鞣花酸在治療和預(yù)防人體真菌感染的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鞣花酸在治療和預(yù)防人體真菌感染的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明研究了鞣花酸對23株真菌的體外抑真菌活性，并測定了MIC值。鞣花酸對真菌的體外活性結(jié)果顯示，鞣花酸對6種皮膚癬菌的MIC值范圍為6.25-50μg/ml，鞣花酸對臨床常見的淺部致病真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對紅色毛癬菌最為敏感。鞣花酸對6種臨床常見念珠菌的MIC值范圍為25-200μg/ml。本發(fā)明采用以鞣花酸內(nèi)服、外用對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型進(jìn)行治療，以注射方式對鞣花酸單一給藥或與氟康唑共同給藥對小鼠真菌感染模型的治療作用進(jìn)行研究。其結(jié)果表明，鞣花酸內(nèi)服、外用均對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型有一定療效。
【專利說明】鞣花酸在治療和預(yù)防人體真菌感染的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鞣花酸在制備治療和預(yù)防人體真菌感染疾病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鞋花酸的分子式C14H608,英文名:ellagicacid,化學(xué)名:2，3，7，8-tetrahydroxybenzopyrano-5, 4, 3_cde benzopyran-5, 10-dione。微溶于水、醇，溶于喊、吡卩定，不溶于醚。
[0003]鞣花酸可由地錦草、斑地錦、黑莓、覆盆子、草莓、蔓越莓、山核桃、石榴、枸杞等植物中提取制得，也可由化學(xué)合成制得。
[0004]隨著社會(huì)進(jìn)步和人們生活水平的提高，人們愈來愈關(guān)注健康和生活的質(zhì)量，真菌感染疾病是一種常見病、多發(fā)病，近年來呈逐漸上升的趨勢，然而隨著抗真菌劑的廣泛應(yīng)用，臨床耐藥菌株不斷增多，加之致病真菌對現(xiàn)有藥物的耐藥性日趨嚴(yán)重，使得真菌感染易于發(fā)生并難于控制。目前臨床上應(yīng)用的抗真菌藥物在一定程度上起到了控制致病真菌感染的作用，但還存在很多不足，如兩性霉素B具有嚴(yán)重的腎毒性；氮唑類藥物在抑制真菌的同時(shí)對哺乳動(dòng)物的細(xì)胞色素P450系統(tǒng)也具有抑制作用，進(jìn)而產(chǎn)生毒副反應(yīng)，少數(shù)使用者還可出現(xiàn)嚴(yán)重的肝毒性；酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等均有引起肝壞死或肝毒性致死的報(bào)道。目前，在天然活性成分中尋找新的高效低毒抗真菌新藥物已成為近年來抗真菌藥物研究的熱點(diǎn)和趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鞣花酸在治療和預(yù)防人體真菌和細(xì)菌感染的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案》(M38-A)，以特比萘酚、氟康唑?yàn)殛栃詫φ账?，研究了鞣花酸?3株真菌的體外抑真菌活性,并測定了 MIC值。鞣花酸對真菌的體外活性結(jié)果顯示，鞣花酸對6種皮膚癬菌的MIC值范圍為6.25~50 ii g/ml，鞣花酸對臨床常見的淺部致病真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對紅色毛癬菌最為敏感。鞣花酸對6種臨床常見念珠菌的MIC值范圍為25~200 ii g/ml。本發(fā)明采用以鞣花酸內(nèi)服、外用對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型進(jìn)行治療，以注射方式對鞣花酸單一給藥或與氟康唑共同給藥對小鼠真菌感染模型的治療作用進(jìn)行研究。其結(jié)果表明，鞣花酸內(nèi)服、外用均對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型有一定療效，通過蘇木精-伊紅(HE)染色，碘酸-雪夫(PAS)染色及真菌鏡檢轉(zhuǎn)陰、治愈率可達(dá)88.90%。以注射方式對小鼠真菌感染模型的治療中鞣花酸單一給藥時(shí)小鼠死亡率最高為25.0%，最低為8.3%，當(dāng)與氟康唑合用注射給藥時(shí)死亡率可控制在0%~16.7%以內(nèi)。鞣花酸給藥方式適用于內(nèi)服、外用、注射給藥，且鞣花酸可用于單一成分入藥或與其它藥物組合入藥，經(jīng)體內(nèi)外試驗(yàn)均表明本品抗真菌作用顯著。本發(fā)明鞣花酸的開發(fā)對抗真菌藥物臨床前景更顯重要。`
[0006]本發(fā)明所述的一種鞣花酸在制備治療和預(yù)防人體真菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0007]鞣花酸用藥的純度為50-100%。[0008]鞣花酸為單一成分入藥或與其它藥物組合入藥。
[0009]鞣花酸入藥的臨床人日使用量為I U g-20g之間。
[0010]鞣花酸藥物的給藥方式為內(nèi)服、外用和注射。
[0011]本發(fā)明通過研究鞣花酸對小鼠、豚鼠真菌感染模型的治療作用，并進(jìn)行體外對臨床常見真菌的最低抑菌濃度(MIC)測定，證實(shí)了鞣花酸體內(nèi)外抗真菌效果顯著。
[0012]本發(fā)明研究了鞣花酸對小鼠真菌感染模型的治療作用，通過建立小鼠真菌感染模型，采用腹腔注射給藥7天，進(jìn)行一般狀況觀察、測定體重，計(jì)算死亡率，測定小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。結(jié)果顯示，各給藥組對小鼠真菌感染模型均有一定治療作用，真菌感染小鼠死亡率最高為25.0%，最低為8.3%，且鞣花酸高劑量(8mg/mL)與模型組相比死亡率顯著降低，鞣花酸單用起效劑量為4mg/mL。鞣花酸與臨床常用抗真菌藥物氟康唑合用，當(dāng)氟康唑:鞣花酸2:1時(shí)可明顯改善造模小鼠的一般癥狀，體重比模型組顯著增加，死亡率為0%，SOD活性及MDA含量與正常小鼠接近。鞣花酸與氟康唑合用起效劑量為氟康唑:鞋花酸=2mg/mL:2mg/mL,綜上,鞋花酸單用或與氟康唑合用均可顯著降低小鼠真菌感染死亡率、改善其癥狀。
[0013]另外，通過建立豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型，采用外用、口服給藥7天，以皮膚病變程度、治愈率和真菌鏡檢轉(zhuǎn)陰率為評價(jià)指標(biāo)，觀察鞣花酸以與對豚鼠皮膚癬菌感染模型的治療作用。結(jié)果顯示，鞣花酸外用高劑量組(0.4g軟膏/cm2)治愈率為88.90%,中劑量(0.2g軟膏/cm2)為87.50%，低劑量(0.1g軟膏/cm2)為77.80%。鞣花酸灌胃高劑量組(15mg/kg)治愈率為 88.90%,中劑量(7.5mg/kg)為 77.78%，低劑量(3.75mg/kg)為 66.67%，病理觀察鞣花酸外用與灌胃高、中劑量可明顯改善感染組織皮膚毛囊生長情況，綜上，鞣花酸對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染治療效果顯著。
[0014]體外試驗(yàn)采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案》(M38-A)，以特比萘酚、氟康唑?yàn)殛栃詫φ账帲芯苛索坊ㄋ釋?3株真菌的體外抑真菌活性`，并測定了最低抑菌濃度(MIC)值。鞣花酸對真菌的體外活性結(jié)果顯示，鞣花酸對6種皮膚癬菌的MIC值范圍為6.25~50 ii g/ml，而臨床常用抗真菌藥物氟康唑?qū)@6種皮膚癬菌的MIC值范圍也為6.25~50 ii g/ml。由此可見，鞣花酸對臨床常見的淺部致病真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對紅色毛癬菌最為敏感，作用于氟康唑相當(dāng)。鞣花酸對6種臨床常見念珠菌的MIC值范圍為25~200 u g/ml，而氟康唑?qū)δ钪榫腗IC值范圍為12.5~50 ii g/ml，但氟康唑臨床在治療念珠菌感染時(shí)周期較長，副作用較大，臨床上有引起肝壞死或肝毒性致死的報(bào)道，該類抗生素很易出現(xiàn)耐藥性，天然耐藥菌株不斷增加，因此，鞣花酸的開發(fā)對抗真菌藥物臨床前景更顯重要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明各組豚鼠造模后一般觀察與皮膚鏡檢圖；
[0016]圖2為本發(fā)明各組膝鼠治療后光鏡下形態(tài)學(xué)圖(HE, X 400)圖；
[0017]圖3為本發(fā)明各組豚鼠治療后光鏡下形態(tài)學(xué)圖(PAS，X400)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例[0019]鞣花酸體內(nèi)外抗真菌作用的實(shí)驗(yàn)研究:
[0020](一)鞣花酸體外抗真菌實(shí)驗(yàn)研究:
[0021]摘要目的:對鞣花酸進(jìn)行體外抗真菌實(shí)驗(yàn)，測定其最小抑菌濃度(MIC)值。方法:采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋抗真菌藥敏試驗(yàn)參考方案》，即M38-A方案。在此方案的基礎(chǔ)上測定鞣花酸對17株臨床常見皮膚癬菌以及6株念珠菌的MIC值。結(jié)果:鞣花酸對皮膚癬菌中不同菌種的MIC值范圍為6.25-100 Ug/ml ;對念珠菌中不同菌種的MIC值范圍為25-200 ii g/ml。結(jié)論:鞣花酸體外具有顯著抗真菌作用。
[0022]關(guān)鍵詞:鞣花酸；體外抗真菌作用；最小抑菌濃度；
[0023]1.材料與儀器
[0024]1.1實(shí)驗(yàn)菌種:菌種來源:本實(shí)驗(yàn)所采用皮膚癬菌菌株均來自新疆醫(yī)科大學(xué)真菌與真菌病研究中心菌種保藏庫。念珠菌菌株均由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院皮膚科檢驗(yàn)室提供。
[0025]以上共計(jì)23株，菌株名稱、來源及編號見附錄A。
[0026]1.2實(shí)驗(yàn)材料:鞣花酸(上海源葉生物科技有限公司，YY13933)。二甲基亞砜(DMSO)(天津永晟精細(xì)化工有限公司，20110330)。特比萘芬(TBF)由(上海誠優(yōu)國際貿(mào)易有限公司，20090101)提供。氟康唑氯化鈉注射液(河北天成藥業(yè)股份有限公司，B12070605)。馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)(碧 迪醫(yī)療器械有限公司，2263097) ；RPM1-1640液基(Invitrogen公司，31800-022)。
[0027]1.3實(shí)驗(yàn)儀器:DM2500顯微鏡(德國LEICA);FM型生化培養(yǎng)箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BHC-1300 II A型生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；LDZX-75KBS (內(nèi)循環(huán))立式蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；BS224S型精密電子天平(德國Sartorious)。
[0028]菌種活化:皮膚癬菌:將來自菌種保藏庫的菌株挑取直徑約3mm菌絲體，以點(diǎn)接種法接種于新制備的馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)試管斜面中央，溫度28°C培養(yǎng)7-14d后進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所需菌株:紅色毛癬菌6株，石膏樣毛癬菌6株，紫色毛癬菌I株，許蘭毛癬菌I株，疣狀毛癬菌I株，犬小孢子菌I株，須狀毛癬菌I株。均由新疆醫(yī)科大學(xué)真菌與真菌病研究中心囷種保減庫提供。
[0029]念珠菌:將來自菌種保藏庫的菌株挑取卜2個(gè)菌落，以劃線接種法接種于新制備的馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)試管斜面中央，溫度36°C培養(yǎng)，時(shí)間48h后進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。白色念珠菌I株，光滑念珠菌I株，近平滑念珠菌I株，熱帶念珠菌3株。均由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院皮膚科檢驗(yàn)室提供。
[0030]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0031]根據(jù)NCCLS《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋抗真菌藥敏試驗(yàn)參考方案》(M38-P)方案在測定鞣花酸對17株臨床常見皮膚癬菌以及6株念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)值。
[0032]2.1抗真菌藥物儲備液、稀釋液的制備
[0033]稱取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg,用ImL DMSO溶解，制成濃度為50000 u g ? mL—1的儲備液，存于溫度_70°C冰箱備用；稱取TBF8mg，用ImL DMSO溶解，制成濃度為8000 u g -m^1的儲備液，存于溫度_70°C冰箱備用。
[0034]臨用前將鞣花酸和TBF儲備液，分別用RPM1-1640培養(yǎng)基倍比稀釋成2倍試驗(yàn)終濃度，鞣花酸的2倍終濃度由高向低依次為:200、100、50、25、12.5,6.25,3.125、1.5625 u g/ml ；TBF 的 2 倍終濃度由高向低依次為 0.16,0.08,0.04,0.02,0.01,0.005、0.0025,0.000625 u g/ml,氟康唑的2倍終濃度由高向低依次為:200、100、50、25、12.5、
6.25、3.125、1.5625 u g/ml。
[0035]2.2菌接種液的制備:
[0036]皮膚癬菌:將受試的皮膚癬菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基斜面上，溫度28°C培養(yǎng)7-14d，吸取2mL無菌的0.85%的NaCl溶液，輕輕沖洗菌落表面的菌絲和孢子，吸取菌液轉(zhuǎn)移至無菌試管中，振蕩器上振蕩15s，將含有菌絲和孢子的沖洗液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板記數(shù)，將其濃度調(diào)至0.4X IO6~5X IO6Cfu ? mL-1之間，用RPM1-1640培養(yǎng)基稀釋50倍至2倍終濃度。
[0037]念珠菌:將受試的念珠菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基斜面上，溫度36°C培養(yǎng)48h,挑取菌落，加入2mL無菌的0.85%的NaCl溶液中，用0.5#McFarland standard比池管比池，用RPM1-1640液基稀釋100倍后再稀釋20倍至2倍終濃度。
[0038]2.3 接種:
[0039]將100 的2倍終濃度的藥液，由第I孔至第10孔分別由高濃度到低濃度加入無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；
[0040]第11孔為生長對照孔(僅加菌接種液100 U I和RPM1-1640培養(yǎng)基100 yl);
[0041]第12孔為空白對照孔(只加RPM1-1640培養(yǎng)基200 yl);·[0042]將調(diào)好的菌接種液100 iil，分別加入相應(yīng)的微孔內(nèi)，這將使每一梯度的抗真菌藥物和菌接種液(2倍終濃度)分別被1:1稀釋到終濃度。
[0043]2.4培養(yǎng)條件和結(jié)果判定:
[0044]皮膚癬菌于溫度28°C孵育7-14天讀結(jié)果；念珠菌于溫度36°C孵育48小時(shí)讀結(jié)果。
[0045]讀取MIC值時(shí)，應(yīng)在不攪動(dòng)的情況下與對照孔按比較，溶液清晰透明視為真菌完全不生長，取完全不生長管最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。
[0046]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0047]表1鞣花酸、氟康唑和TBF對23株真菌的藥物敏感性
【權(quán)利要求】
1.一種鞣花酸在制備治療和預(yù)防人體真菌感染疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于鞣花酸用藥的純度為50-100%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于鞣花酸為單一成分入藥或與其它藥物組合入藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于鞣花酸入藥的臨床人日使用量為IU g-20g之間。
5.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的應(yīng)用，其特征在于鞣花酸藥物的給藥方式為內(nèi)服、外用、注射。
【文檔編號】A61P31/04GK103622955SQ201310660593
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】斯拉甫·艾白, 李治建, 古力娜·達(dá)吾提 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所