重組的人乳頭瘤病毒18型l1蛋白及其用途
【專利摘要】本發(fā)明重組的人乳頭瘤病毒18型L1蛋白及其用途，提供一種新的編碼重組的HPV18?L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含該基因片段的載體、包括載體的宿主細(xì)胞，以及由該基因片段翻譯表達(dá)的HPV18?L1蛋白五聚體和由該五聚體組成的抗HPV18型感染的尖銳濕疣疫苗。
【專利說明】重組的人乳頭瘤病毒18型LI蛋白及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人類乳頭狀瘤病毒感染的預(yù)防和/或治療。更具體而言，本發(fā)明涉及一種重組的人乳頭瘤病毒18型LI蛋白，及由其組成的五聚體，含該蛋白的疫苗及其在預(yù)防HPV18型病毒感染，特別是在預(yù)防HPV18型病毒感染引起的宮頸癌疾病中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]人類乳頭狀瘤病毒(Human Papillomavirus,簡稱HPV)是通過密切接觸而傳播的DNA病毒。在人體組織中，HPV主要感染皮膚和黏膜組織。HPV可分為高危險(xiǎn)型和低危險(xiǎn)型兩種，長期持續(xù)感染高危型可以致癌，如宮頸癌，危害生命。低危型HPV可導(dǎo)致生殖器病變，如尖銳濕疣，影響生活質(zhì)量。宮頸癌是女性第二大惡性腫瘤，每年全球的發(fā)病大概在54萬(2013年)，約有24萬例死亡，幸運(yùn)的是，宮頸癌是唯一研制出疫苗的癌癥。2006年6月8日，美國食品與藥品管理局(FDA)正式批準(zhǔn)美國Merck公司(即默沙東公司)生產(chǎn)的Gardasil HPV預(yù)防性疫苗上市；它是由釀酒酵母表達(dá)并純化的HPV16/18/6/11 LI VLP四價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗，被批準(zhǔn)用于預(yù)防6~26歲女孩和婦女HPV16、18、6、11型感染所引起的宮頸癌、癌前病變和生殖器疣，這是FDA通過的世界上第一個(gè)腫瘤疫苗(Villa，Costaetal.2005，Villa, Ault et al.2006，Bryan 2007，Olssonj Villa et al.2007，Goldstoneand Vuocolo 2012)。隨后英國葛蘭素史克(GSK)公司生產(chǎn)的商品名為Cervarix的HPV預(yù)防性疫苗也成功上市，它是由來源于昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的HPV16/18 LI VLP 二價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗。但這兩種預(yù)防性疫苗價(jià)格昂貴，極大限制了在發(fā)展中國家和落后地區(qū)的使用，因此開發(fā)一種低成本的高效價(jià)HPV疫苗就顯得尤為重要(Jansen and Shaw 2004, Buonaguro,Tornesello et al.2009, Campo and Roden 2010, Frazer, Leggatt et al.2011, Hariri,Dunne et al.2011, Lehtinen and Dillner 2013, Shaw 2013)。
[0003]HPV屬乳頭多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳頭瘤病毒屬，為無包膜DNA病毒。病毒基因組為雙鏈閉環(huán)DNA，大小約為7.2~8kb，具有8個(gè)開放框?；蚪M按功能的不同可以分為三個(gè)區(qū)域:早期區(qū)(E)，約4.5kb，編碼E1、E2、E4~E7共6個(gè)與病毒復(fù)制，轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)化有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白；晚期區(qū)(L)，約2.5kb，編碼主要衣殼蛋白LI和次要衣殼蛋白L2;長調(diào)控區(qū)(LCR)，位于L區(qū)末端與E區(qū)起始端之間，長約800~900bp，不編碼任何蛋白，含DNA復(fù)制、表達(dá)調(diào)控元件。
[0004]HPV病毒顆粒直徑為55~60nm，核衣殼呈20面體對稱，由72個(gè)主要衣殼蛋白LI的五聚體及次要衣殼蛋白L2組成。大量研究證實(shí)，HPV LI蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HPV LI蛋白無需L2蛋白輔助即可形成在形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒顆粒相似的類病毒顆粒(Virus-LlkeParticle，VLP)。重組HPV Ll-VLP疫苗已經(jīng)成功上市并用于預(yù)防HPV感染及由此導(dǎo)致的宮頸癌、尖銳濕疣等疾病，并充分證明了 Ll-VLP具有與野生同型病毒相同的抗原性和免疫原性。從組成VLP的三級結(jié)構(gòu)看，其抗原決定簇均分布于組成VLP 的基本結(jié)構(gòu)單兀五聚體的表面(Xiaojiang S.Chen, Robert L.Garcea, Ilya Goldberg,Gregory Casini and Stephen C.(2000).HarrisonStructure of Small Virus-likeParticles Assembled from the LI Protein of Human Papillomavirus 16.Molecular Cell,Vol.5, 557 - 567.Brooke Bishop, JhimliDasgupta, Michael Klein, Robert L.Garcea,Neil D.Christensen, Rui Zhaoand Xiaojiang S.Chen.(2007).Crystal Structures ofFour Types of Human Papillomavirus LI Capsid Proteins.THE JOURNAL OF B1LOGICALCHEMISTRY VOL.282，N0.43，pp.31803 - 31811)，說明 HPV Ll-VLP 的抗原性和免疫原性來源于或取決于LI組成的五聚體。因此，重組LI蛋白五聚體與VLP —樣具備完整的抗原表位，也可以作為抗原用來制備疫苗。
[0005]HPV疫苗研制的關(guān)鍵是能夠大量高效制備HPV LI蛋白。目前較為常用的表達(dá)系統(tǒng)可以分為真核表達(dá)系統(tǒng)及原核表達(dá)系統(tǒng)。常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有痘病毒表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)。在真核表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的HPV LI蛋白天然構(gòu)象破壞少，能自發(fā)的形成VLP，往往只需進(jìn)行簡單的純化即可獲得VLP。但是由于真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量低，培養(yǎng)成本高，給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了極大困難。原核表達(dá)系統(tǒng)中利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPVLl蛋白已有報(bào)道。但是由于大腸桿菌所表達(dá)的HPV LI蛋白大多失去其天然構(gòu)象，不能產(chǎn)生針對HPV的保護(hù)抗體。或者上述蛋白雖然通過包含體純化，復(fù)性等步驟也可得到HPV VLP，但是在復(fù)性過程中蛋白損失量大，得率低，難以在大規(guī)模生產(chǎn)上應(yīng)用。HPVLI全長序列蛋白雖然也可以在大腸桿菌中以正確構(gòu)象可溶性地表達(dá)，溶解于菌體的裂解上清中，但是表達(dá)量較低，而且上清中雜蛋白種類多且量大，要從中純化出目的蛋白難度相當(dāng)大，依然無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0006]因此，本領(lǐng)域仍然需要成本低、純度高、產(chǎn)量高、效果好的HPV LI蛋白生產(chǎn)技術(shù)和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)預(yù)防宮頸癌疫苗的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種新的HPV18 LI蛋白，及由其組成的五聚體蛋白顆粒及含該五聚體蛋白顆粒的疫苗。
[0008]本發(fā)明涉及提供一種新的編碼重組的HPV18 LI蛋白的多核苷酸基因片段、包含該基因片段的載體、包括載體的宿主細(xì)胞，以及由該基因片段翻譯表達(dá)的HPV18 LI蛋白五聚體和由該五聚體組成的抗HPV18型感染的疫苗。
[0009]本發(fā)明公開了一種重組的HPV18 LI蛋白的氨基酸序列，所述蛋白的氨基酸序列在N端8-15個(gè)氨基酸全部或任意部分被2-10個(gè)氨基酸序列所取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一組合方式；H4結(jié)構(gòu)域被2-10個(gè)氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一組合方式。
[0010]本發(fā)明涉及的HPV18 LI蛋白，進(jìn)一步是其氨基酸序列C端截短O個(gè)、I個(gè)、2個(gè)至21個(gè)氨基酸。
[0011]本發(fā)明所述的HPV18 LI蛋白，優(yōu)選的被其氨基酸序列N端前8-15個(gè)氨基酸被GSGGG, ASASG或GSGAG取代，H4結(jié)構(gòu)域優(yōu)選的被GGGSG或GAGAS取代。
[0012]如實(shí)施例所述的HPV18 LI蛋白，優(yōu)選其氨基酸序列在N端前8、10、12或15個(gè)氨基酸優(yōu)選被GSGGG或ASASG氨基酸序列取代。C端優(yōu)選截短10-21個(gè)氨基酸，更優(yōu)選截短10個(gè)、21個(gè)氨基酸。
[0013] 如實(shí)施例所述的HPV18 LI蛋白，其序列包含序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:10。
[0014]本發(fā)明公開一種編碼蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明公開一種包含多核苷酸序列的基因的表達(dá)載體。本發(fā)明公開一種包含表達(dá)載體的細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明公開一種HPV18 LI蛋白五聚體，該蛋白五聚體由五個(gè)HPV18 LI蛋白單體形成。
[0016]本發(fā)明公開一種HPV疫苗，該疫苗包括HPV18 LI蛋白五聚體和藥用佐劑。
[0017]本發(fā)明公開一種HPV疫苗的制備方法，該方法為:
A.克隆或合成重組HPV18LI蛋白的基因片段；
B.在大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組的HPV18LI蛋白；
C.純化由HPV18LI蛋白組成的五聚體；
D.HPV18 LI蛋白五聚體加入藥用佐劑制成疫苗。
[0018]上述方法中步驟C的純化優(yōu)選利用親和層析色譜純化HPV18 LI融合標(biāo)簽蛋白。
[0019]本發(fā)明公開HPV疫苗在制備預(yù)防和/或治療包括HPV18感染及導(dǎo)致疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明第一方面提供一種編碼重組HPV18 LI蛋白的多核苷酸基因片段。
[0021]本發(fā)明第二方面提供了一種構(gòu)建的表達(dá)載體，其包含本發(fā)明第一方面的編碼重組HPV18 LI蛋白的多核苷酸基因片段。所述載體適合驅(qū)動(dòng)異源DNA在細(xì)菌、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中翻譯表達(dá)HPV18 LI蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體優(yōu)選pGEX-6p-l或PGEX-4T-2。
[0022]本發(fā)明的第三方面提供了一種構(gòu)建的工程菌細(xì)胞，該細(xì)胞包含本發(fā)明第一方面的多核苷酸基因片段，或第二方面的表達(dá)載體。所述的工程菌宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌，可以是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，或者是昆蟲細(xì)胞。
[0023]本發(fā)明第四方面提供了一種藥用組合物，其包含本發(fā)明第一方面的多核苷酸基因片段，或第二方面構(gòu)建的表達(dá)載體或第三方面的工程菌細(xì)胞以及表達(dá)產(chǎn)物HPV18 LI五聚體蛋白。
[0024]本發(fā)明同時(shí)提供了制備上述編碼重組HPV18 LI蛋白的多核苷酸序列、表達(dá)載體構(gòu)建、工程菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化和藥用組合物的方法。
[0025]本發(fā)明獲得HPV18 LI蛋白的方法，其包括在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組的HPV18 LI蛋白及其五聚體，然后將含有該重組蛋白的裂解上清進(jìn)行純化處理。具體獲得HPV18 LI蛋白五聚體的方法包括:
1.從臨床樣本中克隆或人工合成編碼HPV18 LI全長蛋白基因或截短蛋白基因的片段。
[0026]2.在大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組的LI蛋白。
[0027]3.純化HPV18 LI重組蛋白。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得重組HPV18 LI蛋白的優(yōu)選方法包括:
1.N端1-15個(gè)氨基酸全部或任意部分被GSGGG取代、H4結(jié)構(gòu)域被GGGSG序列取代的HPV18 LI重組蛋白。
[0029]2.在大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組的LI蛋白。
[0030]3.純化HPV18 LI重組蛋白。
[0031 ] 在優(yōu)選的實(shí)施例1方案中N端截短8個(gè)氨基酸被GSGGG取代，H4結(jié)構(gòu)域被GGGSG序列取代，同時(shí)C端截短21個(gè)氨基酸，SEQ ID NO:2。
[0032]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例2方案中N端截短8個(gè)氨基酸被GSGGG取代，H4結(jié)構(gòu)域被GGGSG序列取代，同時(shí)C端截短10個(gè)氨基酸，SEQ ID NO:4。
[0033]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例3方案中N端截短15個(gè)氨基酸被GSGAG取代，H4結(jié)構(gòu)域被GAGSG序列取代，同時(shí)C端截短10個(gè)氨基酸，SEQ ID NO:6。
[0034]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例4方案中N端截短15個(gè)氨基酸被ASASG取代，H4結(jié)構(gòu)域被GGGSG序列取代，同時(shí)C端截短21個(gè)氨基酸，SEQ ID NO:8。
[0035]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例5方案中N端截短8個(gè)氨基酸被GSGGG取代，H4結(jié)構(gòu)域被GGGSG序列取代，同時(shí)C端保留不截短，SEQ ID NO:10。
[0036]在對比的實(shí)施例6方案中N端前8個(gè)氨基酸被GSGGG取代，H4結(jié)構(gòu)域不取代，C端保留不截短。
[0037]本發(fā)明另提供了本發(fā)明藥用組合物在制備預(yù)防或治療HPV18型感染及導(dǎo)致疾病藥物中的應(yīng)用。
[0038]本發(fā)明還涉及一種預(yù)防宮頸癌或HPV感染的疫苗，其包含本發(fā)明重組的HPV18 LI
五聚體，或者由五聚體組成的多聚體，包括1、2、3、4、5......200個(gè)五聚體。優(yōu)選該疫苗還包含至少一種選自HPV18 LI五聚體，HPV18 LI五聚體HPV18 LI五聚體，HPV31 LI五聚體，HPV33 LI五聚體，HPV45 LI五聚體，HPV52 LI五聚體，HPV58 LI五聚體，以及由上述五聚體組成的多聚體。該疫苗通常還包含疫苗用賦形劑或載體。
[0039] 優(yōu)選地，所述疫苗每劑含有本發(fā)明重組的HPV18 LI蛋白的量為I μ g-200 μ g,優(yōu)選5 μ g-50 μ g。所述疫苗含有本發(fā)明重組的HPV18 LI與HPV6 LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，重組的HPV18 LI與HPVll LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，重組的HPV18 LI與HPV16LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，重組的HPV18 LI與HPV31 LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，重組的HPV18 LI與HPV33 LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，重組的HPV18 LI與HPV45LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，重組的HPV18 LI與HPV52 LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，重組的HPV18 LI與HPV58 LI按照0.5-2:1比例組成的疫苗，以及由重組的HPV18LI五聚體與上述各型HPV LI五聚體組成的二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)、五價(jià)、六價(jià)、七價(jià)疫苗或在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步組合形成的九價(jià)疫苗。
[0040]本發(fā)明還涉及一種制備用于預(yù)防宮頸癌或HPV感染疫苗的方法，其包含本發(fā)明重組的HPV18 LI五聚體，或者由五聚體組成的多聚體與任選的一種或多種選自HPV18，16，18，31，33，45，52，和58的HPV型別的五聚體及疫苗用載體或者賦形劑混合。
[0041]本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明重組的HPV18 LI五聚體，或者由五聚體組成的多聚體在制備用于預(yù)防宮頸癌或HPV18感染疫苗中的用途。
[0042]本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)”是指由大腸桿菌(菌株)與表達(dá)載體組成，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的，在此舉例但不限于:GI698，ER2566，BL21 (DE3)，B834 (DE3)，BLR (DE3)等。
[0043]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體”一詞指的是，可將某編碼蛋白的多核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。舉例來說，載體包括:質(zhì)粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等。
[0044]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疫苗用賦形劑或載體”是指選自一種或多種，包括但不限于:pH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，pH調(diào)節(jié)劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。舉例但不限于:TWeen-80。佐劑舉例但不限于氫氧化鋁，磷酸鋁、無定型羥基磷酸硫酸鋁，氟氏完全佐劑。離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑舉例但不限于氯化鈉。
[0045]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“色譜層析”包括但不限于:離子交換色譜、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析、親和層析法。
[0046]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“HPV18 LI H4結(jié)構(gòu)域”是指HPV18 LI DNA序列中“FGVPPPPTTSLVDT
RFVQSVAITC QKDAAPA”，在Genebank登錄號為ABP99791的LI序列中第466位氨基酸至497位，或其它HPV18 LI序列中與之對應(yīng)的氨基酸位置。
[0047]根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的重組HPV18 LI蛋白的方法中，緩沖液是指可在一定范圍內(nèi)維持PH值穩(wěn)定的溶液，包括但不限于，Tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。
[0048]根據(jù)本發(fā)明，所述原核宿主細(xì)胞破碎包括但不限于通過勻漿器破碎、均質(zhì)機(jī)破碎、超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理中的一項(xiàng)或者多項(xiàng)方法來實(shí)現(xiàn)；
根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的重組HPV18 LI蛋白的方法中，所用的鹽包括但不限于是中性鹽,特別是堿金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽,硫酸鹽,碳酸氫鹽,磷酸鹽或磷酸氫鹽,特別是NaC1、KC1、NH4C1、(NH4) 2S04中的一種或幾種。優(yōu)選NaCI。所用的還原劑包括但不限于DTT，2 一巰基乙醇。所用量包括但不限于lOmM-lOOmM。
[0049]根據(jù)本發(fā)明，所述的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于注射或鼻腔或口腔吸入或者陰道給藥，優(yōu)選注射劑。
[0050]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“價(jià)”是指組成疫苗的組分所包含的基因型的數(shù)量。舉例來說HPV16和18型抗原組成的疫苗稱為“二價(jià)”疫苗。
[0051]本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過對HPV18 LI蛋白N端、C端和H4區(qū)域的基因重組，再利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)即可獲得大量的重組GST-HPV18 LI五聚體融合蛋白，該GST-HPV18 LI五聚體蛋白經(jīng)親和層析純化后可得到高產(chǎn)率的HPV18 LI五聚體蛋白，純度至少85%以上。進(jìn)一步純化后的HPV18 LI五聚體蛋白可達(dá)到98%以上的純度并可誘導(dǎo)針對HPV18保護(hù)性抗體。本發(fā)明基于以上發(fā)明現(xiàn)已完成，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)預(yù)防宮頸癌的疫苗提供了一種新方法。
[0052]本發(fā)明中在N端增加GSGGG或GSGAG，并且與GST蛋白相融合，可大大提高LI蛋白的可溶性，以及提高酶切效率，降低純化成本，同時(shí)利用蛋白酶酶解方法切除GST蛋白，去除了外源雜質(zhì)的引入；用GSGGG或GAGAS取代H4結(jié)構(gòu)域，可以阻止LI五聚體蛋白進(jìn)一步聚合，從而得到均一、穩(wěn)定的五聚體蛋白，例如通過實(shí)施例12的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同氨基酸序列組成的蛋白產(chǎn)物穩(wěn)定性不同。其中序列H4結(jié)構(gòu)域經(jīng)過取代的蛋白產(chǎn)物與H4結(jié)構(gòu)域未經(jīng)取代的蛋白產(chǎn)物相比更穩(wěn)定；C端截?cái)喟被崮軌蛴行П苊釩端降解、減少由于蛋白降解而導(dǎo)致的產(chǎn)物不純，從而影響五聚體蛋白疫苗的穩(wěn)定性。
[0053]本發(fā)明序列對H4結(jié)構(gòu)域改造所得的HPV18 LI蛋白只能形成五聚體，而且此五聚體具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)高滴度的針對HPV18的中和抗體，預(yù)防HPV18對人體的感染，是一種良好的疫苗形式。此外，本發(fā)明中采用的重組HPV18 LI蛋白在保留全長HPV18LI蛋白的抗原性及五聚體顆粒組裝能力的同時(shí)，易于在真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，增加蛋白的溶解性、提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0054]在參考下列詳述和附圖后，本發(fā)明的這些和其它方面的有益效果將是顯然的。此處公開的所有參考文獻(xiàn)在此均完整引用作為參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1實(shí)施例制備的HPV18 LI五聚體透射電鏡觀察(100,000倍)結(jié)果；結(jié)果顯示，視野中可見直徑為13nm左右的五聚體，顆粒大小與理論大小相符，均勻一致。
[0056]圖2-A按照實(shí)施例1制備的五聚體的動(dòng)態(tài)光散射觀測結(jié)果，結(jié)果顯示五聚體的粒徑與粒度分布圖。
[0057]圖2-B按照實(shí)施例6制備的HPV18 LI五聚體的動(dòng)態(tài)光散射觀測結(jié)果，結(jié)果顯示五聚體的粒徑與粒度分布圖。
[0058]圖3實(shí)施例1 HPV18 LI五聚體蛋白的高壓液相分子篩色譜圖，圖中顯示經(jīng)高度純化的五聚體蛋白純度。
[0059]圖4實(shí)施例制備的HPV18 LI五聚體疫苗接種小鼠后，在第二次加強(qiáng)免疫3周后，檢測中和抗體的平均滴度水平。
[0060]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步舉例描述。這些實(shí)施例是非限制性的。
[0061]實(shí)施例1:具有HPV18 LI序列2的工程菌的構(gòu)建
1、HPV18 LI基因全長由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQID NO:1，其源自 GeneBank,序列號為 GenBank: M14119.1。
[0062]2、含有SEQ ID NO:1基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以正向引物序列:5’ - CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT -3’ ；在H4結(jié)構(gòu)的5’端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA。下游包含XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)，反向引物序列:5’-GCTCTCCTCGAGTTA ACGTTTACGA GGGCCTACGG T -3’，其5’端引入限制性內(nèi)切酶XhoI位點(diǎn)，XhoI位點(diǎn)序列為CTCGAG。經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到HPV18B。
[0063]3、含有SEQ ID NO:1基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以含有引入的限制性內(nèi)切酶BamH I 位點(diǎn)，BamH I 位點(diǎn)序列為 GGATCC，正向引物序列:5’ -CGCGGAGGATCC GGA GGA GGAATATTACATTACCATCTACTA -3’;在H4結(jié)構(gòu)的3’端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為 TCCGGA，反向引物序列:GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T ;經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增擴(kuò)增得到HPV18A。
[0064]4、HPV18A片段與HPV18B共同用限制性內(nèi)切酶AccIII酶切，形成特異粘性末端，使用T4 DNA連接酶連接HPV18A和HPV18B片段，使之形成一個(gè)刪除了 H4結(jié)構(gòu)域的、原H4結(jié)構(gòu)域被編碼連接多肽GGGSG的核苷堿基序列取代的HPV18C。
[0065] 5、表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4連接酶連接HPV18c和表達(dá)質(zhì)粒。BamH I/XhoI酶切鑒定得到插入LI蛋白基因片段的陽性表達(dá)克隆PGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(_)引物，測得質(zhì)粒中插入的目的核苷酸序列正確，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0066]6、連接產(chǎn)物經(jīng)電轉(zhuǎn)化或CaC12法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，優(yōu)選轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的BL21細(xì)胞涂于含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，經(jīng)37°C培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12小時(shí)，從中取Iml菌液制備甘油管菌種于-70°C保存。
[0067]上述各步驟中PCR反應(yīng)體系包含20 μ g DNA模板、Ix PCR緩沖液、正向和反向特異引物(濃度均為0.2μ M )、1.5mM鎂離子、1.0單位的Taq DNA聚合酶；反應(yīng)條件為:攝氏95°C變性5分鐘，經(jīng)36個(gè)PCR循環(huán)放大，每一循環(huán)為94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 2分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物在72°C下溫育10分鐘，然后停止反應(yīng)。
[0068]實(shí)施例2:具有HPV18 LI序列4的工程菌的構(gòu)建
1、HPV18L1基因全長的目標(biāo)基因片斷購自北京安貞醫(yī)院婦科門診含有野生型HPV18病毒的臨床細(xì)胞樣本廢棄物，其核苷酸序列為SEQ ID NO:3 (GenBank: FN870689.1)。
[0069]2、含有SEQ IDNO:3基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以正向引物序列:5’_CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT _3’ ；在 H4 結(jié)構(gòu)的 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA。下游包含XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)，反向引物序列:5’ -GCTCTCCTCGAG TTA AGGTTTAGAA GACGTAGTGG C -3’，其 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶 XhoI 位點(diǎn)，XhoI位點(diǎn)序列為CTCGAG。經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到HPV18B。
[0070]3、含有SEQ ID NO:3基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以含有引入的限制性內(nèi)切酶BamH I 位點(diǎn)正向引物序列:5’ -CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA ATATTACATTACCATCTACTA-3’ ；在H4結(jié)構(gòu)的3’端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA，反向引物序列:GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T ;經(jīng) PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增得到 HPV18A。
[0071]4、HPV18A片段與HPV18B共同用限制性內(nèi)切酶AccIII酶切，形成特異粘性末端，使用T4 DNA連接酶連接HPV18A和HPV18B片段，使之形成一個(gè)刪除了 H4結(jié)構(gòu)域的、原H4結(jié)構(gòu)域被編碼連接多肽GGGSG的核苷堿基序列取代的HPV18C。
[0072]5、表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4連接酶連接HPV18c和表達(dá)質(zhì)粒。BamH I/XhoI酶切鑒定得到插入LI蛋白基因片段的陽性表達(dá)克隆PGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(_)引物，測得質(zhì)粒中插入的目的核苷酸序列正確，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:4。
[0073]6、連接產(chǎn)物經(jīng)電轉(zhuǎn)化或CaC12法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，優(yōu)選轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的BL21細(xì)胞涂于含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，經(jīng)37°C培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12小時(shí)，從中取Iml菌液制備甘油管菌種于-70°C保存。
[0074]上述各步驟中PCR反應(yīng)體系包含20 μ g DNA模板、Ix PCR緩沖液、正向和反向特異引物(濃度均為0.2μ M )、1.5mM鎂離子、1.0單位的Taq DNA聚合酶；反應(yīng)條件為:攝氏95°C變性5分鐘，經(jīng)36個(gè)PCR循環(huán)放大，每一循環(huán)為94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 2分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物在72°C下溫育10分鐘，然后停止反應(yīng)。
[0075]實(shí)施例3:具有HPV18 LI序列6的工程菌的構(gòu)建
1、HPV18 LI基因全長由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQID NO:5，其源自 GeneBank，序列號為 GenBank: FN870694.1。
[0076]2、含有SEQ IDNO:3基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以正向引物序列:5’_CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT-3’ ；在 H4 結(jié)構(gòu)的 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA。下游包含XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)，反向引物序列:5’ -GCTCTCCTCGAG TTA AGGTTTAGAA GACGTAGTGG C -3’，其 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶 XhoI 位點(diǎn)，XhoI位點(diǎn)序列為CTCGAG。PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到HPV18B。
[0077]3、含有SEQ ID NO:3基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以含有引入的限制性內(nèi)切酶BamH I 位點(diǎn)正向引物序列:5’ -CGCGGAGGATCC GGA GCC GGA CCTCTGTATGGCCCATTGTAT -3’ ；在H4結(jié)構(gòu)的3’端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA，反向引物序列:5’ -GCTCTCTCCGGA TCC GGC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T -3’ ；經(jīng) PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增得到HPVI8A。
[0078]4、HPV18A片段與HPV18B共同用限制性內(nèi)切酶AccIII酶切，形成特異粘性末端，使用T4 DNA連接酶連接HPV18A和HPV18B片段，使之形成一個(gè)刪除了 H4結(jié)構(gòu)域的、原來的H4結(jié)構(gòu)域被編碼連接多肽GGGSG的核苷堿基序列取代的HPV18C。
[0079]5、表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4連接酶連接HPV18c和表達(dá)質(zhì)粒。BamH I/XhoI酶切鑒定得到插入LI蛋白基因片段的陽性表達(dá)克隆PGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(_)引物，測得質(zhì)粒中插入的目的核苷酸序列正確，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:6。
[0080]其余操作步驟參照實(shí)施例1的方法。
[0081]實(shí)施例4:具有HPV18 LI序列8的工程菌的構(gòu)建
1、HPV18 LI基因全長由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQID NO:7，其源自 GeneBank，序列號為 GenBank: HE574702.1。
[0082] 2、含有SEQ IDNO:7基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以正向引物序列:5’_CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT-3’ ；在 H4 結(jié)構(gòu)的 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA。下游包含XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)，反向引物序列:5’ -GCTCTCCTCGAG TTA ACGTTTGCGA GGGCCTATGG T -3’，其 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶 XhoI 位點(diǎn)，XhoI位點(diǎn)序列為CTCGAG。經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到HPV18B。
[0083]3、含有SEQ IDNO:7基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以含有引入的限制性內(nèi)切酶NheI 位點(diǎn)正向引物序列:5’ -CGCGGA GCTAGCGCC TCC GGA CCTCTGTATGGCCCATTGTAT -3’ ；在 H4結(jié)構(gòu)的3’端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA，反向引物序列:5’-GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T-3’ ；經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到HPV18A。
[0084]4、HPV18A片段與HPV18B共同用限制性內(nèi)切酶AccIII酶切，形成特異粘性末端，使用T4 DNA連接酶連接HPV18A和HPV18B片段，使之形成一個(gè)刪除了 H4結(jié)構(gòu)域的、原來的H4結(jié)構(gòu)域被編碼連接多肽GGGSG的核苷堿基序列取代的HPV18C。
[0085]5、表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4連接酶連接HPV18c和表達(dá)質(zhì)粒。BamH I/XhoI酶切鑒定得到插入LI蛋白基因片段的陽性表達(dá)克隆PGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(_)引物，測得質(zhì)粒中插入的目的核苷酸序列正確，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:8。
[0086]其余操作步驟參照實(shí)施例1的方法。
[0087]實(shí)施例5:具有HPV18 LI序列10的工程菌的構(gòu)建
1、HPV18 LI基因全長由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQID NO:9，其源自 GeneBank，序列號為 GenBank: AF335603.1。
[0088]2、含有SEQ ID NO:9基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以正向引物序列:5’_CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT-3’ ；在 H4 結(jié)構(gòu)的 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA。下游包含XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)，反向引物序列:5’ -GCTCTCCTCGAG TTA CTTCCTGGCA CGTACACGCA C -3’，其 5’ 端引入限制性內(nèi)切酶 XhoI 位點(diǎn)，XhoI位點(diǎn)序列為CTCGAG。經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到HPV18B。
[0089]3、含有SEQ ID NO:9基因片段做PCR反應(yīng)的模板。以含有引入的限制性內(nèi)切酶BamH I 位點(diǎn)正向引物序列:5’ -CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA ATATTACATTACCATCTACTA -3’ ；在H4結(jié)構(gòu)的3’端引入限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，AccIII位點(diǎn)序列為TCCGGA，反向引物序列:5’ -GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T -3’ ；經(jīng) PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增得到HPVI8A。
[0090]4、HP V18A片段與HPV18B共同用限制性內(nèi)切酶AccIII酶切，形成特異粘性末端，使用T4 DNA連接酶連接HPV18A和HPV18B片段，使之形成一個(gè)刪除了 H4結(jié)構(gòu)域的、原來的H4結(jié)構(gòu)域被編碼連接多肽GGGSG的核苷堿基序列取代的HPV18C。
[0091]5、表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4連接酶連接HPV18c和表達(dá)質(zhì)粒。BamH I/XhoI酶切鑒定得到插入LI蛋白基因片段的陽性表達(dá)克隆PGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(_)引物，測得質(zhì)粒中插入的目的核苷酸序列正確，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO =10
[0092]其余操作步驟參照實(shí)施例1的方法。
[0093]實(shí)施例6:具有HPV18 LI序列11的工程菌的構(gòu)建
以合成的含有SEQ ID NO: I基因片段做PCR反應(yīng)的模板，N端前8個(gè)氨基酸被GSGGG取代，C端不截短氨基酸，按照上述實(shí)施例1的方法PCR擴(kuò)增，得到其目的氨基酸序列為SEQID NO:11ο
[0094]實(shí)施例7:重組HPV18 LI蛋白的大量表達(dá)與純化
蛋白表達(dá):在_70°C中分別取出實(shí)施例1- 6的凍存菌種，平板活化，37°C培養(yǎng)14-20h，挑菌苔于80mL種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10_12h ;然后接種于50L種子罐在37°C下培養(yǎng)10-12h ;之后接種于500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后離心收集菌體。用pH7.4磷酸鹽緩沖液重懸菌體，之后破碎，破碎方法可用但不限于:高壓勻漿、超聲波破碎或溶菌酶溶解等化學(xué)或物理手段。離心，獲得上清液?？刹捎肔owry法檢測總蛋白量，用Elisa法檢測LI含量。
[0095]蛋白純化:上清液可用但不限于鹽析、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、親和層析、分子篩等分離純化方法，得到純度98%HPV18 LI的五聚體。用電鏡觀察純化產(chǎn)物，直徑均為1nm左右的五聚體蛋白。
[0096]純化方法具體步驟為將上清溶液中的LI蛋白經(jīng)親和色譜純化:預(yù)裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(GE公司生產(chǎn)的Glutath1ne Sepharose 4 B)色譜柱。取濃度為50%的Glutath1ne Sepharose 4 B樹脂勻衆(zhòng)放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5_10ml樹脂勻漿)。用5-10倍的柱床體積的緩沖液A (組分為:50mmol/L Tric-HCl，200mmol/L NaCl,lmmol/LEDTA, pH 8.0)洗滌樹脂，然后將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室溫下作用20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。將精確蛋白酶(Presciss1n Protease,簡稱PP酶)用緩沖液A稀釋,上樣并柱上循環(huán)酶切120min。放出酶切液，用適量的緩沖液A洗脫并收集目的蛋白。
[0097]離子交換色譜純化:將上述收集的目的蛋白用Source Q或Mono Q (GE公司)陰離子交換柱進(jìn)行離子交換層析，收集目的蛋白。
[0098]分子篩色譜純化:將離子交換色譜收集的目的蛋白用分子量在10-600kDa的凝膠過濾介質(zhì)進(jìn)行分子篩層析，最終獲得純度大于98%的高純度HPV18 LI五聚體蛋白。
[0099]實(shí)施例8:HPV18 LI五聚體的形態(tài)學(xué)檢測
將實(shí)施例1-6構(gòu)建的工程菌株送上海生工公司測序，測得質(zhì)粒中插入的目的DNA序列，其編碼的氨基酸序列為 SEQID NO:2、SEQID NO:4、SEQID NO:6、SEQID NO:8、SEQID NO:10、SEQID NO:11所示，其中實(shí)施例1-5結(jié)果表明原來全長序列中H4結(jié)構(gòu)域不復(fù)存在，取而代之的是編碼連接多肽 GGGSG 或 GAGSG 序列的“GGA GGA GGA TCC GGA” 或“GGA GCC GGA TCC GGA”核苷酸序列。
[0100]將實(shí)施例1-6方法獲得的工程菌株采用實(shí)施例7的方法表達(dá)純化得到的產(chǎn)物HPV18 LI五聚體蛋白，透射電鏡觀察(100,000倍)，結(jié)果顯示，視野中可見直徑為13nm左右的五聚體，顆粒大小與理論大小相符，均勻一致。其中實(shí)施I序列所得樣品的電鏡照片見附圖1。
[0101]進(jìn)行顆粒粒徑測定。儀器為馬爾文ZetasizerNanoZS的動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀,使用算法為Regulat1n算法。樣品經(jīng)0.22 u m濾膜過濾后進(jìn)行測量，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，六種五聚體平均粒徑基本一致12.89-14.48nm，但分散性指數(shù)PdI (表明蛋白的均一性)存在顯著差異，其中實(shí)施例1-5樣品的分散性指數(shù)較小，說明樣品很均一。實(shí)施例6樣品的分散性指數(shù)較大，說明樣品不均一。
[0102]表1五聚體平均粒徑和分散性指數(shù)

【權(quán)利要求】
1.一種重組的HPV18 LI蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列在N端8-15個(gè)氨基酸全部或任意部分被2-10個(gè)氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一組合方式；H4結(jié)構(gòu)域被2-10個(gè)氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一組合方式。
2.如權(quán)利要求1所述的HPV18LI蛋白，其特征在于其氨基酸序列C端截短0_21個(gè)氨基酸，優(yōu)選截短10個(gè)或21個(gè)氨基酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的HPV18LI蛋白，其特征在于其氨基酸序列N端前8_15個(gè)氨基酸被GSGGG、ASASG或GSGAG取代，H4結(jié)構(gòu)域被GGGSG或GAGAS取代。
4.如權(quán)利要求3所述的HPV18LI蛋白，其特征在于其氨基酸序列在N端前8、10或15個(gè)氨基酸優(yōu)選被GSGGG或GAGA氨基酸序列取代。
5.如權(quán)利要求4所述的HPV18LI蛋白，其特征在于其序列包含序列SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:10。
6.編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的蛋白的多核苷酸。
7.包含權(quán)利要求5的多核苷酸的表達(dá)載體。
8.包含權(quán)利要求7的表達(dá)載體的細(xì)胞。
9.一種HPV18 LI蛋白五聚體,其特征在于該蛋白五聚體由權(quán)利要求1至5任一所述的蛋白形成。
10.一種HPV疫苗，其 特征在于該疫苗包括權(quán)利要求9所述的HPV18 LI蛋白五聚體和藥用佐劑。
11.如權(quán)利要求10所述的HPV疫苗的制備方法，其特征在于該方法為: 克隆或合成重組HPV18 LI蛋白的基因片段； 在大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組的HPV18 LI蛋白； 純化由HPV18 LI蛋白組成的五聚體； HPV18 LI蛋白五聚體加入藥用佐劑制成疫苗。
12.如權(quán)利要求9所述的HPV18LI蛋白五聚體在預(yù)防和/或治療包括HPV18感染及導(dǎo)致疾病的藥物中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求10所述的HPV18LI疫苗在預(yù)防和/或治療包括HPV18感染及導(dǎo)致疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK104045695SQ201310696226
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月19日
【發(fā)明者】劉永江, 陳小江, 陳林, 蓋大海, 許錚, 曹科, 陳建平, 潘勇昭, 銀飛, 阮芳勇 申請人:北京康樂衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司