用于肝癌多模態(tài)影像和光熱治療的多功能納米探針及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種Au-ICG脂質(zhì)體多功能納米探針及其應(yīng)用。該納米探針由核和外殼構(gòu)成；所述的核為表面包覆聚多巴胺層并吸附有吲哚箐綠的納米金顆粒，所述的外殼為偶聯(lián)有乳糖酸、且螯合有Gd3+離子的DSPE-PEG脂質(zhì)體膜。本發(fā)明Au-ICG脂質(zhì)體多功能納米探針可用于肝癌的核磁成像（MRI），CT成像，近紅外熒光成像等多種影像模式，患者只需承受一種造影劑給藥，即可達(dá)到多種診斷效果；而且由于靈敏度的提高，可以降低造影劑用量，進(jìn)一步減輕毒副作用。在808nm近紅外光照射下，吸附的ICG分子能有效的將光能轉(zhuǎn)化為熱能，產(chǎn)生60～70℃的過高熱，進(jìn)而熱殺傷肝癌細(xì)胞；因此該多功能納米探針不僅可作為肝癌診斷的多模態(tài)造影劑，還可作為肝癌的光熱治療劑應(yīng)用。
【專利說明】用于肝癌多模態(tài)影像和光熱治療的多功能納米探針及應(yīng)用(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于肝癌的核磁、CT、和近紅外成像的多模態(tài)影像，以及光熱治療的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針及其應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增肝癌患者約60萬，其致死率達(dá)到第3位，僅僅稍次于肺癌和胃癌。我國每年新增的肝細(xì)胞癌發(fā)病人數(shù)約占全球55% ;肝癌防治的核心是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。其中早期診斷最為關(guān)鍵，即在患者出現(xiàn)臨床癥狀前或在癌癥發(fā)生浸潤前得以確診，從而得到及時治療，達(dá)到提高治愈率、降低死亡率的目的。然而由于肝癌發(fā)病具有高隱匿性，加上以組織、器官的器質(zhì)改變?yōu)榛A(chǔ)的傳統(tǒng)影像學(xué)的局限性，目前還難以準(zhǔn)確進(jìn)行肝癌的早期診斷。分子影像學(xué)技術(shù)可作為早期診斷方法，它是在臨床癥狀還未出現(xiàn)時就檢測到腫瘤的早期生物學(xué)特性。
[0003]造影劑廣泛用于非侵入成像，特別是用于腫瘤診斷；目前臨床上廣泛使用的非侵入式成像手段包括:核磁共振成像(MRI)，計算機(jī)體層攝影術(shù)(CT)，超聲成像，近紅外成像等。提高上述成像技術(shù)的靈敏度和特異性，實現(xiàn)在細(xì)胞或者分子水平上的診斷成像，是實現(xiàn)肝癌早期診斷的核心和關(guān)鍵。目前各類輔助造影增強(qiáng)劑已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于臨床，來增加上述成像技術(shù)的敏感性和特異性；如:基于Gd3+的金屬絡(luò)合物已被成功用于核磁成像(MRI )，但其注射后可能導(dǎo)致組織滲透壓上升、組織水腫等毒副作用。但目前臨床上使用的大部分造影劑，其靈敏度均有待于進(jìn)一步提高；低靈敏度將導(dǎo)致高劑量注射，增加毒副作用。同時，這些臨床使用的造影劑只局限于一種特定的成像技術(shù)，而不能實現(xiàn)多模態(tài)，多角度成像；而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通常 需要綜合不同影像學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行疾病的診斷；基于這種情況，患者可能需要多次承受不同的造影劑注射給藥，方可達(dá)到最終確診，這將增加患者所承受的造影劑毒副作用，可能導(dǎo)致患者健康的損壞，并會加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，迫切需要開發(fā)一種高靈敏度的多模態(tài)分子影像造影劑，以提高診斷的靈敏度、特異性，并期望能夠?qū)崿F(xiàn)多種臨床影像的同時獲取。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種適用于肝癌的核磁成像(MRI)，CT成像，近紅外熒光成像以及靶向光熱治療的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針，由核和外殼組成；所述的核為表面包覆聚多巴胺(polydopamine, PDA)層并吸附有吲哚箐綠(Indocyanine Green, ICG)的納米金顆粒，所述的外殼為偶聯(lián)有乳糖酸(Lactobionic acid, LA)、且螯合有Gd3+離子的DSPE-PEG (聚
乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)脂質(zhì)體膜。
[0007]本發(fā)明在金納米顆粒表面形成一層聚多巴胺(PDA)，其聚多巴胺表面帶有大量的-NH2根離子在酸性條件下帶正電，而吲哚箐綠(ICG)為一種帶負(fù)電的近紅外熒光分子，可通過靜電力的作用吸附在包被有聚多巴胺(PDA)的金納米顆粒表面；從而有效提高ICG的生物分散性，降低因ICG聚集而導(dǎo)致其熒光猝滅及水相不穩(wěn)定性。上述構(gòu)建的Au-PDA-1CG納米顆粒可利用808nm近紅外光激發(fā)，用于近紅外熒光成像；且々11納米顆粒具有分子量大(高于醫(yī)用碘海醇)、X_射線吸收能力強(qiáng)(高于醫(yī)用碘海醇)，血液清除緩慢(低于醫(yī)用碘海醇)，因此可有效提高CT的空間分辨率、降低X-射線輻射劑量以及延長CT顯像時間；在808nm近紅外光照射下，吸附的ICG分子能有效的將光能轉(zhuǎn)化為熱能，產(chǎn)生60~70°C的過高熱，進(jìn)而可以用于熱殺傷肝癌細(xì)胞。
[0008]為提高Au-PDA-1CG納米顆粒的體內(nèi)循環(huán)時間，降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(Reticuloendothelial system)的吞卩遼作用，本發(fā)明在Au_PDA_ICG表面包被一層多功能DSPE-PEG (聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)脂質(zhì)體膜。DSPE-PEG已被FDA認(rèn)證，可用脂質(zhì)體藥物制劑等醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用，并可有效提高藥物體循環(huán)時間。本發(fā)明為提高造影劑的肝癌特異性識別，彌補(bǔ)CT成像對軟組織定性診斷困難等問題，利用靶向肝癌細(xì)胞表面高
表達(dá)的脫唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor)的配體-半乳糖殘基偶聯(lián)
DSPE-PEG，并與螯合Gd3+的DSPE-PEG-D0TA以等比例混合，制成多功能脂質(zhì)體膜。其膜表面含有大量Gd3+與水分子充分接觸，可提高M(jìn)RI的靈敏性及T1加權(quán)成像功能。因此本發(fā)明的脂質(zhì)體顆粒外殼除了具有對肝癌細(xì)胞MRI成像功能，還具有特異靶向肝癌細(xì)胞能力。
[0009]因此，本發(fā)明構(gòu)建的Au-1CG-脂質(zhì)體多功能納米顆粒同時具備對肝癌的核磁、CT和近紅外成像的多模態(tài)影像的功能，可提高CT空間對比度，增加MRI的T1加權(quán)成像信號強(qiáng)度，并且兼有對肝癌的特異靶向熱療功能。
[0010]優(yōu)選的，所述Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針直徑為5~50nm。
[0011]具體的，所述Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針可由如下方法制備得到:(1)將金納米顆粒分散于多巴胺溶液中，調(diào)節(jié)PH8.5，攪拌4~6h后，7000~8000rpm離心并洗滌1~2次，得到表面包覆聚多巴胺層的金納米顆粒，再吸附吲哚箐綠，得到Au-PDA-1CG納米懸液；所述納米金顆粒可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行制備，具體如下:將氯金酸懸液加熱至150°C，沸騰5min后加入檸檬酸三鈉溶液，并伴隨強(qiáng)烈攪拌，并持續(xù)加熱20min后，停止加熱，攪拌至室溫，形成金納米顆粒懸液，在12000rpm離心15min后，收集得到金納米顆粒，其直徑約為10 ~16nm ；
[0012](2 )將DSPE-PEG-NH2 (聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)與乳糖酸(Lactobionic acid, LA)進(jìn)行酰胺偶聯(lián)反應(yīng)，得到DSPE-PEG-LA (二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-半乳糖殘基);將DSPE-PEG-NH2和D0TA-NHS (1，4，7，10-四乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺)進(jìn)行酰胺偶聯(lián)反應(yīng)，并耦合Gd3+離子，得到DSPE-PEG-Gd3+D°TA (二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-1，4，7，10-四乙酸釓)；再將制得的DSPE-PEG-Gd3+D°TA、DSPE-PEG-LA和氫化大豆磷脂、膽固醇混合，制得到單層脂質(zhì)體膜；
[0013]具體過程如下:
[0014] DSPE-PEG-NH2 與 EDC 室溫反應(yīng) 30min，加入 NHS，后加入 LA，4°C 反應(yīng) 12h，用 lOOKDa的超濾管離心后，獲得DSPE-PEG-LA ；DSPE-PEG-NH2與D0TA-NHS在DMS0中，室溫反應(yīng)lh，轉(zhuǎn)移到4°C反應(yīng)4~6h，后用100000的超濾管離心后獲得DSPE-PEG-D0TA，之后在DMS0溶液中加入GdCl3粉末，強(qiáng)烈震蕩ia后，后用lOOKDa超濾管離心，獲得DSPE-PEG_Gd3+D°TA ;將DSPE-PEG-Gd3+D°TA、DSPE-PEG-LA和氫化大豆磷脂、膽固醇按一定比例混合，之后利用燒瓶旋轉(zhuǎn)蒸干，即可得單層脂質(zhì)體膜；
[0015](3)以步驟(1)制備的Au-PDA-1CG納米懸液水化步驟(2)所得單層脂質(zhì)體膜，劇烈攪拌后離心，即得所述Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針。
[0016]優(yōu)選的，步驟(2)中DSPE-PEG-Gd3+D°TA、DSPE-PEG-LA和氫化大豆磷脂、膽固醇的混合摩爾比為:3~7:3~7:60~75:30~50，更為優(yōu)選的摩爾用量之比為3:3:75:50。
[0017]優(yōu)選的，步驟(1)得到的表面包覆聚多巴胺層的金納米顆粒懸浮于超純水中，調(diào)節(jié)pH為5.5~6.5后，加入ICG至ICG濃度為20~30 μ g/mL,避光室溫震蕩2~3h后，靜止2~3h，離心、洗滌I~2次，去除未吸附的ICG分子，所得顆粒懸浮于超純水中制成Au-PDA-1CG納米懸液。
[0018]本發(fā)明還涉及所述的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針在制備用于肝癌多模態(tài)成像的造影劑中的應(yīng)用。所述造影劑可同時用于MRI磁共振成像，CT成像或近紅外熒光成像等。
[0019]本發(fā)明還涉及所述的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針在制備肝癌靶向熱療的藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明以多巴胺包裹金納米顆粒并吸附ICG形成的Au-1CG為核心，以獨特的設(shè)計方案，在Au-1CG表面包被一層具有生物相容性的多功能脂質(zhì)體膜，并利用多功能脂質(zhì)體膜表面的半乳糖殘基靶向肝癌細(xì)胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)，構(gòu)建得到一種具有多模態(tài)成像及靶向光熱治療的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針。優(yōu)選的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針具有5~50nm的直徑，其等同于存在于人和動物機(jī)體中的一些蛋白和生物有機(jī)化合物的尺寸，由此便于造影劑在關(guān)注區(qū)域的輸送和吸收。
[0021]本發(fā)明所構(gòu)建的Au-1CG脂質(zhì)體多功`能納米探針可以不同的劑量給藥，這取決于成像的肝癌細(xì)胞，組織及肝癌患者的臨床狀況。本發(fā)明的造影劑和光熱藥物的給藥劑量和濃度，可由臨床醫(yī)生例行確定。用藥方案取決于各種因素，例如成像的肝癌細(xì)胞，組織或腫瘤是分散還是局部，患者的健康程度，年齡等。通過參照其他造影劑的用藥方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明藥物的最佳有效劑量及濃度。
[0022]本發(fā)明的所構(gòu)建的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針可通過任何已知的遞送方法方式給藥:全身遞送(靜脈注射)，動脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，胃腸外，肺腔內(nèi)，局部、或局部給藥的區(qū)域遞送形式。如動脈內(nèi)注射能夠被用來“局域效果”成像及特定區(qū)域靶向區(qū)域熱療。
[0023]本發(fā)明Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針可用于肝癌的核磁成像(MRI)，CT成像，近紅外突光成像(Near-1nfrared (NIR) fluorescence imaging)等多種影像模式，只需承受一種造影劑給藥，即可達(dá)到多種診斷效果；而且由于靈敏度的提高，可以降低造影劑用量，進(jìn)一步減輕毒副作用。在808nm近紅外光照射下，吸附的ICG分子能有效的將光能轉(zhuǎn)化為熱能，產(chǎn)生60~70°C的過高熱，進(jìn)而熱殺傷肝癌細(xì)胞；因此該多功能納米探針不僅可作為肝癌診斷的多模態(tài)造影劑，還可作為肝癌的光熱治療劑應(yīng)用。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為金納米顆粒及Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的透射電鏡圖像及晶體衍射圖像。A為金納米顆粒的透射電鏡圖像；B為單個金納米顆粒的透射電鏡圖像(5nm標(biāo)尺)。白色箭頭表不金納米顆粒表面的晶格；C表不Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針透射電鏡圖像；D表不Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的晶體衍射圖。
[0025]圖2為Au-PDA-1CG，Au-PDA+ICG, ICG的紫外可見近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光
譜。A表示(一)Au-PDA-1CG，(-----)Au_PDA+ICG，(......) ICG的紫外可見近紅外吸收光
譜曲線圖表示(_ -) Au-PDA-1CG, (...Δ...) Au-PDA的熒光發(fā)射光譜曲線圖；
[0026]圖3為Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的Tl磁共振加權(quán)成像圖和Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的CT成像圖。A表示Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的MRI圖像；B表示Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的CT圖像；
[0027]圖4為Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的光熱轉(zhuǎn)化曲線。(一)表示水溶液的升溫曲線，(.......)表示Au-1 CG脂質(zhì)體多功能納米探針的升溫曲線。
[0028]圖5為共聚焦檢測Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針及ICG分子的肝癌細(xì)胞攝取實驗。A:為空白對照；B:為ICG被肝癌細(xì)胞攝取后的共聚焦熒光圖片；C:為Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針被肝癌細(xì)胞攝取后的共聚焦滅光圖片；。
[0029]圖6為Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針對肝癌細(xì)胞的光熱殺傷。
[0030]圖7為Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
(五)【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0032]實施例1:
[0033]將Iml濃度為IM的氯金酸懸浮于49ml的Mill1-Q超純水(美國Millipore公司)中，將混勻的50ml氯金酸懸液盛放到100ml體系的潔凈三口燒瓶中，在油浴及回流裝置下，加熱到150°C至剛剛沸騰，待沸騰5min后，向其中快速加入6ml濃度為0.015g/ml的檸檬酸三鈉溶液，并伴隨強(qiáng)烈攪拌，并持續(xù)加熱20min后，停止加熱，攪拌至室溫，形成金納米顆粒懸液，其金納米顆粒直徑約為10~16nm,并在12000rpm離心15min后，收集金納米顆粒備用。
[0034]實施例2:
[0035]將上述沉淀懸于新配制的含2mg/ml多巴胺(DA, Sigma公司)的IOmM tris-HCl溶液中，pH調(diào)節(jié)為8.5，并溫和攪拌約6h，在7000~8000rpm下離心15min及洗滌2次，收集包被后的Au-PDA納米顆粒，懸浮于Mi 11 1-Q超純水中，得到Au-PDA懸液。此時的多巴胺經(jīng)氧化及光照自聚合形成PDA聚多巴胺層，用于修飾Au納米顆粒表面，并暴露大量氨基于Au納米顆粒表面，易于后期修飾。
[0036]實施例3:
[0037]吸取20 μ I含12.5mg/ml ICG (吲哚箐綠，日本同仁化學(xué)研究所(上海))的DMSO溶液，并懸于400 μ I的Mill1-Q超純水中，然后取100 μ I前述溶液，加入到實施例2制備的3ml的Au-PDA懸液中，調(diào)節(jié)pH為6.5后，避光室溫震蕩2h后，靜止2h，7000~8000rpm離心lOmin，洗滌2次，去除未吸附的ICG分子，所得納米顆粒懸浮于Mill1-Q超純水中，配制成3ml的0.02M的Au-PDA-1CG納米懸液備用，上述Au-PDA-1CG納米懸液已經(jīng)具備了 CT成像、近紅外熒光成像及光熱轉(zhuǎn)化功能。
[0038]實施例4:[0039]利用電子天平稱取4.2mg的DSPE_PEG_NH2 (聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺,Nanocs公司)白色粉末和4.2mg的D0TA-NHS白色粉末(禮離子螯合劑，Macrocyclic公司)白色粉末，溶解在盛有1ml DMS0 (二甲基亞砜)的1.5ml的離心管中，室溫震蕩反應(yīng)lh后，轉(zhuǎn)移到4°C冰箱，震蕩反應(yīng)5h，后用lOOKDa的超濾管過濾，收集DSPE-PEG-DOTA-NHS，之后向其中加入60mg的GdCl3 (三氯化釓，百靈威試劑公司)白色粉末，強(qiáng)烈震蕩12h后，先2000rpm離心，去除沉淀后，再利用lOOKDa的超濾管過濾，收集DSPE-PEG_Gd3+D°TA并溶于1ml的Mill1-Q超純水備用。
[0040]另稱取4.2mg的DSPE_PEG_NH2粉末和18mg EDC (碳化二亞胺，，Sigma公司)粉末溶于盛有1ml Mill1-Q超純水的1.5ml的離心管中，并在30°C下活化30min，再向其加入9mg的NHS (N-N-羥基琥珀酰亞胺，Sigma公司)粉末以及42mg的乳糖酸(LA，百靈威試劑公司)粉末，在4°C震蕩反應(yīng)12h，經(jīng)lOOKDa的超濾管過濾，收集DSPE-PEG-LA，并溶于1ml的Mill1-Q超純水備用。
[0041 ] 將以上獲得的0.5ml的DSPE-PEG-GcTd°ta和0.5ml的DSPE-PEG-LA的超純水溶液盛放到50ml體系的燒瓶中混合并真空干燥，以DSPE-PEG-Gd3+D°TA@DSPE-PEG-LA:氫化大豆磷脂(HSPC，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司):膽固醇(cholesterol，百靈威試劑公司)摩爾比例3:75:50混合，并向其中加入10ml的氯仿甲醛混合溶液中(氯仿:甲醛=1:3，v/v)，之后利用50ml體系的燒瓶在50~70°C下旋轉(zhuǎn)蒸干。上述形成的單層脂質(zhì)體膜已經(jīng)具備了MRI成像及靶向肝癌細(xì)胞的功能。
[0042]實施例5:
[0043]取10ml的0.02M的Au_PDA_ICG水溶液，在50°C下，水化上述旋轉(zhuǎn)蒸干的單層脂質(zhì)體膜，并強(qiáng)烈攪拌2h，在6000rpm離心15min后，獲得單層膜包被的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針，并配置成0.02M的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針。所述的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的粒子直徑約15~20nm，并具備了 MR1、CT、近紅外成像，光熱轉(zhuǎn)化及靶向肝癌細(xì)胞的功能。
[0044]使用透射電子顯微鏡(TEM)、紫外一可見分光光度計(UV-Vis-NIR)、MR1-CT成像，光熱轉(zhuǎn)化曲線，共聚焦顯微鏡，MRI核磁成像儀，micro-CT成像儀等方法表征上述制備的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針，具體測試結(jié)果如下:
[0045](1)透射電子顯微鏡(TEM)
[0046]透射電鏡圖像表示金納米顆粒及Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的形貌、納米尺寸及晶格。參照圖1，A表示在200nm的標(biāo)尺下，檢測納金納米顆粒的分布及形貌，其說明檸檬酸三鈉法合成的金納米顆粒尺寸均一，形貌一致。B圖表示單個金納米顆粒載5nm標(biāo)尺下的透射電鏡圖像，其晶格明顯，表明合成的金納米粒子具有較高的結(jié)晶度及晶體結(jié)構(gòu)。C為Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的形貌，其外緣的具有較低襯度的膜層，為多巴胺及包被的單層脂質(zhì)膜。D為Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的晶體衍射圖。其衍射圈清晰，說明Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針具有良好的結(jié)晶度。
[0047](2)紫外-可見-近紅外分光光度計(UV-Vis-NIR)，熒光分光光度計
[0048]紫外-可見-近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，表示Au-PDA-1CG合成的特征光譜。參照圖2，A (—)Au-PDA-1CG表示Au-PDA吸附ICG離心后的吸收光譜，(——)Au-PDA+ICG表示Au-PDA吸附ICG未離心的吸收光譜，(....)ICG表示ICG分散在超純水溶液中的吸收光譜；其中Au-PDA-1CG在518nm及780nm分別具有Au-PDA的特征吸收峰及ICG的特征吸收峰，表明ICG已經(jīng)成功的吸附于Au-PDA表面。B表示( -) Au-PDA,(..Δ...)Au-PDA-1CG的熒光發(fā)射光譜。Au-PDA-1CG在633nm激發(fā)下，具有ICG的特征熒光發(fā)射峰，表不ICG已成功吸附于Au-PDA表面。
[0049](3) MRI磁共振成像和micro-CT成像
[0050]MRI磁共振成像和micro-CT圖像,顯示Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針具有磁共振成像和CT成像功能，參照圖3，A圖為不同濃度Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針Tl磁共振圖像，隨著編號 7 ~1，其濃度分別為 0.0003125，0.000625,0.00125,0.0025，0.005，0.01，
0.02M，其Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的Tl信號強(qiáng)度隨濃度的增加而增強(qiáng)。B圖為不同濃度的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的CT成像圖，左側(cè)為0.000625M，右側(cè)為0.00125M，表明Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針具有CT成像功能。
[0051](4)熱轉(zhuǎn)化曲線
[0052]光熱曲線表示Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)換成熱能。參照圖4,所示在相同的功率2W/cm2180s的激光照射下，5 μ g/ml Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針溶液相對于水，有明顯的升溫性能，并且Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針可在較短的時間內(nèi)由
26.9°C激增到62.5°C，并未出現(xiàn)平臺，說明還可繼續(xù)光熱轉(zhuǎn)化高溫；而水溶液在相同的功率及時間照射下，溫度從26.9°C升溫到31.2°C。因此，表明Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針相對于水，高出31.3°C，并遠(yuǎn)高于人體正常體溫，因此可以用于肝癌的熱殺傷。
[0053](5)共聚焦成像實驗
[0054]共聚焦成像實驗，表明肝癌細(xì)胞可有效攝取Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針。參考圖5，圖A為空白對照；圖B表示，5 μ g/ml ICG與肝癌細(xì)胞共撫育5個小時后的熒光圖像；圖C表示，5 μ g/ml Au-1CG脂質(zhì)`體多功能納米探針與肝癌細(xì)胞共撫育5個小時后的熒光圖像；表明肝癌細(xì)胞可有效攝取Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針。
[0055](6)細(xì)胞殺傷能力；
[0056]利用不同濃度Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針，如0.2,0.4,0.6,0.8 μ g/ml與肝癌細(xì)胞撫育，并在808nm近紅外激光器照射5min后，利用細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)(日本同仁化學(xué)研究所(上海))檢測。參考圖6，隨著Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的濃度增加，其細(xì)胞的存活率明顯下降，說明經(jīng)808nm近紅外激光器照射后的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針可有效進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生過高熱，對肝癌的進(jìn)行熱殺傷。
[0057](7)細(xì)胞毒性；
[0058]利用不同濃度Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針如0.2,0.4,0.6,0.8mM與肝癌細(xì)胞撫育24h，利用細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)檢測。參考圖7，Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針與肝癌細(xì)胞撫育24h，并未對細(xì)胞造成損傷或凋亡，說明Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針不具有細(xì)胞毒性，也說明Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針的殺傷肝癌細(xì)胞主要通過光熱轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生過高熱，進(jìn)而殺傷肝癌細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.一種Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針，由核和外殼構(gòu)成，其特征在于:所述的核為表面包覆聚多巴胺層并吸附有吲哚箐綠的納米金顆粒，所述的外殼為偶聯(lián)有乳糖酸、且螯合有Gd3+離子的DSPE-PEG脂質(zhì)體膜。
2.如權(quán)利要求1所述的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針，其特征在于所述Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針由如下方法制備得到:(1)將金納米顆粒分散于多巴胺溶液中，調(diào)節(jié)PH8.5，攪拌4~6h后，7000~8000rpm離心并洗滌1~2次，得到表面包覆PDA的金納米顆粒，再吸附ICG，得到Au-PDA-1CG納米懸液；(2)將DSPE-PEG-NH2與乳糖酸進(jìn)行酰胺偶聯(lián)反應(yīng)，得到DSPE-PEG-LA;將DSPE_PEG_NH2和DOTA-NHS進(jìn)行酰胺偶聯(lián)反應(yīng)，并耦合Gd3+離子，得到DSPE-PEG-Gd3+D°TA ;將前述得到的DSPE-PEG-Gd3+D°TA、DSPE-PEG-LA和氫化大豆磷脂、膽固醇混合，制得單層脂質(zhì)體膜；(3)以步驟(1)制備的Au-PDA-1CG納米懸液水化步驟(2)所得單層脂質(zhì)體膜，劇烈攪拌后離心，即得所述Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針。
3.如權(quán)利要求1或2所述的Au-1CG脂質(zhì)體納米探針，其特征在于所述Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針直徑為5~50nm。
4.如權(quán)利要求2所述的Au-1CG脂質(zhì)體納米探針，其特征在于步驟(1)得到的表面包覆聚多巴胺層的金納米顆粒懸浮于超純水中，調(diào)節(jié)pH為5.5~6.5后，加入ICG至ICG濃度為20~30 μ g/mL,避光室溫震蕩2~3h后，靜止2~3h，離心、洗滌1~2次，去除未吸附的ICG分子，所得顆粒懸浮于超純水中制成Au-PDA-1CG納米懸液。
5.如權(quán)利要求2所述的Au-1CG脂質(zhì)體納米探針，其特征在于步驟(2)中DSPE-PEG-Gd3+D0T\ DS PE-PEG-LA和氫化大豆磷脂、膽固醇的混合摩爾比為:3~7:3~7:60 ~75:30 ~50。
6.如權(quán)利要求1所述的Au-1CG脂質(zhì)體納米探針在制備用于肝癌多模態(tài)成像的造影劑中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所示的應(yīng)用，其特征在于所述造影劑用于MRI磁共振成像，CT成像或近紅外熒光成像。
8.如權(quán)利要求1所述的Au-1CG脂質(zhì)體多功能納米探針在制備肝癌靶向熱療的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K49/12GK103721271SQ201310695697
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】劉景豐, 劉小龍, 黃愛民, 張達(dá) 申請人:福州市傳染病醫(yī)院