量的所述的重組蛋白以及藥學上可接受的載體。這類載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0056]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0057]實施例1、截短型Exendin4及其串聯設計
[0058]單拷貝截短型Exendin4的氨基酸序列如下:
[0059]HGEGT FTSDL SKQME EEAVK LFIEff LKNGG PSSR(SEQ ID NO:1)
[0060]設計的編碼序列如下(SEQ ID NO:2):
[0061]GMTTC (EcoRI) AGATCT (Bgl II) CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTGTCT MA CAG ATG GM GM GM GCG GTT AM CTG TTC ATC GM TGG CTG AM AAC GGT GGTCCG TCT TCT CGT GGATCC(Bam HI)TGA GTCGAC (Sal I)
[0062]序列的串聯方法如下(示意圖如圖1):
[0063](a) PCR擴增獲得的上述SEQ ID NO: 2序列的擴增產物，以EcoRI/Sall雙酶切后，插入到經過BamHI和SalI雙酶切的pUC18質粒的相應位點中，得到“含有I拷貝SEQ IDNO:2序列的表達質?！?。`
[0064](b)以BglII和SalI雙酶`切上述SEQ ID N0:2序列的擴增產物，插入到以BamHI和SalI雙酶切的“含有I拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質?！?，得到“含有2拷貝SEQ IDNO:2序列的表達質?！?。
[0065](c)以BglII和SalI雙酶切切下“含有2拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質粒”中的2拷貝SEQ ID NO: 2序列，插入到以BamHI和SalI雙酶切的“含有2拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質?！?，得到“含有4拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質?！?。
[0066](d)以BglII和SalI雙酶切切下“含有4拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質?！敝械?拷貝SEQ ID NO: 2序列，插入到以BamHI和SalI雙酶切的“含有4拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質?！?，得到“含有8拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質?！?。
[0067](e)以4拷貝SEQ ID NO: 2序列再次插入到“含有8拷貝SEQ ID NO: 2序列的表達質?！钡腂amHI和SalI酶切位點，得到“含有12拷貝SEQ ID NO:2序列的表達質粒”，其中包括以下DNA序列(SEQ ID NO: 3):
[0068]GAATTC AGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAGATG GAA GAA GAA GCG GTT MA CTG TTC ATC GM TGG CTG AM AAC GGT GGT CCG TCT TCTCGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAAGAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCTCGT CAC GGT GM GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT AM CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTTAAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA MC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGT CAC GGTGAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT MA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT MA CTG TTC
【權利要求】
1.一種縮短肽鏈的Exendin4變體,其特征在于,該Exendin4變體的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
2.一種編碼權利要求1所述的縮短肽鏈的ExendiM變體的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的SEQ ID NO:2中第16-117位所示的核苷酸序列。
3.—種重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體包含權利要求3所述的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，其中包括12拷貝的權利要求3所述的多核苷酸。
5.一種重組宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞中包含有權利要求3或4所述的重組表達載體，或其基因組中整合有權利要求2所述的多核苷酸；較佳地，整合12拷貝的權利要求2所述的多核苷酸。
6.如權利要求5所述的重組宿主細胞，其特征在于，所述的重組宿主細胞是大腸桿菌細胞；優選地是JM103或JM109。
7.—種重組表達權利要求1所述的縮短肽鏈的Exendin4變體的方法,其特征在于,所述的方法包括: 培養權利要求5或6所述的重組宿主細胞，從而表達權利要求1所述的縮短肽鏈的Exendin4 變體。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，培養基含:蛋白胨20g/L，酵母抽提物IOg/L, K2HPO4.3 H2012g/L, NaH2PO4.3H202g/L, 50% 甘油 7ml/L ； 培養條件:37°C，攪拌速度500rpm，PH6.5~7.5，通氣量30L/min。發酵過程中不斷取液，離心后稱重，在Log phase中期加入IPTG，終濃度0.3mM,繼續發酵4小時后停止發酵；4000rpm離心收集菌體； 收集的菌體在冷卻條件下，利用超聲波破碎菌體。離心分離包涵體，再經2M尿素洗滌一次; 之后，用20mM Tris-HCl緩沖液將包涵體溶解；在表達獲得的肽為12拷貝的情況下，還包括:按照100g濕重包涵體加1-1Omg的比例加入Clostripain, 3(TC,保溫,從而切割為單拷貝的Exendin4變體； 之后，將獲得的產物進行制備型HPLC純化。
9.權利要求1所述的縮短肽鏈的Exendin4變體的用途,用于制備改善或治療糖尿病的藥物。
10.一種用于改善或治療糖尿病的藥物，其特征在于，所述的藥物包括:權利要求1所述的縮短肽鏈的Exendin4變體，以及藥學上可接受的載體。
【文檔編號】A61K38/22GK103613657SQ201310625913
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】孫玉琨 申請人:孫玉琨