用于調節toso活性的方法和組合物的制作方法

文檔序號：1293215閱讀：385來源：國知局

用于調節toso活性的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發明進一步涉及用于調節Toso蛋白的活性的方法和組合物。本發明進一步涵蓋使用包括可溶性Toso蛋白的組合物治療與炎癥、自身免疫性病癥和癌癥相關的病癥。
【專利說明】用于調節TOSO活性的方法和組合物
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年3月16提交的美國臨時申請號61/612, 183、2012年5月 11日提交的美國臨時申請號61/646, 143和2012年11月29日提交的美國臨時申請號 61/731，428的優先權的權益，所述臨時申請的內容出于所有目的以引用的方式整體明確地并入本文。
[0003] 發明背景
[0004] Toso或Faim3 (Fas細胞凋亡誘導分子3)是最初通過Jurkat細胞（一種T細胞白血病家系）中的逆轉錄病毒過量表達篩選而表征的單個跨膜細胞表面受體，其作為 Fas-誘導的細胞凋亡性細胞死亡的介體（Hitoshi，Y.等人，Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells. Immunity,1998. 8(4) :p. 461-71)。后續研究已經表明Toso是IgM的難以捉摸的受體。Toso的表達還似乎與慢性淋巴細胞性白血病或CLL的特別侵襲性的形式相關。
[0005] 需要表征Toso的體內作用以便鑒別其作為治療靶標和用于包含能夠結合Toso和 /或調節其活性的藥劑的組合物的用途。
[0006] 發明概述
[0007] 因此，本發明提供用于調節Toso活性和治療與Toso有關的疾病和病癥的方法和組合物。
[0008] -方面，本發明提供一種治療受試者中的自身免疫性病癥的方法，所述方法包括用含有治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者的步驟。在示例性實施方案中，自身免疫性病癥是但不限于類風濕性關節炎、多發性硬化癥、狼瘡或I型糖尿病。
[0009] 另一方面，本發明提供一種治療受試者中的II型糖尿病的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者的步驟。
[0010] 一方面，本發明提供一種治療受試者中的哮喘的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者的步驟。
[0011] 另一方面，本發明提供通過向受試者施用具有SEQ ID N0 :5或6的氨基酸序列或其片段或缺失變體的可溶性多肽來治療所述受試者中的糖尿病、哮喘、多發性硬化癥或類風濕性關節炎的方法。在其它實施方案中，受試者中的Toso活性在受試者中被降低。在仍然其它實施方案中，本發明提供通過施用包含SEQ ID N0. 1-25中的任何一個或多個的氨基酸序列的可溶性多肽來治療受試者中的糖尿病、哮喘、多發性硬化癥或類風濕性關節炎的方法。
[0012] 另一方面，本發明提供治療受:試者中的癌癥、過敏癥、C0PD、_ IgM綜合征、狼瘡或中性白細胞增多癥相關的病癥的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者的步驟。
[0013] 在其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包括 NP_005440. 1 (人Toso同種型a)的氨基酸殘基氨基酸P21至G251 (參見Shima等人，Int. Immunol.，2010,其特此出于所有目的并且特別是出于涉及Toso的胞外結構域的所有教導的目的而整體并入）。
[0014] 在仍然其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包括人Toso蛋白的胞外結構域。在其它實施方案中，本發明中使用的可溶性Toso蛋白包括 SEQ ID N0 :7的氨基酸殘基18-253。
[0015] 在仍然其它實施方案中并且根據上述中的任一項，用于本發明的方法中的可溶性 Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :5或6的氨基酸序列。在又其它實施方案中，可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID N0 :5或6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在又其它實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID N0:5或6的缺失變體。在仍然其它實施方案中并且根據上述中的任一項，用于本發明的方法中的可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0. 1-25 中的任何一個或多個的氨基酸序列。
[0016] 在其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白是多聚體。在仍然其它實施方案中，所述多聚體由6個單體組成。在仍然其它實施方案中，多聚體 Toso蛋白的每個單體包含根據SEQ ID N0 :6的序列。
[0017] 另一方面，本發明提供用于抑制Toso活性的方法，所述方法包括將可溶性Toso多肽應用至包含膜結合Toso受體的細胞。
[0018] 在仍然另一方面，本發明提供一種包括SEQ ID N0 :5或SEQ ID N0 :6的多肽的組合物。在一個實施方案中，所述組合物抑制Toso活性。在另一實施方案中，所述多肽是多聚體。在仍然另一實施方案中，所述多聚體包括6個單體，其中每個單體包含根據SEQ ID NO :6的序列。
[0019] 在另一實施方案中，本發明提供一種編碼根據本文所描述的任何蛋白質的可溶性 Toso蛋白的分離的核酸。在仍然另一實施方案中，本發明提供一種表達編碼根據本文所描述的任何蛋白質的可溶性Toso蛋白的分離的核酸的宿主細胞。
[0020] 另一方面，本發明提供一種包含人Toso蛋白的胞外結構域、Fc區和多聚化標簽的融合蛋白。在另一實施方案中，所述胞外結構域包含人Toso蛋白的氨基酸21-251。在仍然另一實施方案中，所述多聚化標簽包含SEQ ID N0 :4。在又另一實施方案中，Fc區包含SEQ ID N0 :3。
[0021] 在另一實施方案中，本發明提供一種編碼上述融合蛋白的分離的核酸。在仍然另一實施方案中，本發明提供一種包含編碼上述融合蛋白的核酸的宿主細胞。
[0022] 另一方面，本發明提供一種分離的可溶性多肽，所述多肽包含與SEQ ID N0. 8-24 或與包含SEQ ID NO :7的氨基酸殘基18-251的多肽區具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
[0023] 另一方面，本發明提供用于產生編碼本文所描述的任何可溶性Toso蛋白的多肽的方法，所述方法包括提供包含編碼所述多肽的核酸的細胞，將所述細胞在適于表達所述多肽的條件下進行培養。在其它實施方案中，本發明提供一種編碼本文所描述的任何可溶性Toso蛋白的核酸。
[0024] 附圖簡述
[0025] 圖1示出與T〇S〇+小鼠中的炎癥有關的數據。圖1A示出使用數字測徑器如通過踝關節厚度的變化測量的關節炎癥的量度。圖1B示出基于可見腫脹和活動性的每個關節的疾病嚴重程度得分。圖1C示出引流淋巴結中的淋巴細胞群體的流式細胞術分析。
[0026] 圖2示出來自關于T〇S〇f小鼠和野生型小鼠的OVA誘導的哮喘模型的數據。圖 2A示出哮喘模型的誘導的示意性圖解。圖2B示出如通過DifQuik染色評定的關于嗜酸性粒細胞遷移至支氣管肺泡空間中的數據。圖2C示出通過對每個載玻片至少200個白細胞進行計數量化的關于嗜酸性粒細胞的數據。
[0027] 圖3A-C示出如通過ELISA評定的關于BALF中0VA誘導的TH2細胞因子IL-4、IL-5 和IL-13的數據。圖3D示出關于BALF中的嗜酸性細胞活化趨化因子（Eotaxin)( -種嗜酸性粒細胞虜獲C-C趨化因子）的數據。圖3E示出響應于平滑肌細胞中的TNF a治療產生的嗜酸性細胞活化趨化因子的水平。
[0028] 圖4示出關于Toso+小鼠中的IgE的數據。圖4A和B示出Toso+小鼠中的總 IgE水平和特異性IgE水平，并且圖4C示出野生型小鼠與TOSO+小鼠之間的IgGl水平。
[0029] 圖5示出與野生型對照相比T〇S〇+小鼠的Penh值。
[0030] 圖6示出野生型小鼠和Toso+小鼠中的M0G誘導的模型中的EAE得分。
[0031] 圖7A示出關于響應于霧化的0VA，野生型動物的支氣管肺泡灌洗液（BALF)中的細胞因子產生的數據，所述野生型動物之前已氣管內安裝有Tosc^樹突細胞和野生型樹突細胞。圖7B示出源自用負載M0G 35_55的Tosof樹突細胞培養的2d2小鼠的T細胞的增殖。圖 7C示出靜脈內注射負載GP的T 〇S〇f樹突細胞和野生型樹突細胞的RIP-GP動物中的血糖水平，和注射負載GP肽的野生型樹突細胞和TOSO+樹突細胞的RIP-GP小鼠的卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier plot)。RIP-GP小鼠是在大鼠胰島素啟動子（RIP)的控制下表達來自淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV)的主要糖蛋白（GP)的小鼠-這種小鼠發展糖尿病，如通過增加的血清葡萄糖水平所評定。
[0032] 圖8A是Toso可溶性受體的示意性圖解。圖8B示出關于所述可溶性受體的ELISA 數據。圖8C示出通過蛋白質印跡（圖8Ci)和通過考馬斯藍染色（圖8Cii)獲得的Toso 可溶性受體分泌的數據確認。圖8D示出Toso可溶性受體與脾細胞的結合數據。圖8E示出指示Toso-Fc最顯著地結合脾中的⑶llc+MHChi成熟樹突細胞、⑶4+T細胞和B220+B細胞的進一步數據。圖8F示出與板結合的人IgM結合的Toso-Fc的ELISA結果。圖8G示出用每日50iig Toso-Fc治療的小鼠的正常重量增加。
[0033] 圖9A是用于0VA誘導的哮喘的鼠類模型的治療方案的示意性圖解。圖9B示出關于BALF中的Th2細胞因子的數據，并且圖9C示出BALF中的細胞結構數據，其均為疾病嚴重程度的量度。
[0034] 圖10提供本發明的實施方案的序列，包括可溶性Toso蛋白（圖10A)、IL-2信號序列（圖l〇B)、Fc結構域（圖10C)以及六聚化（hexamerization)標簽（圖10D)的序列。
[0035] 圖11A提供包含六聚體標簽、允許表達所述可溶性受體的多聚體形式的可溶性 Toso蛋白的實施方案的序列。圖11B提供人Toso蛋白NP_005440. 1 (SEQ ID N0 :7)的序列。
[0036] 圖12示出粒細胞上的T0S0表達。a :RNA是從野生型（WT)小鼠和Toso+小鼠的脾和肝分離的。使用RT-PCR對Toso RNA進行分析并且將其表示為每18S RNA的表達（n = 4)。b :將來自C57BL/6小鼠和TOSO+小鼠的脾細胞針對CD19 (B細胞）和CD3 (T細胞）進行染色并且用大鼠抗小鼠Toso抗體或同種型對照進行共染色。灰色區域指示同種型對照，粗線指示用抗Toso抗體染色。示出CD19陽性細胞（B細胞）和CD3陽性細胞（T細胞）的一個代表性條帶圖。c :將來自C57BL/6小鼠和TOSO+小鼠的脾細胞和血液白細胞針對Grl 連同大鼠抗小鼠Toso抗體或同種型對照進行染色。灰色區域指示同種型對照，粗線指示用 Toso染色。示出Grl陽性細胞的一個代表性條帶圖。d :將來自野生型小鼠和TOSO+小鼠的血液白細胞通過前向和側向散射針對粒細胞和淋巴細胞進行分析。示出每yl淋巴細胞數目（n = 4)。e :將淋巴細胞針對⑶4T細胞（⑶3+CD8-細胞）、⑶8T細胞（⑶3+⑶8+細胞）和B細胞（B220+細胞，n = 4)進行分析。f :對來自野生型小鼠和TOSO+小鼠的脾重量進行分析（n = 4)。g :將脾淋巴細胞針對⑶4T細胞（⑶3+⑶8_細胞）、⑶8T細胞（⑶3+CD8+細胞）和B細胞（B220+細胞，n = 4)進行分析。
[0037] 圖13示出活化閾值在T0S0缺陷小鼠的粒細胞中被降低。13a :將來自野生型小鼠或TOSO+小鼠的血液與不同濃度的fMLP在37°C下孵育30分鐘。如方法中所描述通過R0S 產生（二氫羅丹明染色）和脫粒（側向散射）來測量粒細胞的活化。示出在粒細胞上門控的細胞的一個代表性點陣圖。門設置在活化的粒細胞上。給出活化的粒細胞的百分比（n =6)。13b :將來自WT小鼠和TOSO+小鼠的血液與不同濃度的TNF-a -起孵育。給出活化的粒細胞的百分比（n = 6)。13c :將來自WT小鼠和T〇S〇f小鼠的血液與不同濃度的脂多糖一起孵育。給出活化的粒細胞的百分比（n = 6)。13d :將來自WT小鼠和T〇S〇+小鼠的血液與不同濃度的GM-CSF(作為來自X630細胞的上清液的百分比給出）一起孵育。給出活化的粒細胞的百分比（n = 6)。13e:將來自野生型小鼠和T〇S〇+小鼠的血液用10% GM-CSF上清液或500ng/ml LPS引發。在30分鐘之后，將細胞用2 ii M fMLP刺激15分鐘。給出活化的粒細胞的百分比（n = 6)。13f :將來自WT小鼠和TOSO+小鼠的血液在不同溫度下孵育30分鐘。使用側向散射來測量脫粒。給出脫粒的細胞的百分比（n = 6)。
[0038] 圖14示出粒細胞中的活化閾值被內在地調控。將C57BL/6野生型小鼠進行輻射處理并且如方法中所描述用來自攜帶CD45基因中的點突變的野生型小鼠（CD45. 1，組1)、 Tosof小鼠（CD45. 2,組2)或野生型（CD45. 1)骨髓與TOSO+骨髓細胞的1 : 1混合物 (⑶45.2,組3)的骨髓進行重構。在骨髓移植之后30天，將外周血用fMLP進行刺激并且針對活化的粒細胞進行分析。14a :示出針對Grl門控的并且針對⑶45. 1、⑶45. 2和二氫羅丹明（R0S)染色的細胞的代表性FACS圖。14b:量化三組不同的骨髓嵌合體的粒細胞百分比 (n = 8)。14c :對根據圖3a中的門通過側向散射和R0S產生測量的活化的粒細胞的百分比進行分析（n = 8)。14d :針對總粒細胞和活化的粒細胞分析側向散射和二氫羅丹明（R0S) 的平均熒光強度（n = 8)。
[0039] 圖15示出Toso缺陷小鼠中李斯特氏菌的控制受損。15a :將Tosof小鼠和相應野生型小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。監測存活率（n = 8-15)。15b :將TOSO+小鼠和相應野生型小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。在感染后第0天和第2天測量血液粒細胞中的粒細胞活化（R0S形成）（n = 4-5)。15c :將WT和TOSO+小鼠用1x106CFU的李斯特氏菌感染。對天然WT小鼠和感染后六小時的李斯特氏菌感染的WT小鼠和Toso^小鼠的血漿中的髓過氧化物酶進行分析（n = 4)。15d :將Tosof小鼠和相應WT小鼠用1x106CFU 的單核細胞增生李斯特菌感染。在20小時之后分析肝組織學。示出一個代表性載玻片（n =4)。比例尺=50 ii m。15e :將T0S0+小鼠和相應WT小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。在一天之后，測量脾和肝的粒細胞中的R0S產生（n = 3)。f :將TOSO+小鼠和相應WT 小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。在感染后第3和第4天，分析脾、肝和腦中的李斯特氏菌滴度（n = 6)。
[0040] 圖16示出CDllb和CD18的表達受Toso影響。16a :將來自Toso+小鼠和相應WT 小鼠的血液粒細胞進行福爾馬林固定并且然后針對CDlla、CDllb和CD18進行染色。示出平均突光表達（n = 6)。p值源自配對的學生t檢驗。16b :將來自野生型小鼠和Tos〇f小鼠的血液用不同濃度的GM-CSF和LPS進行刺激。示出粒細胞上的CDllb的平均熒光表達（n =6)。16c :將來自Cdllb+小鼠和相應野生型小鼠的血液粒細胞用2 ii M fMLP或用40% GM-CSF上清液還有2 ii M fMLP進行刺激。給出⑶lib和⑶18的平均熒光強度（n = 4)。 16d :將來自Cdllb+小鼠和相應野生型小鼠的血液粒細胞用2iiM fMLP或用40% GM-CSF 上清液還有2 yM fMLP進行刺激。給出活化的粒細胞的百分比（n = 4)。給出總粒細胞以及活化的粒細胞的R0S染色的平均熒光強度（n = 4)。
[0041] 圖17示出Toso+粒細胞中的細胞凋亡。將來自TOSO+-的血液在37°C下在有或沒有GM-CSF(10%)的情況下孵育。在一小時和七小時之后用Annexin V和7AAD測量細胞凋亡（n = 4)。
[0042] 圖18示出在TOSO+小鼠感染之后的李斯特氏菌菌血癥。將TOSO+-小鼠和相應野生型小鼠用1x106CFU的單核細胞增生李斯特菌感染。在感染后一小時和20小時評定血液李斯特氏菌滴度（n = 4)。
[0043] 圖19示出來自在開始高脂肪飲食之后的野生型小鼠和TOSO+小鼠的數據。圖19A 示出野生型和T 〇S〇+雄性小鼠的體重，自開始于5周大的高脂肪飲食開始監測體重。圖19B 示出在高脂肪飲食后14周時兩組小鼠中的食物攝取的測量值。
[0044] 圖20A示出來自在開始高脂肪飲食之后的野生型小鼠和TOSO+小鼠的葡萄糖耐量試驗的數據。圖20B示出來自同一組小鼠的胰島素耐量試驗的數據。
[0045] 圖21示出說明用常規食物（非高脂肪）飲食飼養的野生型小鼠和TOSO+小鼠展示出類似水平的葡萄糖耐量（圖21A)和胰島素耐量（圖21B)的數據。
[0046] 圖22示出關于在用可溶性Toso蛋白治療之前（圖22A)和治療之后（圖22B)的葡萄糖耐量的數據。
[0047] 圖23示出與用可溶性Toso蛋白治療的小鼠（Toso-Fc-實心正方形）相比，用PBS 治療的小鼠（實心圓）中的EAE臨床得分。
[0048] 圖24A示出比較用對照媒介物治療的小鼠（實現圓）和用可溶性Toso蛋白治療的小鼠（Toso-Fc-空心正方形）治療的小鼠中的累加關節炎得分的關節炎小鼠模型。圖24B 示出如與對照（媒介物-實心圓）相比，來自比較Toso-Fc治療的小鼠（Toso-Fc-空心正方形）中的關節炎發病率百分比的關節炎小鼠模型的數據。
[0049] 圖25示出對用Toso-Fc治療的脾細胞中的膠原減少的增殖應答。
[0050] 圖26示出如與對照（媒介物-實心圓）相比，可溶性Toso蛋白（Toso-Fc-空心正方形）在關節炎小鼠模型中的治療作用。
[0051] 圖27A-C提供本發明的可溶性Toso蛋白的不同實施方案的序列。
[0052] 發明詳述
[0053] 除非另外指示，否則本發明的實踐可以采用本領域的技術之內的有機化學、聚合物技術、分子生物學（包括重組技術）、細胞生物學、生物化學以及免疫學的常規技術和描述。這類常規技術包括聚合物陣列合成、雜交、連接、噬菌體展示和使用標記檢測雜交。適合的技術的具體說明可以參考本文以下實施例。然而，當然還可以使用其它等效常規程序。這類常規技術和描述可在標準實驗室手冊中找到，如Genome Analysis :A Laboratory Manual Series (第 I-IV 卷），Using Antibodies ：A Laboratory Manual, Cells ：A Laboratory Manual, PCR Primer ：A Laboratory Manual 和 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (全部來自冷泉港實驗室出版社），Stryer, L. (1995) Biochemistry(第 4 版)Freeman, New York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis ： A Practical Approach，'1984, IRL Press, London, Nelson 和 Cox(2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 第 3 版，W.H. Freeman Pub.，New York, N.Y?和 Berg 等人 (2002)Biochemistry，第 5 版，W.H.Freeman Pub.，New York，N. Y?，所述文獻全部出于所有目的以引用的方式整體并入本文。
[0054] 應注意，除非上下文另外明確地規定，否則如在本文和所附權利要求書中所使用，單數形式"一個"、"一種"和"所述"包括復數指示物。因此，例如，提及"一種聚合酶"是指一種試劑或這類試劑的混合物，并且提及"所述方法"包括提及本領域技術人員已知的等效步驟和方法等等。
[0055] 除非另外定義，否則本文所使用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域中的普通技術人員通常所理解的相同的含義。出于描述和公開描述于本公布中并且可能與目前所描述的發明結合使用的裝置、組合物、制劑以及方法學的目的，本文所提及的所有公布均以引用的方式并入本文。
[0056] 如果提供一定范圍的值，那么應理解除非上下文另外清楚地規定，否則本發明內包涵所述范圍的上限與下限之間的各插入值（至下限單位的十分之一）和在所陳述的范圍中的任何其它陳述值或插入值。本發明內還包涵可以獨立地包括于這些較小范圍中的所述較小范圍的上限和下限，從屬于所陳述的范圍中的任何具體排除的限值。如果所陳述的范圍包括一個或兩個限值，那么排除任一個或兩個所包括的限值的范圍也包括于本發明中。
[0057] 在以下描述中，闡述大量具體細節以便提供本發明的更詳盡的理解。然而，對于本領域技術人員將是清楚的：可以在無一種或多種這些具體細節的情況下實踐本發明。在其它情況下，并未描述本領域技術人員所熟知的熟知特征和程序，以便避免混淆本發明。
[0058] 如本文所用，術語"包含"意圖意味組合物和方法包括所述要素，但不排除其它要素。"基本上由……組成"在用于定義組合物和方法時將意味排除具有為組合物或方法所必需的任何意義的其它要素。"由……組成"將意味排除超過所要求保護的組合物的其它成分的痕量元素和實質性方法步驟。由這些過渡術語的各者定義的實施方案在本發明的范圍內。因此，意圖所述方法和組合物可包括另外步驟和組分（包含）或可替代地包括不具有意義的步驟和組合物（基本上由……組成）或可替代地，意圖僅包括所陳述的方法步驟或組合物（由......組成）。
[0059] 所有數字標識，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量（包括范圍）是以0.1的增量 (+)或（_)變化的近似值。應理解，雖然并非總是明確地說明，但是所有數字標識都應在前面加上術語"約"。術語"約"除"X"的較小增量如"X+0. 1"或"X-0. 1"之外還包括精確值 "X"。還應理解，雖然并非總是明確地說明，但是本文所描述的試劑僅是示例性的并且所述試劑的等效物是本領域已知的。
[0060] "組合物"可包括包含藥劑或化合物的任何物質，并且還意圖涵蓋藥劑或化合物與其它物質（包括載體）（例如，惰性（例如，可檢測藥劑或標記）或活性的化合物或組合物）的任何組合，所述載體如佐劑、稀釋劑、粘合劑、穩定劑、緩沖劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等。載體還包括藥物賦形劑和添加劑、蛋白質、肽、氨基酸、脂質和碳水化合物（例如，糖，包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖）；衍生的糖，如糖醇、醛糖酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物），所述載體可單獨地或組合存在，獨自或組合占1-99. 99重量％或體積％。示例性蛋白質賦形劑包括血清白蛋白如人血清白蛋白（HSA)、重組人白蛋白（rHA)，明膠，酪蛋白等。還可在緩沖能力中起作用的代表性氨基酸/抗體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物賦形劑也意圖在本發明的范圍內，其實例包括但不限于單糖如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。
[0061] 可與術語生物相容的載體或介質互換使用的術語藥學上可接受的載體（或介質）是指不僅與有待治療性使用的細胞和其它藥劑相容，而且在合理醫學判斷的范圍內適合用于與人和動物組織相接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其它并發癥、與合理的益處/ 風險比相稱的試劑、細胞、化合物、材料、組合物和/或劑型。適合用于本發明的藥學上可接受的載體包括液體、半固體（例如，凝膠）和固體材料（例如，細胞支架和基質、管材片材和如本領域已知和本文更詳細地描述的任何這類材料）。這些半固體和固體材料可被設計成抵抗身體內的降解（不可降解的）或它們可被設計成在身體內降解（生物可降解的、生物可侵蝕的）。生物可降解的材料可進一步是可生物再吸收的或生物可吸收的，即，它可以被溶解并且吸收至體液（水可溶性移植物是一個實例）中或通過轉化成其它材料或通過天然途徑分解并且消除來降解并且最終從身體消除。
[0062] 如本文所用，術語"患者"或"受試者"意指動物、哺乳動物或更進一步人患者。僅出于說明目的，哺乳動物包括但不限于人、猿猴、鼠類、牛、馬、豬或綿羊。
[0063] 如本文所用，術語"寡核苷酸"或"多核苷酸"是指由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合組成的短聚合物。寡核苷酸的長度通常為至少約10、15、20、25、30、40、50、60、 70、80、90、100或更多個核苷酸。寡核苷酸可用作引物或用作探針。
[0064] 術語"氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及稍后被修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和鄰-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構（即，結合氫的a碳、羧基、氨基和R基），例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類似物具有經過修飾的R基團（例如，正亮氨酸）或經過修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸的一般化學結構的結構、但以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化學化合物。
[0065] 如本文所用的術語"分離的"是指基本上不含其它材料的分子或生物材料或細胞材料（例如，大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98% )。一方面，術語"分離的" 是指核酸，如分別與其它DNA或RNA、或蛋白質或多肽、或細胞或細胞器、或組織或器官分離的DNA或RNA、或蛋白質或多肽、或細胞或細胞器、或組織或器官，其存在于天然來源中并且允許操作所述材料以便實現在存在于其天然或自然狀態的情況下不可獲得的結果（例如，重組復制或通過突變操作）。術語"分離的"還指當化學合成時在通過重組DNA技術或化學前體或其它化學品產生時基本上不含細胞材料、病毒材料或培養基的核酸或肽。此外，"分離的核酸"意味包括并非以片段形式天然存在并且將不能以天然狀態發現的核酸片段。術語"分離的"在本文還用于指從其它細胞蛋白分離的多肽并且意味涵蓋純化的多肽和重組多肽兩者，例如，具有大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、98%、或99%的純度。術語"分離的"在本文還用于指從其它細胞或組織分離的細胞或組織并且意味涵蓋培養的細胞或組織和工程化的細胞和組織兩者。
[0066] "重組"核酸是指通過組合通常不一起存在的兩個或更多個序列而形成的人工核酸。在一個實施方案中，它是通過將相關DNA引入現有生物體DNA (如細菌的質粒）中以便編碼或改變不同性狀以用于具體目的（如抗生素抗性）來形成。"重組"多肽是衍生自重組核酸的多肽。
[0067] 如本文所用，術語"啟動子"是指足以指導基因轉錄的核酸序列。還包括于本發明中的是足以使啟動子依賴性基因表達可針對細胞類型特異性、組織特異性控制或可通過外部信號或藥劑誘導的那些啟動子元件。
[0068] 在一些實施方案中，啟動子是誘導型啟動子或離散啟動子。誘導型啟動子可通過化學或物理條件如溫度或光開啟。化學啟動子的實例包括但不限于醇調控的、四環素調控的、類固醇調控的、金屬調控的和發病機制調控的啟動子。離散啟動子的實例可在例如 Wolfe 等人 Molecular Endocrinology 16(3) :435_49 中找到。
[0069] 如本文所用，術語"調控元件"是指足能夠調節基因轉錄的核酸序列。調控元件的非限制性實例包括啟動子、增強子、沉默子、多腺苷酸化信號、轉錄終止序列。調控元件可存在于天然基因的5'或3'區或內含子內。
[0070] 各種蛋白質也在本文公開，具有針對其人蛋白和編碼序列的其GenBank登錄號。然而，蛋白質不限于源自人的具有由所公開的GenBank登錄號表示的氨基酸序列的蛋白質，但可具有源自其它動物，具體地說溫血動物（例如，大鼠、豚鼠、小鼠、雞、兔、豬、免疫、牛、猴等）的氨基酸序列。
[0071 ] 如本文所用，術語"Toso"、"FAM3"或"Fas細胞凋亡抑制分子3"是指具有與代表性Toso序列中的任一種基本上相同的氨基酸序列的蛋白質，包括GenBank登錄號 NP_001135945(人同種型 b)、NP_001180267(人同種型 c)、NP_005440(人同種型 a)、 NP_081252 (小鼠）或NP_001014843 (大鼠）的任何和所有型式。編碼Toso的合適的cDNA 在 GenBank 登錄號 NM_001142473、NM_001193338、NM_005449、NM_026976 和 NM_001014843 提供。
[0072] 如本文所用，術語"Toso的生物活性"或"Toso活性"是指與全長天然Toso蛋白相關的任何生物活性。在一些實施方案中，Toso的生物活性是指結合IgM抗體。在其它實施方案中，Toso的生物活性是指抑制⑶lib或⑶18活性。在仍然其它實施方案中，Toso的生物活性是指增加粒細胞的活化閾值。可通過來自骨髓的活化的粒細胞的數目測量活化閾值。在其它實施方案中，Toso的生物活性包括樹突細胞的活化和其將抗原呈遞至T細胞的能力。在其它實施方案中，Toso的生物活性包括抑制細胞凋亡或增強TNF信號傳導。在一些實施方案中，Toso生物活性等效于具有由GenBank登錄號NP_001135945、NP_001180267、 NP_005440、NP_081252或NP_001014843表示的氨基酸序列（包括這些登錄號的任何和所有型式）的蛋白質的活性。
[0073] 如本文所用，術語"⑶1 lb"、" ITGAM"或" ITGAM整聯蛋白，a M(補體組分3受體3 亞基）"是指具有與GenBank登錄號NP_000623的代表性⑶1 lb序列基本相同的氨基酸序列的蛋白質。編碼⑶lib的合適的cDNA在GenBank登錄號NP_000632提供。
[0074] 如本文所用，術語"⑶lib的生物活性"是指與全長天然⑶lib蛋白相關的任何生物活性。在一個實施方案中，⑶lib的生物活性是指與02鏈（ITGB2)組合以形成白細胞特異性整聯蛋白。在合適的實施方案中，⑶lib生物活性等效于具有由GenBank登錄號 NP_000623表示的氨基酸序列的蛋白質的活性。轉錄活性的測量可使用任何已知的方法進行，如免疫組織化學、報告基因測定或RT-PCR。
[0075] 如本文所用，術語"CD18"、"ITGB2"或"ITGB2整聯蛋白，@ 2(補體組分3受體3 和4亞基）"是指具有與GenBank登錄號NP_000202的代表性⑶18序列基本相同的氨基酸序列的蛋白質。編碼⑶18的合適的cDNA在GenBank登錄號NP_000211提供。
[0076] 如本文所用，術語"治療"是指出于通過減輕、緩解、逆轉或預防疾病或病癥的至少一種不良作用或癥狀來改善患者的狀況的目的而施用藥物組合物。
[0077] 如本文所用，術語"預防"是指鑒別受試者（即，患者）對疾病具有增加的易感性但尚未表現出所述疾病的癥狀，并且施用根據本公開的原理的療法。預防性療法被設計成降低易感受試者稍后將變成癥狀性或所述疾病將比它在不存在所述預防性療法的情況下所將會的更緩慢地延遲發作或進展的可能性。受試者可通過任何適當的方法（包括例如通過鑒別疾病的家族病史或其它退行性腦部病癥）被鑒別為具有發展所述疾病的增加的可能性，或具有指示疾病或對疾病的易感性的一種或多種診斷標志物。
[0078] 如本文所用，術語"樣本"或"測試樣本"是指含有核酸的任何液體或固體材料。在合適的實施方案中，測試樣本是從生物來源獲得的（即，"生物樣本")，如培養物中的細胞或來自動物、更優選人的組織樣本。
[0079] 如本文所用，術語"基本上相同"當提及蛋白質或多肽時意味與參考氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的氨基酸序列。比較的長度優選是所述多肽或蛋白質的全長，但通常是至少10、15、20、25、30、40、50、60、80或100或更多個連續氨基酸。"基本上相同的"核酸是與參考核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98 %或99 %序列同一性的核酸序列。比較的長度優選是所述核酸的全長，但通常是至少20 個核苷酸、30個核苷酸、40個核苷酸、50個核苷酸、75個核苷酸、100個核苷酸、125個核苷酸、或更多。
[0080] 如本文所用，"氨基酸取代"或"取代"是指起始多肽序列中特定位置處的氨基酸被另一氨基酸替換。例如，取代M23Y是指位置23處的蛋氨酸被酪氨酸替換的變異多肽。
[0081] 蛋白質或核酸的"生物等效物"是指與所述蛋白質或核酸在氨基酸或核酸序列方面基本相同或具有等效生物活性的蛋白質或核酸。
[0082] 如本文所用，術語"有效量"是指以足以向患者提供醫學益處的頻率遞送的化合物 (例如，Toso蛋白或其生物活性片段）的量。在一個實施方案中，蛋白質的有效量是足以治療或改善疾病的癥狀的量。
[0083] 細胞的群體意圖指在表型和/或基因型方面完全相同（克隆）或不完全相同的多于一個細胞的合集。
[0084] "基本上同質"描述其中多于約50%或可替代地多于約60%、或可替代地多于 70 %、或可替代地多于75 %、或可替代地多于80 %、或可替代地多于85 %、或可替代地多于 90%、或可替代地多于95%的細胞具有相同或相似表型的細胞群體。表型可通過預選選擇的細胞表面標志物或其它標志物來確定。
[0085] 術語自體轉移、自體移植、自身移植物等是指其中細胞供體也是細胞替代療法的受體的治療。術語同種異體轉移、同種異體移植、同種異體移植物等是指其中細胞供體具有與細胞替代療法的受體相同的物種，但不是同一個體的治療。供體的細胞已經與受體組織相容性匹配的細胞轉移有時被稱為同系轉移。術語異種轉移、異種移植、異種移植物等是指其中細胞供體具有與細胞替代療法的受體不同物種的治療。
[0086] 如本文所用，"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結合片段或單鏈。因此，術語"抗體"包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的任何蛋白質或肽。這種的實例包括但不限于重鏈或輕鏈的互補決定區（CDR)或其配體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恒定區、框架（FR)區或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。通常，術語"抗體"包括任何多肽，所述多肽包括至少一個恒定結構域，包括但不限于CHI、CH2、CH3以及CL。適用于本發明中的抗體可采取如本文所描述的多種形式，包括傳統抗體以及抗體衍生物、片段和模擬物
[0087] 所述抗體可以是多克隆的或單克隆的并且可分離自任何合適的生物來源，例如，鼠類、大鼠、綿羊和犬。
[0088] 單克隆抗體是由細胞或雜交瘤的單個克隆產生的抗體，并且因此是單一純同質類型的抗體。
[0089] 雜交瘤是在實驗室中由產生抗體的淋巴細胞與不產生抗體的癌細胞（通常是骨髓瘤或淋巴瘤）的融合產生的細胞。雜交瘤增殖并且產生特定單克隆抗體的連續供應。 [0090] 如本文所用的術語"人抗體"意圖包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。本發明的人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基（例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變）。然而，如本文所用的術語"人抗體"不意圖包括其中源自另一種哺乳動物物種（如小鼠）的種系的 CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。因此，如本文所用，術語"人抗體"是指其中蛋白質的基本上每一部分（例如，⑶R、框架、Q、C H結構域（例如，CH1、CH2、CH3)、鉸鏈、（VL，VH)) 在人中基本上無免疫原性、僅具有較小序列變化或變異的抗體。類似地，指定為靈長類動物 (猴、狒狒、黑猩猩等）、嚙齒類動物（小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠等）和其它哺乳動物的抗體指定這類物種、亞屬、屬、亞科、科特異性抗體。此外，嵌合抗議包括上述的任何組合。相對于非修飾的抗體，這類變化或變異任選地和優選地保留或減少在人或其它物種中的免疫原性。因此，人抗體不同于嵌合或人源化抗體。應指出人抗體可由能夠表達功能性重排的人免疫球蛋白（例如，重鏈和/或輕鏈）基因的非人動物或原核生物或真核細胞產生。此外，當人抗體是單鏈抗體時，它可包含未在天然人抗體中發現的接頭肽。例如，Fv可包含連接重鏈的可變區與輕鏈的可變區的接頭肽，如兩個至約八個甘氨酸或其它氨基酸殘基。這類接頭肽被認為具有人起源。
[0091] 如本文所用，如果人抗體是從使用人免疫球蛋白序列的系統，例如通過對攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠進行免疫或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫獲得，那么所述抗體是"源自"特定種系序列。"源自"人種系免疫球蛋白序列的人抗體可通過將人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比較這樣來鑒別。所選擇的人抗體與由人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上通常是至少90%同一的，并且當與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列（例如，鼠類種系序列）相比時，包含鑒別所述人抗體為人的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體與由所述種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上可以是至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一的。通常，源自具體人種系序列的人抗體將展示出與由所述人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不多于10個氨基酸的差異。在某些情況下，所述人抗體可以展示出與由所述種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不多于5個，或甚至不多于4個、3個、2個或1個氨基酸的差異。
[0092] 如本文所用，術語"重組人抗體"包括通過重組手段制備、表達、產生或分離的所有人抗體，如從動物（例如，小鼠）分離的抗體，所述動物對于人免疫球蛋白基因是轉基因的或轉染色體的，或自所述動物制備的雜交瘤；從被轉化以表達所述抗體的宿主細胞（例如，從轉染瘤）分離的抗體；從重組、組合人抗體文庫分離的抗體；以及通過任何其它手段制備、表達、產生或分離的抗體，所述手段涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列。所述重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區。然而，在某些實施方案中，所述重組人抗體可經受體外誘變（或當使用針對人Ig序列轉基因的動物時，經受體內體細胞誘變），并且因此重組抗體的VH區和VL區的氨基酸序列是雖然來源于并且相關于人種系VH和VL序列，但可能不天然地存在于體內人抗體種系譜系內的序列。本文描述了用于制備這些抗體的方法。
[0093] 如本文所用的"同種型"意指通過其恒定區的化學特征和抗原特征來定義的任何免疫球蛋白的亞類。應了解，治療性抗體也可包含同種型和/或亞類的雜交體。
[0094] 如本文所用的術語"多克隆抗體"或"多克隆抗體組合物"是指源自不同B細胞系的抗體制劑。它們是針對特異性抗原分泌的免疫球蛋白分子（各自識別不同表位）的混合物。
[0095] 如本文所用的術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物針對具體表位展示出單一結合特異性和親和性。
[0096] 如本文所用，術語"標記"意指直接或間接地綴合至待檢測的組合物的直接或間接可檢測的化合物或組合物，例如，N末端組氨酸標簽（N-His)、磁活性同位素（例如，115Sn、 117Sn和119Sn)、非放射性同位素（如13C和15N)、多核苷酸或蛋白質（如抗體），以便產生"標記的"組合物。所述術語還包括綴合至多核苷酸、將在表達插入序列時提供信號的序列，如綠色熒光蛋白（GFP)等。所述標記本身是可檢測的（例如放射性同位素標記或熒光標記），或在酶標記的情況下，可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。所述標記可適合于小規模檢測或更適合于高通量篩選。如此，合適的標記包括但不限于磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、熒光染料、化學發光化合物、染料以及蛋白質，包括酶。標記可以被簡單地檢測或它可以被量化。被簡單地檢測的應答通常包括僅確認其存在的應答，而被量化的應答通常包括具有可量化的（例如，可數字上報告的）值強度、極化和/或其它特性的應答。在發光或熒光測定中，可檢測的應答可使用與實際參與結合的測定組分締合的發光團或熒光團直接產生，或使用與另一種（例如，報告基因或指示劑）組分締合的發光團或熒光團間接產生。
[0097] 產生信號的發光標記的實例包括但不限于生物發光和化學發光。可檢測的發光應答通常包含發光信號的變化或出現。用于熒光地標記測定組分的合適的方法和熒光團是本領域已知的并且描述于例如 Haugland，Richard P. (1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (第6版）中。發光探針的實例包括但不限于水母蛋白和螢光素。
[0098] 合適的熒光標記的實例包括但不限于熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、曙紅、藻紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀綠、芪、熒光黃、Cascade Blue?以及德克薩斯紅。其它合適的光學染料描述于 Haugland，Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第 6版）中。
[0099] 另一方面，熒光標記進行功能化以便有助于共價附接至存在于細胞或組織的表面中或上的細胞組分，如細胞表面標志物。合適的官能團包括但不限于異硫氰酸酯基團、氨基、鹵代乙酰基、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺基酯以及磺酰基鹵化物，其全部可用于將熒光標記附接至第二分子。熒光標記的官能團的選擇將取決于與接頭、藥劑、標志物或第二標記劑附接的位點。
[0100] 雖然主要參照具體實施方案描述了本發明，但還預想在閱讀本公開后其它實施方案對于本領域技術人員將是清楚的，并且意圖這類實施方案包含于本發明的方法內。
[0101] I.發明綜沭
[0102] 本發明涉及用于調節Toso蛋白（其在本文還可互換地被稱為"Toso"或"Toso受體"或"Faim3"或"FCMR"）的活性的方法和組合物。在一些實施方案中，本發明的方法和組合物增加Toso蛋白的活性。在其它實施方案中，本發明的方法和組合物抑制Toso蛋白的活性。在一些實施方案中，用于調節Toso蛋白的活性的組合物包括結合Toso蛋白或結合Toso蛋白的配體的藥劑。在其它實施方案中，本發明的組合物包含可溶性Toso蛋白。如將在本文進一步詳細地討論，本發明的可溶性Toso蛋白包括Toso受體的全部或部分胞外結構域。本發明的可溶性Toso蛋白可進一步包括信號肽和/或Fc結構域。本發明的可溶性Toso蛋白可進一步包括Toso蛋白的變體胞外結構域，包括缺失變體（其中全胞外結構域的一個或多個氨基酸缺失的變體）和包含一個或多個氨基酸取代的變體。
[0103] 本發明進一步涉及通過向受試者施用可溶性Toso蛋白（或其變體）來治療病癥和疾病的方法。如將在本文進一步詳細地討論，本發明的可溶性Toso蛋白可用于治療患有但不限于以下各項的受試者：自身免疫性病癥（包括但不限于1型或2型糖尿病、多發性硬化癥或類風濕關節炎）、哮喘、過敏癥、慢性阻塞性肺病（"C0PD"）、高-IgM綜合癥、CLL、狼瘡或中性白細胞增多癥相關的病癥（包括但不限于中性粒細胞減少癥、重度先天性中性粒細胞減少癥、環狀中性粒細胞減少癥、抗體介導的中性粒細胞減少癥、網狀發育不良、白細胞粘附缺陷、常見骨髓增生性疾病、慢性髓細胞性白血病、常見感冒蕁麻疹和白細胞增多以及慢性肉芽腫病）。
[0104] II.可溶件Toso蛋白
[0105] 本發明的組合物包括調節Toso活性的藥劑。如將在下文進一步詳細地討論，這類組合物包括但不限于可溶形式的Toso蛋白。
[0106] 本發明的可溶性Toso蛋白（在本文還可互換地被稱為"可溶性Toso受體"、 "Toso-Fc"和"可溶性Toso多肽"）包括Toso受體的全部或部分胞外結構域。在其它實施方案中本發明的可溶性Toso蛋白包括信號結構域和/或Fc結構域。如將在本文進一步詳細地討論，可溶性Toso蛋白的這些組分可以任何方式在有或沒有另外組分和/或修飾的情況下組合以便提供本發明的可溶性Toso蛋白。
[0107] 一方面，本發明的可溶性Toso蛋白包含Toso的胞外結構域。在仍然另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含人Toso同種型a的胞外結構域。人Toso的胞外結構域預計跨越NP_005440. 1 (人Toso同種型a)的氨基酸P21至G251 (參見Shima等人，Int. Immunol.，2010,其特此出于所有目的并且特別是出于涉及Toso的胞外結構域的所有教導的目的而整體并入）。為清楚起見，本文的大多數討論涉及包含人Toso蛋白的全部或部分胞外結構域的可溶性Toso蛋白。然而，應理解來自任何物種的Toso蛋白的胞外結構域可用于產生根據本文描述的可溶性Toso蛋白，并且鑒別對應于本文所討論的人Toso蛋白的區的來自另一物種的Toso蛋白的區將是在本領域技術人員的能力范圍內。
[0108] 在一個實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :1的胞外結構域序列（其在圖10中示出）。在另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白與SEQ ID NO: 1具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性。在仍然另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有SEQ ID N0 :1中的 1-75、2-70、3-65、4-60、5-55、6-50、7-45、8-40、9-35、10-30、11-25、12-20、13-15、5-20、 6-18、8-16、10-14個氨基酸取代的多肽。在又另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有 SEQ ID N0 :1 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30個氨基酸取代的多肽。
[0109] 在一個實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :8的胞外結構域序列（其在圖27中示出）。在另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白與SEQ ID N0 :8具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性。在仍然另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有SEQ ID N0 :8中的 1-75、2-70、3-65、4-60、5-55、6-50、7-45、8-40、9-35、10-30、11-25、12-20、13-15、5-20、 6-18、8-16、10-14個氨基酸取代的多肽。在又另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有 SEQ ID N0 :8 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30個氨基酸取代的多肽。
[0110] 在另一實施方案中并且根據上述任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO :7的氨基酸18至253。在仍然另一實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO :7的氨基酸21至253。在仍然另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO: 7的氨基酸21至251。在又另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括來自SEQ ID NO :7 的任何以下范圍的氨基酸：1-255、5-245、10-235、15-225、20-215、25-205、30-195、35-185、 40-175、45-165、50-155、45-145、40-135、35-125、30-115、35-105、40-95、45-85、50-75、 55-65。在仍然另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID N0 :7的氨基酸18至 253 或 21 至 253 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %和100 %的序列同一性的序列。
[0111] 在仍然另一實施方案中并且根據上述任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包括圖 27中描繪的SEQ ID NO :8的全部或一部分。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso 蛋白包括 SEQ ID NO :8 的氨基酸 1-231、6-221、11-211、16-201、21-191、26-181、31-171、 36-161、41-151、46-141、51-131、56-121、61-111、66-101、71-91、76-81。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID NO :8的氨基酸區1-231、6-221、11-211、16-201、 21-191、26-181、31-171、36-161、41-151、46-141、51-131、56-121、61-111、66-101、71-91、 76-81 具有至少 70 %、75 %、80%、85 %、90 %、91 %、92 %、93%、94%、95 %、96%、97 %、 98%、99%和100%序列同一性的多肽。
[0112] 在又另一實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0:8、9、ll、13、15、 17、19、21和23中的任一個。在仍然另一實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID NO :8、9、11、13、15、17、19、21 和 23 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列同一性的序列。這些序列包括1'〇8〇受體的胞外結構域的缺失變體。
[0113] 在仍然其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包含Toso蛋白的全胞外結構域的缺失變體。在示例性實施方案中，為本發明的可溶性Toso 蛋白的組分的缺失變體包括以下氨基酸中的一個或多個已經從SEQ ID NO :8缺失的多肽： 1-21、1-35、1-87、區1-21和區211-231兩者、211-231、154-231、105-231 以及 93-231。在其它示例性實施方案中，為本發明的可溶性Toso蛋白的組分的缺失變體包括與以下氨基酸區中的一個或多個缺失的根據SEQ ID N0:8的多肽具有約70%、75%、80%、85%、90%、 91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一'注的多肽：1_21、1-35、 1-87、區 1-21 和區 211-231 兩者、211-231、154-231、105-231 以及 93-231。
[0114] 在其它實施方案中并且根據以上中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包括包含與Toso受體的配體結合的區的胞外結構域組分。在示例性實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包括與IgM結合的胞外結構域組分。在仍然另一實施方案中，本發明的可溶性 Toso蛋白包括SEQ ID N0 :8的氨基酸35至87。在其它示例性實施方案中，本發明的可溶性Toso 蛋白包括SEQ ID N0 :8 的氨基酸25-100、29-95、33-90、37-85、41-80、45-75、49-70、 53-65 或 57-60。
[0115] 在另一方面并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包括如以上所討論的胞外結構域組分并且進一步包括信號序列。在一個示例性實施方案中，所述信號序列增強從宿主細胞的分泌。在又另一實施方案中，所述信號序列包括但不限于選自以下各項的成員：IL_2信號序列、來自釀酒酵母的a-交配因子前序列、來自黑曲霉的a-淀粉酶信號序列、來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶信號序列、來自智人的血清白蛋白信號序列、來自馬克思克魯維酵母的菊粉酶信號序列、來自釀酒酵母的轉化酶信號序列、來自釀酒酵母的殺傷蛋白信號序列、來自原雞的溶菌酶信號序列。在仍然另一實施方案中，所述信號序列包含根據SEQ ID N0 :2的序列（其在圖10中示出）。在仍然另一實施方案中，所述信號序列包含與 SEQ ID N0:2 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%和100%的序列同一性的序列。在具體實施方案中，本發明的可溶性Toso 蛋白包含3￡〇10勵：1、8、9、11、13、15、17、21和23中的任一個或作為與5￡〇10勵：2或與同 SEQ ID N0:2 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %和100 %的同一性的序列的融合蛋白的那些序列的變體。
[0116] 在另一方面并且根據以上中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包含Toso受體的胞外結構域和Fc結構域。在一個示例性實施方案中，所述可溶性Toso蛋白是包含人Toso 蛋白的同種型A的胞外結構域和Fc結構域的融合蛋白。在另一實施方案中，所述Fc結構域包括如與無Fc結構域的蛋白質相比增強所述蛋白質的半衰期的任何結構域。在仍然另一實施方案中，所述Fc結構域包括如與無Fc結構域的蛋白質相比改善所述蛋白質的藥物代謝動力學曲線的任何結構域。在仍然另一實施方案中，所述Fc結構域源自C末端處的人 IgGl，在又另一實施方案中所述Fc結構域包括減弱或消除抗體依賴性和補體依賴性細胞毒性的突變。在仍然另一實施方案中，這類突變包括單獨地或以任何組合的以下突變中的一個或多個：E233P ;L234V ;L235A ; AG236 ;A327G ;A330S ;P331S。在又另一實施方案中，所述Fc結構域包含根據SEQ ID NO :3的序列（其在圖10中示出）。在仍然另一實施方案中，所述 Fc 結構域包含與 SEQ ID N0:3 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性的序列。
[0117] 在其它示例性實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包含含有胞外結構域組分和Fc結構域組分兩者的融合蛋白。在仍然其它示例性實施方案中，本發明的可溶性Toso 蛋白包含3￡〇10勵：1、8、9、11、13、15、17、21和23或作為與5￡〇10勵：3或與同5￡〇10 N0 :3 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99 %和100 %的同一性的序列的融合蛋白的那些序列的變體。
[0118] 在一方面并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包含細胞外Toso 結構域、信號序列和Fc結構域一那些組分各自可包含以任何組合的這些組分的任何上述型式。在仍然另一實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :5的序列 (其在圖8中示出）。在仍然另一實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID N0: 5 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和100 %的序列同一性的序列。
[0119] 在其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0. 10、12、14、16、18、20、22和24中的任一個的序列，其包含胞外結構域組分、信號序列和Fc結構域。在其它實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO. 10、 12、14、16、18、20、22、和24具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列問一性的序列。
[0120] 在其它方面并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白可進一步包括在Toso胞外結構域組分與Fc結構域之間、在Toso胞外結構域組分與信號序列之間或在 Toso胞外結構域組分與Fc結構域之間和Toso胞外結構域組分與信號序列兩者之間的接頭。在示例性實施方案中，這種接頭可以是可有效于將兩個氨基酸序列連接在一起的氨基酸接頭、聚合物接頭或本領域已知任何其它接頭。在其它示例性實施方案中，所述接頭是氨基酸接頭。在仍然其它實施方案中，所述接頭是氨基酸序列：ISAMVRS(SEQ ID N0:25)。在又其它實施方案中，所述接頭是含有1、2、3、4、5或6個氨基酸取代的SEQ ID N0:25的變體。
[0121] 在其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白的變體可通過本文所討論的任何可溶性Toso蛋白的氨基酸序列（包括SEQ ID N0. 5、6或8-24)的修飾來制備。可使用本領域中的任何已知技術，例如定點誘變或基于PCR的誘變來實現這類修飾。這類技術例如描述于 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. , 1989 和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，New York, N.Y.，1989 中，所述文獻各自出于所有目的并且特別是出于涉及形成蛋白質變體的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0122] 在仍然其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白可以呈單體形式或多聚體形式，其中多聚體的每個單體包含單個胞外結構域序列。在其它實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白是呈2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個單體的多聚體形式。在一個具體實施方案中，可溶性Toso蛋白是6個單體的多聚體。在另一實施方案中，六聚Toso多聚體是由包含六聚化標簽的單體形成。在另一實施方案中，六聚化標簽包含來自人IgAa重鏈恒定區的21氨基酸尾片段，如Hirano等人，Blood(2006)中所描述，所述文獻特此出于所有目的并且特別是出于涉及六聚化標簽或其它多聚化標簽的所有教導的目的而以引用的方式并入。在又另一實施方案中，本發明的六聚化標簽包括根據圖10中所不的SEQ ID N0 :4的序列。
[0123] 在其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白進行修飾以便改變所述蛋白的一種或多種功能特性。在示例性實施方案中，所述可溶性Toso進行化學修飾。例如，所述可溶性Toso蛋白可用一種或多種聚合物進行修飾以便改進其體內穩定性和/或改變其藥物代謝動力學曲線。這類聚合物包括但不限于以美國專利號 4,640,835 ;4, 496, 689 ;4, 301，144 ;4, 670, 417 ;4, 791，192 ;或 4, 179,337 中列出的方式的多種非蛋白質聚合物中的一種或多種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，所述專利全部特此出于所有目的并且特別是出于涉及將蛋白質連接至聚合物的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0124] 本發明的范圍內包括的Toso可溶性蛋白質的修飾包括使根據以上所討論的任何序列和可溶性Toso蛋白的Toso多肽的祀向氨基酸殘基與能夠與Toso多肽的選定側鏈或 N或C末端殘基反應的有機衍生化試劑反應。常用的交聯劑包括例如1，1_雙（重氮乙酰基）-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸的酯；同質雙官能亞氨酸酯（homobifunctional imidoester)，包括二琥拍酰亞氨基酯，如3, 3'-二硫代雙（琥珀酰亞氨基丙酸酯）；雙官能馬來酰亞胺，如雙-N-馬來酰亞胺基-1，8-辛烷；以及劑如甲基 -3-[(p-疊氮基苯基）二硫代]丙亞氨酸酯。
[0125] 其它修飾包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基殘基分別脫酰胺成相應谷氨酰基和天冬氨酰基殘基，脯氨酸和賴氨酸的羥基化、絲氨酰基或蘇氨酰基殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的氨基的甲基化[T.E. Creighton, Proteins :Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco,第 79-86 頁（1983)]，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。
[0126] 本發明的范圍內包括的可溶性Toso蛋白的另一種類型的修飾包括改變多肽的天然糖基化模式。"改變天然糖基化模式"在本文為此意圖意指缺失在天然序列Toso多肽中發現的一個或多個碳水化合物部分和/或添加未存在于所述天然序列Toso多肽中的一個或多個糖基化位點。
[0127] 添加糖基化位點至Toso可溶性蛋白質可通過改變其氨基酸序列來完成。改變可例如通過向所述可溶性Toso蛋白的天然序列中添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基或取代所述可溶性Toso蛋白的天然序列的一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行（針對0-連接糖基化位點）。可溶性Toso蛋白氨基酸序列可任選地通過DNA層次上的變化來改變，尤其通過使編碼所述Toso可溶性蛋白質的DNA在預選的堿基處突變以使得產生將翻譯成所需氨基酸的密碼子。
[0128] 增加Toso可溶性蛋白質上的碳水化合物部分的數目的另一手段是通過使糖苷化學或酶偶聯于多肽。這類方法在本領域中進行描述，例如描述于1987年9月11日公布的 W0 87/05330 中以及 Aplin 和 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem?，第 259-306 頁（1981)中，所述文獻特此出于所有目的并且特別是出于涉及改變蛋白質上的碳水化合物部分的所有教示的目的而以引用的方式整體并入。
[0129] 去除存在于可溶性Toso蛋白上的碳水化合物部分可化學地或酶促地完成或通過編碼充當糖基化靶標的氨基酸殘基的密碼子的突變取代來完成。化學去糖基化技術是本領域已知的并且例如由 Hakimuddin 等人，Arch. Biochem. Biophys.，259 :52 (1987)和由 Edge 等人，Anal. Biochem.，118 :131 (1981)描述。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通過使用如由Thotakura等人，Meth. Enzymol.，138 :350(1987)所描述的多種內糖苷酶和外糖苷酶來實現，所述文獻特此出于所有目的并且特別是出于涉及改變蛋白質上的碳水化合物部分的所有教示的目的而以引用的方式整體并入。
[0130] 本發明的可溶性Toso蛋白還可以形成包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的蛋白質的嵌合分子的方式進行修飾。在一個實施方案中，這種嵌合分子包含可溶性Toso 多肽與提供抗標簽抗體可選擇性地結合的表位的標簽多肽的融合。表位標簽通常位于Toso 多肽的氨基或羧基末端處。可使用針對標簽多肽的抗體來檢測Toso多肽的這類表位標記形式的存在。此外，提供表位標簽使能夠使用抗標簽抗體或與所述表位標簽結合的另一種類型的親和力基質通過親和純化來容易地純化所述Toso多肽。在一個替代實施方案中，嵌合分子可包含Toso多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區的融合。對于所述嵌合分子的二價形式來說，這種融合可以是與IgG分子的Fc區的融合或GST融合。
[0131] 各種標簽多肽及其對應抗體是本領域中熟知的。實例包括聚_組氨酸（聚-his) 或聚-組氨酸-甘氨酸（聚-his-gly)標簽；流感HA標簽多肽及其抗體12CA5[Field 等人，Mol. Cell Biol.，8 :2159-2165(1988)] ;c-myc 標簽及其上的 8F9、3C7、6E10、G4、 B7 和 9E10 抗體[Evan 等人，Molecular and Cellular Biology，5 :3610_3616 (1985)]; 以及單純皰疫病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體[Paborsky等人，Protein Engineering, 3 (6) :547-553 (1990)]。其它標簽多肽包括 Flag-肽[Hopp 等人，BioTechnology，6 : 1204-1210(1988)] ;KT3 表位肽[Martin 等人，Science，255:192-194 (1992)];微管蛋白表位肽[Skinner 等人，J. Biol. Chem.，266 :15163-15166(1991)];以及 17 基因 10 蛋白質肽標簽[Lutz-Freyermuth 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87 ;6393_6397 (1990)]。
[0132] 在其它實施方案中并且根據上述中的任一項，本發明的可溶性Toso蛋白是與細胞穿透肽融合。
[0133] 在其它方面，本發明涵蓋編碼一種或多種可溶性Toso蛋白的核酸以及包含這類核酸的宿主細胞。在某些實施方案中，根據本發明使用的宿主細胞包括但不限于J1EK293F、 HEK298T、Cos7、HeLa和CH0-DHFR缺陷的細胞。在仍然其它實施方案中，本發明的可溶性 Toso蛋白在已進行修飾以便在不含血清的懸浮液中生長的細胞系中穩定表達。
[0134] 在其它方面，本發明的組合物可包含本文所討論的任何可溶性Toso蛋白連同添加劑和藥學上可接受的載體。如本文所用，"藥學上可接受的載體"包括當與綴合物組合時保留所述綴合物的活性并且不與受試者的免疫系統反應的任何材料。實例包括但不限于任何標準的藥物載體，如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳劑（如油/水乳劑），以及各種類型的潤濕劑。其它載體還可包括無菌溶液，片劑（包括糖衣片劑）和膠囊。通常這類載體包含賦形劑，如淀粉、奶、某些類型的白土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物油脂或油、樹膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。這類載體還可包括調味劑和顏色添加劑或其它成分。包含所述載體的組合物是通過熟知的常規方法進行配制。
[0135] III. Toso 的抗體
[0136] 一方面，本發明提供結合Toso蛋白的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體增加Toso活性。在其它實施方案中，本發明的抗體減少Toso活性。
[0137] 制備抗體的方法通常是本領域中已知的。例如，美國專利號6, 727, 350公開了針對Toso的抗體，所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及針對Toso蛋白的抗體的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0138] 本發明的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或其衍生物或片段，如以下所定義。一方面，片段包含抗體的CDR或可替代地基本上由抗體的CDR的組成或更進一步由抗體的CDR組成。一方面，本發明的抗體是可檢測地標記的或進一步包含與它綴合的可檢測標記。還提供一種產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。本文進一步提供包含上述實施方案中的一個或多個的組合物。
[0139] 還提供包含一種包含所述抗體和載體的組合物。進一步提供所述抗體的一種生物活性片段或一種包含所述抗體片段的組合物。合適的載體在上文中定義。
[0140] 進一步提供一種包含所述抗體和與所述抗體特異性地結合的多肽、或可替代地基本上由所述抗體和與所述抗體特異性地結合的多肽組成或還可替代地由所述抗體和與所述抗體特異性地結合的多肽組成的抗體-肽復合物。一方面，所述多肽是針對其產生所述抗體的嵌合多肽。
[0141] 本發明還提供一種能夠與Toso特異性地形成復合物的抗體，所述抗體適用于本發明的治療性方法中。本發明的抗體包括但不限于小鼠、大鼠和兔或人抗體。抗體可在細胞培養物中、在噬菌體中或在各種動物中產生，所述動物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩、猿等。所述抗體還適用于鑒別和純化治療性多肽。
[0142] 本發明還提供一種包含上述抗體和與所述抗體特異性地結合的多肽、或可替代地基本上由上述抗體和與所述抗體特異性地結合的多肽組成或還可替代地由上述抗體和與所述抗體特異性地結合的多肽組成的抗體-肽復合物。一方面，所述多肽是針對其產生所述抗體的多肽。一方面，所述抗體-肽復合物是分離的復合物。另一方面，所述復合物的抗體是但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體或本文所描述的抗體衍生物。所述抗體-肽復合物的抗體或肽中的任一者或兩者可被可檢測地標記或進一步包含與它綴合的可檢測標記。一方面，本發明的抗體-肽復合物可用作診斷測定或篩選測定中的對照或參比樣本。
[0143] 本發明的多克隆抗體可使用本領域中已知的常規技術來產生并且在文獻中進行了充分描述。存在一些方法學用于產生多克隆抗體。例如，多克隆抗體通常通過適合哺乳動物的免疫來產生，所述哺乳動物如不限于雞、山羊、豚鼠、倉鼠、馬、美洲駝、小鼠、大鼠和兔。抗原被注射至所述哺乳動物中，所述抗原誘導B淋巴細胞產生對所述抗原具有特異性的IgG免疫球蛋白。這種IgG是從哺乳動物的血清純化的。這種方法學的變化形式包括佐齊U、施用途徑和部位、每部位注射體積和每動物部位的數目的修改以獲得動物的最佳產生和人性化治療。例如，佐劑通常用于改進或增強對抗原的免疫應答。大多數佐劑提供注射部位抗原儲庫，其允許抗原緩慢釋放至引流淋巴結中。其它佐劑包括促進蛋白質抗原分子在較大表面面積上的和免疫刺激分子的濃縮的表面活性劑。用于多克隆抗體產生的佐劑的非限制性實例包括弗氏佐劑、Ribi佐劑系統和Titermax。多克隆抗體可使用美國專利號 7, 279, 559 ;7, 119, 179 ;7, 060, 800 ;6, 709, 659 ;6, 656, 746 ;6, 322, 788 ;5, 686, 073 ;和 5, 670, 153中描述的方法來產生，所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及抗體的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0144] 本發明的單克隆抗體可使用本領域中已知的和文獻中充分描述的常規雜交瘤技術來產生。例如，雜交瘤是通過使合適的無限增殖細胞系（例如，骨髓瘤細胞系如但不限于5?2/0、5?2/0-六614、呢0、呢1、呢2、六￡-1、1.5、> 243、？3父63六§8.653、5?2 5六3、5?2嫩1、Sp2 SSl、Sp2 SA5、U397、MLA 144、ACT IV、M0LT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、C0S、RAJI、 NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEUR0 2A、CH0、PerC.6、YB2/0)或類似物、或雜合骨髓瘤、其融合產物、或源自其的任何細胞或融合細胞、或如本領域中已知的任何其它適合的細胞系（參見，例如在2007年11月26日最后一次訪問的www. atcc. org，www. lifetech. com. 等）與以下各項融合來產生：產生抗體的細胞，如但不限于分離的或克隆的脾細胞、外周血細胞、淋巴細胞、扁桃體細胞、或其它免疫細胞或含有B細胞的細胞；或表達重鏈或輕鏈恒定區或可變序列或框架序列或CDR序列的任何其它細胞來產生，作為內源或異源核酸、作為重組或內源病毒、細菌、藻類、原核生物、兩棲動物、昆蟲、爬行動物、魚、哺乳動物、嚙齒動物、馬、綿羊、山羊、綿羊、靈長類動物、真核生物、基因組DNA、cDNA、rDNA、線粒體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、單鏈、雙鏈或三鏈、雜合的等或其任何組合。產生抗體的細胞還可從已用目標抗原進行免疫的人或其它合適的動物的外周血或優選地脾或淋巴結獲得。任何其它合適的宿主細胞還可用于表達編碼本發明的抗體、其特定片段或變體的異源或內源核酸。融合的細胞（雜交瘤）或重組細胞可使用選擇性培養條件或其它合適的已知方法進行分離，并且通過有限稀釋或細胞分選或其它已知方法進行克隆。
[0145] 在一個實施方案中，本文描述的抗體可使用多抗原肽（MAP)系統來產生。MAP系統使用三個或七個徑向分支的賴氨酸殘基的肽基核心，可使用標準固相化學在所述肽基核心上構建目標抗原肽。取決于通常占總分子量的小于10%的內核，賴氨酸核心產生攜帶肽表位的約4至8個拷貝的MAP。所述MAP系統不需要用于綴合的載體蛋白。MAP中的抗原表位的多個拷貝的高摩爾比和致密填充已經顯示產生強免疫原性應答。這一方法描述于美國專利號5, 229, 490中并且出于所有目的且特別是出于涉及MAP系統的所有教導的目的而以引用的方式整體并入本文。
[0146] 可以使用產生或分離具有所需特異性的抗體的其它合適的方法，包括但不限于使用本領域已知的方法從肽或蛋白質文庫（例如但不限于，噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA等展示文庫；例如，如從各種商業銷售商如Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)、MorphoSys(Martinsreid/Planegg, Del.)、 Biovation (Aberdeen，Scotland，UK)、Bioinvent (Lund，Sweden)可獲得）選擇重組抗體的方法。參見美國專利號 4, 704, 692 ;5, 723, 323 ;5, 763, 192 ;5, 814, 476 ;5, 817, 483 ; 5, 824, 514 ;5, 976, 862,所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及與抗體有關的方法的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。替代方法依賴于如本領域中已知和/或如本文所描述的能夠產生人抗體的譜系的轉基因動物的免疫（例如SCID小鼠，Nguyen等人（1997)Microbiol. Immunol. 41 :901_907 ;Sandhu等人（1996)Crit. Rev. Biotechnol. 16 : 95-118 ;Eren等人（1998) Immunol. 93 :154-161)。這類技術包括但不限于核糖體展示 (Hanes 等人（1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 ;Hanes 等人（1998)?1~〇。. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135);產生單細胞抗體的技術（例如，選擇的淋巴細胞抗體方法（"SLAM"）（美國專利號 5, 627, 〇52, Wen 等人（I987) J. Immunol. I7 :887-892 ; Babcook 等人（1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848);凝膠微滴和流式細胞術 (Powell 等人（1990)Biotechnol.8 :333_337 ;單個細胞系統（Cambridge，Mass) ;Gray 等人 (1995) J. Imm.Meth. 182 :155-163 ;和 Kenny 等人（1995) Bio. Technol. 13 :787-790) ;B 細胞選擇（Steenbakkers 等人（1994)Molec.Biol. Reports 19:125-134,其特此出于所有目的并且特別是出于涉及用于產生抗體的方法的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0147] 本發明的抗體衍生物還可通過將編碼本發明的抗體的多核苷酸遞送至適合的宿主以便提供在其奶中產生這類抗體的轉基因動物或哺乳動物（如山羊、牛、馬、綿羊等）來制備。這些方法是本領域中已知的并且描述于例如美國專利號5, 827, 690 ;5, 849, 992 ; 4,873,316 ;5, 849, 992 ;5, 994, 616 ;5, 565, 362 ;和 5,304,489 中，所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及產生抗體的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0148] 術語"抗體衍生物"包括對抗體或片段的線性多肽序列的翻譯后修飾。例如，美國專利號6, 602, 684 B1 (其特此出于所有目的并且特別是出于涉及抗體的修飾的所有教導的目的而以引用的方式整體并入）描述了一種用于產生修飾的二醇形式的抗體的方法和如此產生的糖蛋白，所述抗體包括完整抗體分子、抗體片段或融合蛋白（其包括等效于免疫球蛋白的Fc區的區）、具有增強的Fc介導的細胞毒性。
[0149] 抗體衍生物還可通過遞送本發明的多核苷酸以便提供在植物部分中或在自其培養的細胞中產生這類抗體、指定部分或變體的轉基因植物和培養的植物細胞（例如但不限于煙草、玉蜀黍和浮萍）來制備。例如，Cramer等人（1999)Curr.Top.Microbol. Immunol. 240 :95-118和在其中引用的參考描述了例如使用可誘導的啟動子產生表達大量重組蛋白的轉基因煙草葉。轉基因玉蜀黍已經用于以商業生產水平表達哺乳動物蛋白質，所述蛋白質具有等效于在其它重組系統中產生或從天然來源純化的那些的生物活性。參見，例如Hood等人（1999)Adv. Exp. Med. Biol. 464 :127-147和在其中引用的參考文獻。抗體衍生物還已經自包括抗體片段如單鏈抗體（scFv' s)的轉基因植物種子，包括煙草種子和馬鈴薯塊莖大量產生。參見，例如Conrad等人（1998) Plant Mol. Biol. 38 :101-109和在其中引用的參考文獻。因此，本發明的抗體還可根據已知方法使用轉基因植物產生。
[0150] 抗體衍生物還可例如通過添加外源序列以便修飾免疫原性或減少、增強或修飾結合、親和力、結合速率（〇n-rate)、解離速率（off-rate)、親合力、特異性、半衰期或任何其它合適的特征來產生。通常部分或全部非人或人CDR序列被維持，而可變區和恒定區的非人序列被人或其它氨基酸置換。
[0151] 一般來說，CDR殘基（抗體片段的實例）直接并且最實質性地參與影響抗原結合。本發明的抗體的人源化或工程化可使用任何已知方法來進行，所述方法如但不限于美國專利號 5, 723, 323 ;5, 976, 862 ;5, 824, 514 ;5, 817, 483 ;5, 814, 476 ;5, 763, 192 ;5, 723, 323 ; 5, 766, 886 ；5, 714, 352 ；6, 204, 023 ；6, 180, 370 ；5, 693, 762 ；5, 530, 101 ；5, 585, 089 ； 5, 225, 539 ;和4, 816, 567中所描述的那些，所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及抗體的人源化或工程化的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0152] 用于制備部分至完全人抗體的技術是本領域中已知的并且可使用任何這類技術。根據一個實施方案，在已經工程化以便表達人重鏈和輕鏈抗體基因的轉基因小鼠中制備完全人抗體序列。已經制備了可產生不同類別的抗體的這類轉基因小鼠的多種品系。可融合來自正在產生所希望的抗體的轉基因小鼠的B細胞以便制備用于持續產生所需抗體的雜交瘤細胞系。（參見例如，Russel等人（2000)Infection and Immunity 68(4) :1820-1826;Gallo 等人（2000)European J. of Immun. 30:534-540 ;Green(1999) J. of Immun.Methods 231:11-23 ;Yang 等人（1999A)J. of Leukocyte Biology 66: 401-410 ；Yang (1999B)Cancer Research 59(6) ：1236-1243 ；Jakobovits (1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31 ：33-42 ；Green&Jakobovits(1998)J. Exp.Med. 188 (3)： 483-495 ;Jakobovits(1998)Exp. Opin. Invest. Drugs7(4) :607_614;Tsuda 等人（1997) Genomics 42 :413_421 ;Sherman_Gold(1997)Genetic Engineering News 17(14) ；Mendez 等人（1997)Nature Genetics 15:146-156 ;Jakobovits(1996)Weir，s Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System 第 IV 卷，194.1-194. 7 ; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology6:561_566;Mendez 等人（1995) Genomics 26:294-307 ;Jakobovits(1994)Current Biology 4(8) :761_763;Arbones 等人（1994) Immunityl (4) :247-260; Jakobovits (1993) Nature 362 (6417) :255-258; Jakobovits 等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6) :2551-2555;以及美國專利號 6, 075, 181。）
[0153] 本發明的抗體還可以進行修飾以便產生嵌合抗體。嵌合抗體是其中抗體的重鏈和輕鏈的不同結構域由來自多于一種物種的DNA編碼的那些抗體。參見，例如美國專利號 4, 816, 567。
[0154] 或者，本發明的抗體還可以進行修飾以便產生貼面化（veneered)抗體。貼面化抗體是其中一種物種的抗體的外部氨基酸殘基被審慎地置換或被第二物種的氨基酸殘基"貼面化"以使得所述第一物種的抗體在所述第二物種中將不是免疫原性的，從而減少所述抗體的免疫原性的那些抗體。因為蛋白質的抗原性主要依賴于其表面的性質，所以抗體的免疫原性可通過置換與通常在另一哺乳動物物種抗體中發現的那些殘基不同的所暴露的殘基來減少。外部殘基的這種審慎置換應對內部結構域或對結構域間接觸具有很少作用或不具有作用。因此，配體結合特性應不受局限于可變區框架殘基的改變的結果影響。所述過程被稱為"貼面化"，因為僅抗體的外表面或外皮被改變，支持殘基保持未受干擾。
[0155] 用于"貼面化"的程序利用由 Kabat 等人（1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版，Bethesda，Md.，國立衛生研究院匯編的人抗體可變結構域的可供使用的序列數據、對這一數據庫的更新以及其它可訪問的美國和外國數據庫（核酸和蛋白質兩者）。用于產生貼面化抗體的方法的非限制性實例包括EP 519596 ;美國專利號 6,797,492;并且描述于？3(11311等人（1991)]\1〇1.1臟1111〇1.28(4-5):489-498 中。
[0156] 術語"抗體衍生物"還包括為具有兩個抗原結合位點的小抗體片段的"雙鏈抗體"，其中片段包含在同一多肽鏈中與輕鏈可變結構域（VL)連接的重鏈可變結構域（VH)。（參見，例如 EP 404,097 ;W093/11161 ;和 Hollinger 等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci.USA90 : 6444-6448。）通過使用太短而不允許在同一鏈上的兩個結構域之間配對的接頭，迫使所述結構域與另一鏈的互補結構域配對并建立兩個抗原結合位點。（還參見，Chen等人的美國專利號6, 632, 926,所述專利公開了具有一個或多個氨基酸插入親本抗體的高變區中并且對靶抗原具有的結合親和力比所述親本抗體對所述抗原的結合親和力強至少約兩倍的抗體變體。）
[0157] 術語"抗體衍生物"進一步包括"線性抗體"。用于制備線性抗體的程序是本領域中已知的并且描述于Zapata等人（1995) Protein Eng. 8(10) : 1057-1062中。簡言之，這些抗體包含一對串聯Fd區段（Vh-Ch1-VH-Ch1)，所述區段形成一對抗原結合區。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。
[0158] 本發明的抗體可通過已知方法從重組細胞培養物回收并且純化，所述方法包括但不限于蛋白質A純化、硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰石色譜法和凝集素色譜法。高效液相色譜法（"HPLC"）也可以用于純化。
[0159] 本發明的抗體包括天然純化的產物、化學合成程序的產物以及通過重組技術從真核宿主（包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞）或可替代地從如上描述的原核細胞產生的產物。
[0160] 如果所測試的單克隆抗體與蛋白質或多肽結合，那么所測試的抗體和由本發明的雜交瘤提供的抗體是等效的。還有可能在無過度實驗的情況下確定抗體是否具有與本發明的單克隆抗體相同的特異性，方法是通過確定所測試的抗體是否防止本發明的單克隆抗體結合所述單克隆抗體通常與其反應的蛋白質或多肽。如果所測試的抗體與本發明的單克隆抗體競爭，如通過由本發明的單克隆抗體結合的減少所示，那么很可能兩種抗體結合相同或密切相關的表位。或者，可將本發明的單克隆抗體與它通常與其反應的蛋白質一起預孵育，并且確定所測試的單克隆抗體是否在其結合抗原的能力方面受到抑制。如果所測試的單克隆抗體受到抑制，那么很可能它與本發明的單克隆抗體具有相同或密切相關的表位特異性。
[0161] 術語"抗體"還意圖包括所有同種型的抗體。單克隆抗體的具體同種型可直接通過從初次融合選擇來制備，或使用描述于Steplewski等人（1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :8653 或 Spira 等人（1984) J. Immunol. Methods 74 :307 中的程序通過使用同胞（sib) 選擇技術以便分離類別轉換變體來從分泌不同同種型的單克隆抗體的親本雜交瘤繼發地制備。
[0162] 分泌具有本發明的單克隆抗體的特異性的單克隆抗體的其它雜交瘤的分離還可通過產生抗個體基因型抗體由本領域技術普通技術人員完成。Herlyn等人（1986) Science 232 :100。抗個體基因型抗體是識別存在于由目標雜交瘤產生的單克隆抗體上的獨特決定簇的抗體。
[0163] 兩個雜交瘤的單克隆抗體之間的個體基因型同一性證明所述兩種單克隆抗體是相對于其識別相同表位決定簇來說相同的。因此，通過使用單克隆抗體上的表位決定簇的抗體，有可能鑒別表達相同表位特異性的單克隆抗體的其它雜交瘤。
[0164] 還有可能使用抗個體基因型技術來產生模擬表位的單克隆抗體。例如，針對第一單克隆抗體制備的抗個體基因型單克隆抗體將在高變區中具有結合結構域，其是由所述第一單克隆抗體結合的表位的鏡像。因此，在這種情況下，抗個體基因型單克隆抗體可用于免疫以產生這些抗體。
[0165] 在本發明的一些方面，可檢測地或治療性地標記所述抗體將是有用的。用于使抗體綴合至這些藥劑的方法是本領域中已知的。僅出于說明的目的，可使用可檢測部分如放射性原子、生色團、熒光團等標記抗體。這類標記的抗體可用于診斷技術，體內抑或在分離的測試樣本中。
[0166] 抗體與低分子量半抗原的偶聯可增加抗體在測定中的靈敏度。半抗原然后可通過二次反應特異性地檢測。例如，通常使用半抗原如與抗生物素蛋白反應的生物素或二硝基酚、吡哆醛和熒光素，所述半抗原能夠與特異性抗半抗原抗體反應。參見，Harlow和 Lane (1988)同上。
[0167] 本發明的抗體還可與許多不同的載體結合。因此，本發明還提供含有所述抗體和另一種物質（活性或惰性）的組合物。熟知載體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。出于本發明的目的，載體的性質可以是可溶性的或不溶性的。本領域技術人員將了解用于結合單克隆抗體的其它合適的載體，并且將能夠使用常規實驗確定所述載體。
[0168] 在某些實施方案中，本發明的抗體包括在恒定區中的突變，如與無這類突變的抗體相比，所述突變改進所述抗體的藥物代謝動力學特性。這類抗體將在某些實施方案中包括源自C末端處的人IgGl的Fc結構域，所述抗體在又其它實施方案中包括減弱或消除抗體依賴性和補體依賴性細胞毒性的突變。在仍然另一實施方案中，這類突變包括單獨地或以任何組合的以下突變中的一個或多個：E233P ;L234V ;L235A ; AG236 ;A327G ;A330S ; P331S。在又另一實施方案中，所述Fc結構域包含根據SEQ ID NO :3的序列（其在圖10中示出）。在仍然另一實施方案中，所述Fc結構域包含與SEQ ID N0:3具有約70%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列同一性的序列。
[0169] 在其它實施方案中，在抗體的一個或多個CDR中進行一種或多種氨基酸修飾。一般來說，任何單個⑶R中僅取代1或2或3個氨基酸，并且通常一組⑶R內進行不超過4、5、 6、7、8、9或10個改變。然而應理解，任何⑶R中沒有取代、有1、2或3個取代的任何組合可獨立地且任選地地與任何其它取代相組合。
[0170] 在一些情況下，⑶R中的氨基酸修飾被稱為"親和力成熟"。"親和力成熟的"抗體是一個或多個CDR中具有一個或多個改變從而導致抗體對抗原的親和力相較于不具有那些一個或多個改變的親本抗體得到改進的抗體。在一些情況下，盡管很少見，可能需要減小抗體對其抗原的親和力，但這通常并不是優選的。
[0171] 可進行親和力成熟以使抗體對抗原的結合親和力相較于"親本"抗體增加至少約 10%至50-100-150%或更多，或1至5倍。優選的親和力成熟抗體將對靶抗原具有納摩爾級或甚至皮摩爾級親和力。親和力成熟抗體通過已知的程序產生。參見，例如Marks等人， 1992, Biotechnology 10 :779-783,其描述通過可變重鏈（VH)和可變輕鏈（VL)結構域改組的親和力成熟。⑶R和/或框架殘基的隨機誘變描述于：例如Barbas等人1994, Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91 :3809-3813 ;Shier 等人，1995, Gene 169 :147-155 ;Yelton 等人， 1995, J. Immunol. 155 :1994-2004 Jackson 等人，1995, J. Immunol. 154(7) :3310-9 ;以及 Hawkins 等人，1992, J. Mol. Biol. 226 :889-896 中。
[0172] 或者，可在本發明的抗體的一個或多個CDR中進行"沉默的"氨基酸修飾，例如不顯著改變抗體對抗原的親和力的修飾。這些修飾可出于許多原因進行，包括使表達最佳化 (如可對編碼本發明的抗體的核酸所做的修飾）。
[0173] 因此，本發明的⑶R和抗體的定義內包括變異⑶R和抗體；也就是說，本發明的抗體可包括Ab79和Abl9的一個或多個⑶R中的氨基酸修飾。此外，如以下概述，氨基酸修飾也可獨立地并且任選地地在⑶R以外的任何區，包括框架區和恒定區中進行。
[0174] 在一些實施方案中，本發明的抗體與藥物綴合以形成抗體-藥物綴合物（ADC)。一般來說，ADC用于腫瘤學應用中，在所述應用中使用抗體-藥物綴合物用于局部遞送細胞毒性或細胞生長抑制劑允許靶向遞送藥物部分至腫瘤，這可以允許更高的功效、更低的毒性等等。這種技術的綜述提供于Ducry等人，Bioconjugate Chem.，21 :5_13 (2010)、Carter等人，Cancer J. 14(3) : 154 (2008)和 Senter，Current Opin.Chem. Biol. 13 :235-244 (2009) 中，所述文獻特此出于所有目的并且特別是出于涉及抗體藥物綴合物的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0175] 因此，在一些實施方案中，本發明提供與藥物綴合的Toso抗體。通常，綴合是通過共價附接至抗體來進行，并且通常依賴于接頭，經常是肽鍵聯（如本領域中所已知，肽鍵聯可被設計成對靶位點處的蛋白酶裂解敏感或不敏感）。另外，如上所述，可通過附接至抗體內的半胱氨酸來進行接頭-藥物單元（LU-D)的鍵聯。如本領域技術人員將理解，每個抗體的藥物部分的數量可取決于反應的條件而變化，并且可在1 : 1至10 : 1藥物：抗體之間變化。如本領域技術人員將理解，實際數量是平均值。
[0176] 提供了可以是任何數量的藥劑的ADC的藥物，所述藥劑包括但不限于細胞毒性齊U，如化學治療劑、生長抑制劑、毒素（例如，細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段），或放射性同位素（即，放射性綴合物）。在其它實施方案中，本發明進一步提供了使用所述ADC的方法。
[0177] 用于在本發明的抗體-藥物綴合物中使用的藥物包括細胞毒性藥物，特別是用于癌癥治療的那些。所述藥物通常包括：DNA損傷劑、抗代謝物、天然產物以及它們的類似物。細胞毒性劑的示例性類別包括：酶抑制劑，如二氫葉酸還原酶抑制劑和胸苷酸合酶抑制劑； DNA嵌入劑、DNA裂解劑、拓撲異構酶抑制劑、蒽環霉素（anthracycline)家族的藥物、長春藥物、絲裂霉素（mitomycin)、博來霉素（bleomycin)、細胞毒性核苷、蝶陡（pteridine)家族的藥物、烯二炔、鬼臼毒素、多拉司他汀（dolastatin)、類美登醇（maytansinoid)、分化誘導劑、以及紫杉醇（taxol)。
[0178] 這些類別的成員包括，例如：甲氨蝶呤（methotrexate)、甲蝶呤 (methopterin)、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿啼陡（5-fluorouracil)、6_巰基噪呤、阿糖胞苷（cytosine arabinoside)、美法侖（melphalan)、長春羅新（leurosine)、長春羅新地新（leurosideine)、放線菌素（actinomycin)、柔紅霉素（daunorubicin)、阿霉素 (doxorubicin)、絲裂霉素 C、絲裂霉素 A、卡柔比星（caminomycin)、氨蝶呤（aminopterin)、他利霉素（tallysomycin)、鬼臼毒素以及鬼臼毒素衍生物（如依托泊苷（etoposide)或磷酸依托泊苷）、長春堿（vinblastine)、長春新堿（vincristine)、長春地辛（vindesine)、紫杉燒（taxane)(包括紫杉醇（taxol)、泰索帝（taxotere)視黃酸、丁酸、N8-乙酰基亞精胺、喜樹喊（camptothecin)、卡奇霉素（calicheamicin)、埃斯波霉素（esperamicin)、烯二塊、多卡米新（duocarmycin)A、多卡米新SA、卡奇霉素、喜樹堿、類美登醇（包括DM1)、甲基澳瑞他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)、甲基澳瑞他汀F(MMAF)以及類美登醇（DM4)以及它們的類似物。
[0179] 毒素可以用作抗體-毒素綴合物，并且包括細菌毒素，如白喉毒素；植物毒素，如菌麻毒素；小分子毒素，如格爾德毒素（861(^1^1115^;[11)(1&111(1161'等人（2000)]\似1:. Cancer Inst.92(19) :1573-1581 ;Mandler 等人（2000)Bioorganic&Med.Chem. Letters 10 :1025-1028 ;Mandler 等人（2002)Bioconjugate Chem. 13 :786-791);類美登醇（EP 1391213 ;Liu 等人（1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :8618-8623)，以及卡奇霉素（Lode 等人（l"8) Cancer Res. 58 :2928 ;Hinman 等人（I993) Cancer Res. 53 :3336-3342)。毒素可通過包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制的機制來施加它們的細胞毒性作用和細胞生長抑制作用。
[0180] 涵蓋Toso抗體與一種或多種小分子毒素（如類美登醇、多拉司他汀、澳瑞他汀、單端孢霉烯、卡奇霉素以及CC1065)和具有毒素活性的這些毒素的衍生物的綴合物。
[0181] 根據上述中的任一項，可對本發明的抗體進行的另一種類型的修飾是糖基化中的改變。在另一個實施方案中，本文公開的抗體可被修飾以便包括一種或多種工程化糖型 (glycoform)。如本文所用的"工程化糖型"意思是共價附接至抗體的碳水化合物組成，其中所述碳水化合物組成在化學上不同于親本抗體的碳水化合物組成。工程化糖型可適用于多種目的，包括但不限于增強或減弱效應子功能。工程化糖型的示例性形式是無巖藻糖基化（afucosylation)，其已被證實與ADCC功能的增加相關，這可能是通過與Fc Y Rllla受體的較緊密結合而實現。在這種情形下，"無巖藻糖基化"意思是宿主細胞中產生的大多數抗體大致上不含巖藻糖，例如90-95-98%的所產生抗體中沒有可觀量的巖藻糖作為抗體的碳水化合物部分的組分（通常附接在Fc區中的N297處）。功能上定義的無巖藻糖基化抗體通常表現出對FcyRIIla受體至少50%或更高的親和力。
[0182] 工程化糖型可通過本領域中已知的各種方法產生（Umana等人，1999, Nat Biotechnol 17:176-180 ;Davies 等人，2001，Biotechnol Bioeng74:288_294;Shields 等人，2002, J Biol Chem 277:26733-26740 ;Shinkawa 等人，2003, J Biol Chem 278: 3466-3473 ;美國專利號6, 602, 684 ;美國序列號10/277, 370 ;美國序列號10/113, 929 ;PCT W000/61739A1 ;PCT TO 01/29246A1 ;PCT TO 02/31140A1 ;PCT TO02/30954A1，它們全部出于所有目的并且特別是出于涉及工程化糖型的所有教導的目的以引用的方式整體并入。這些技術中的許多技術是基于控制共價附接至Fc區的巖藻糖基化和/或平分型寡糖的水平，例如通過于各種工程化的或其它生物體或細胞系（例如Lec-13CH0細胞或大鼠雜交瘤 YB2/0細胞）中表達IgG、通過調控涉及糖基化途徑的酶（例如FUT8[a 1，6_巖藻糖基轉移酶]和/或0 1-4-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶111[0111'111])、或通過在1§6被表達之后修飾一種或多種碳水化合物來進行控制。例如，Seattle Genetics的"糖工程化抗體"或"SEA 技術"通過添加抑制產生期間的巖藻糖基化的修飾的糖而起作用；參見例如20090317869，其特此以引用的方式整體并入本文。工程化糖型通常是指不同碳水化合物或寡糖；因此抗體可包括工程化糖型。
[0183] 或者，工程化糖型可指包含不同碳水化合物或寡糖的變體。如本領域中所已知，糖基化模式可取決于蛋白質的序列（例如存在或不存在以下所論述的特定糖基化氨基酸殘基）或產生蛋白質所處的宿主細胞或生物體兩者。具體表達系統是本領域中已知的并且在本文進行了論述
[0184] 多肽的糖基化通常是N-連接的糖基化或0-連接的糖基化。N-連接的是指碳水化物部分附接至天冬酰胺殘基的側鏈。其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是碳水化物部分酶促附接至天冬酰胺側鏈的識別序列。因此，多肽中存在這些三肽序列中的任一者都會產生潛在糖基化位點。0-連接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者附接至羥基氨基酸，最通常是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
[0185] 向抗體（或向任何其它多肽，如以上所論述的可溶性Toso蛋白）添加糖基化位點宜通過改變氨基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一個或多個來完成（針對N-連接的糖基化位點）。改變也可通過向起始序列中添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基或取代起始序列的一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行（針對〇-連接的糖基化位點）。為方便起見，抗體氨基酸序列優選通過DNA層次上的變化來改變，尤其通過使編碼靶多肽的DNA在預選的堿基處突變以使得產生將翻譯成所需氨基酸的密碼子。
[0186] 增加抗體上的碳水化合物部分的數目的另一手段是通過使糖苷化學或酶促偶聯至蛋白質來達成。這些程序是有利的，因為它們不需要在具有N-連接的糖基化和0-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。取決于所使用的偶聯模式，一種或多種糖可附接至（a)精氨酸和組氨酸，（b)游離羧基，（c)游離硫氫基，如半胱氨酸的游離硫氫基，（d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的游離羥基，（e)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基，或（f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法描述于W0 87/05330及 Aplin和 Wriston，1981，CRC Crit. Rev. Biochem?，第 259-306 頁中，兩者全部出于所有目的并且特別是出于涉及將碳水化合物部分偶聯至蛋白質的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0187] 起始抗體上存在的碳水化合物部分的去除（例如翻譯后）可用化學方法或酶方法實現。化學去糖基化需要蛋白質暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。這種處理導致除連接糖（N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺）之外的大多數或全部糖裂解，同時保持多膚完整。化學去糖基化由 Hakimuddin等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 :52和Edge 等人，1981，Anal. Biochem. 118 :131描述，兩者以引用的方式整體并入。多肽上的碳水化合物部分的酶裂解可通過如由Thotakura等人，1987, Meth. Enzymol. 138 :350所描述使用各種內切糖苷酶和外切糖苷酶來實現，所述文獻以引用的方式整體并入。可通過如由Duskin 等人，1982, J. Biol. Chem. 257 :3105所描述使用化合物衣霉素（tunicamycin)來防止潛在糖基化位點處的糖基化。衣霉素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵聯的形成。
[0188] 另一類型的抗體共價修飾包括以例如Nektar Therapeutics的2005-2006PEG目錄（可從 Nektar 網站獲得）美國專利號 4, 640, 835、4, 496, 689、4, 301，144、4, 670, 417、 4, 791，192或4, 179, 337中提及的方式將抗體連接至各種非蛋白質聚合物，包括但不限于各種多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，所述文獻都出于所有目的并且特別是出于涉及將抗體連接至聚合物的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。此外，如本領域中所已知，氨基酸取代可于抗體內的各種位置上進行以促進如PEG的聚合物的添加。參見例如，美國公布號2005/0114037A1，其以引用的方式整體并入。
[0189] 本發明進一步包括編碼本發明的Toso抗體的核酸。在重鏈恒定結構域和輕鏈恒定結構域均包括于抗體中的情況下，通常使用編碼各自的核酸來制作這些恒定結構域，所述核酸被組合到標準宿主細胞（例如CH0細胞等）中，以便產生抗體的四聚體結構。如果制作僅一個恒定結構域，將使用僅單個核酸。
[0190] 根據本發明使用的抗體的制劑可通過將具有所需純度的抗體與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑（Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol， A.編輯[1980]) -起混合成凍干制劑或水溶液的形式來制備以供儲存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所采用的劑量和濃度下對接受者無毒性，并且包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑（如十八烷基二甲基節基氯化銨、氯化六經季銨（hexamethonium chloride)、氯化苯二甲輕銨（benzalkonium chloride)、氯化節甲乙氧銨（benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或節醇、對輕苯甲酸燒酯（如對羥苯甲酸甲酯或丙酯）、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇以及間-甲酚）；低分子量（小于約10個殘基）多肽；蛋白質，如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA ;糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉離子；金屬絡合物（例如Zn-蛋白質絡合物）；和/或非離子型表面活性劑，如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇（PEG)。
[0191] 本發明的制劑也可含有所治療的特定適應癥所需要的多于一種活性化合物，優選為具有互補活性并且不會不利地影響彼此的那些化合物。例如，可能需要提供具有其它特異性的抗體。或者或此外，組合物可包含細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑和/或小分子拮抗劑。這類分子適當地以對預期目的有效的量組合存在。
[0192] 所述活性成分也可圍堵在例如通過凝聚技術或界面聚合作用制備的微膠囊（例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚（甲基丙酸甲酯）微膠囊）中、膠狀藥物遞送系統（例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子及納米膠囊）中、或巨乳液中。這類技術公開于 Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol，A?編輯（1980)中。
[0193] 待用于體內施用的制劑應當無菌或接近無菌。這可通過經無菌過濾膜過濾來容易地實現。
[0194] 可制備持續釋放制劑。持續釋放制劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質，所述基質呈成形物品例如膜、或微膠囊的形式。持續釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠（例如聚（2-羥乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸（美國專利號 3, 773, 919)、L-谷氨酸與.Y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPR0NDEPOT'K'(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球）以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能夠釋放分子超過100天，而某些水凝膠釋放蛋白質持續較短的時間。
[0195] 當囊封的抗體保留在體內持續長時間時，其可能會因暴露于37°C下的濕氣而變性或聚集，從而使生物活性喪失且可能使免疫原性發生變化。可取決于所涉及的機制設計出合理策略以實現穩定。例如，如果發現聚集機制是通過硫代-二硫鍵交換而形成分子內 S--S鍵，那么可通過修飾巰基殘基、自酸性溶液凍干、控制濕氣含量、使用適當添加劑以及開發特定聚合物基質組合物來實現穩定。
[0196] IV.調節Toso活件的方法
[0197] 一方面，本發明涉及調節Toso活性的方法。在一個實施方案中，調節Toso活性的方法包括抑制Toso活性。在其它實施方案中，調節Toso活性的方法包括增加Toso活性。
[0198] 在一些實施方案中，本發明的方法直接涉及調節Toso活性。在一個示例性實施方案中，所述方法包括應用結合Toso的藥劑如抗體。
[0199] 在其它實施方案中，間接地調節Toso活性，例如通過結合Toso的同源配體來調節 Toso活性。在一個示例性實施方案中，通過施用可溶性Toso蛋白來調節Toso活性。
[0200] 在其它實施方案中，通過多種機制的組合來調節Toso活性，例如通過施用包含結合Toso的藥劑的組合物與包含結合Toso的同源配體的藥劑的組合物的組合來調節Toso 活性。在一個示例性實施方案中，這種組合物可包括但不限于Toso抗體和可溶性Toso蛋白。
[0201] 如將理解，調節Toso活性的方法可包括使用以任何組合的本文所描述的任何組合物，包括SEQ ID N0. 1-25中的任何一個或多個以及如本文所描述的其任何變體或修飾。
[0202] V.治療病癥的方法
[0203] -方面并且根據以上中的任一項，本發明提供通過用調節Toso活性的組合物（包括但不限于可溶性Toso蛋白或Toso的抗體）治療有需要的受試者來治療病癥的方法。
[0204] 在一個具體實施方案中并且根據以上中的任一項，本發明提供通過用包括可溶性 Toso蛋白的組合物治療有需要的受試者來治療病癥的方法。不受理論限制，通過其可溶性 Toso蛋白是用于這些病癥的有效治療的一種潛在機制是通過調節Toso活性。在某些實施方案中，根據本發明治療病癥的方法包括施用治療有效量的本文所描述的任何可溶性Toso 蛋白，包括包含SEQ ID NO :1-25中的任何一個或多個的可溶性Toso蛋白或其任何變體。在其它實施方案中，用于治療病癥（包括糖尿病、多發性硬化癥、哮喘和癌癥）的可溶性Toso 蛋白包括與 SEQ ID N0:l-25 中的任一個具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的多肽。所述多肽可進一步根據本文所描述的方法進行修飾（包括化學修飾）以用于治療本文所描述的任何病癥。
[0205] 在其它方面，本發明涉及通過向受試者施用可溶性Toso蛋白（或其變體）來治療病癥和疾病的方法。本發明的可溶性Toso蛋白可用于治療患有但不限于以下各項的受試者：自身免疫性病癥（包括但不限于1型糖尿病、多發性硬化癥或類風濕關節炎）、2型糖尿病、哮喘、過敏癥、慢性阻塞性肺病（"C0PD"）、高-IgM綜合癥、狼瘡、癌癥或中性白細胞增多癥相關的病癥（包括但不限于中性粒細胞減少癥、重度先天性中性粒細胞減少癥、環狀中性粒細胞減少癥、抗體介導的中性粒細胞減少癥、網狀發育不良、白細胞粘附缺陷、常見骨髓增生性疾病、慢性髓細胞性白血病、常見感冒蕁麻疹和白細胞增多以及慢性肉芽腫病）。如將理解，本文所描述的任何可溶性Toso蛋白均可單獨地或以任何組合用于治療任何這些病癥或疾病。
[0206] 在其它實施方案中，將藥學上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試者以便治療本文所討論的任何病癥。在一些實施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白包括細胞外Toso結構域和/或Fc結構域和/或信號序列和/或柔性接頭。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :1-25中的任一個的序列。還可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一個的組合（作為單獨的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療本文所討論的任何病癥。所述多肽還可根據本文的描述進行進一步修飾（包括化學修飾）以便治療所述病癥。在仍然其它實施方案中，用于治療本文所描述的任何病癥的可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療本文所討論的任何病癥的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有至少約70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。在其它實施方案中，施用至受試者以用于治療本文所討論的任何病癥的可溶性Toso蛋白具有與 SEQ ID N0 :5 具有約 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% _96%、91% -99%、 92% -98%、93% _97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它實施方案中，施用至受試者以用于治療本文所討論的任何病癥的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11. 12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸取代的5￡〇10勵.5。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、 5-10、6-9、7-8個氨基酸取代的SEQ ID N0:5。在其它示例性實施方案中，將約12. 1、12. 2、 12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、 13. 9、14mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解，可溶性Toso蛋白的量可使用用于將來自實驗動物的劑量轉換至人的廣泛接受的體表面積（BSA)標準化方法基于動物研究來確定。（參見 Reagan_Shaw、S.，Nihal，M?和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)〇
[0207] 在具體實施方案中，本發明的方法和組合物用于治療處于1型糖尿病或2型糖尿病的風險或具有1型糖尿病或2型糖尿病的受試者。在其它實施方案中，將藥學上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試者。在一些實施方案中，施用至受試者以便治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包括細胞外Toso結構域和/或Fc結構域和/或信號序列和/或接頭。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :1-25中的任一個的序列或本文所討論的SEQ ID N0 :1-25的任何變體。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID N0 :1-25中的任一個具有至少約70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。還可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一個的組合（作為單獨的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療糖尿病。所述多肽還可根據本文的描述進行進一步修飾（包括化學修飾）以便治療糖尿病。在仍然其它實施方案中，用于針對糖尿病治療受試者的可溶性Toso蛋白具有包含 SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。在其它實施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有約75%-99%、 80%-98%、85%-97%、90%-96%、91%-99%、92%-98%、93%-97%、94%-96%同一性的序列。在仍然其它實施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包含具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個氨基酸取代的SEQ IDNO. 5。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8個氨基酸取代的5￡0 1〇勵：5。在仍然其它實施方案中，用根據本文所描述的任何組合物的可溶性Toso蛋白治療用于改進受試者中的葡萄糖耐量，并且由此治療糖尿病。在示例性實施方案中，將約10-20、11-19、12-18、13-17、 14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。在其它示例性實施方案中，將約 10、10. 1、10. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、11. 4、 11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、 13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、14、14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、14. 5、 14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、15. 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg 的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解，可溶性Toso蛋白的量可使用用于將來自實驗動物的劑量轉換至人的廣泛接受的體表面積（BSA)標準化方法基于動物研究來石角定° (參見 Reagan-Shaw、S.，Nihal，M.和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)。對于本文進一步詳細地描述的實驗來說，50 y g劑量用于疾病模型中，所述劑量在20g小鼠中將大約是2. 5mg/kg。使用 BSA轉換，所述劑量將是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或對于60kg成人來說大約12. 2mg。
[0208] 在其它實施方案中，本發明的方法和組合物用于治療處于多發性硬化癥的風險或具有多發性硬化癥的受試者。在其它實施方案中，將藥學上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試者以用于治療或改善多發性硬化癥。在一些實施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白包括和Fc結構域和/或柔性接頭。在一些實施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白包括細胞外Toso結構域和/或Fc結構域和/或信號序列和/或接頭。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :1-24中的任一個的序列。還可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一個的組合（作為單獨的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療多發性硬化癥。所述多肽還可根據本文的描述進行進一步修飾（包括化學修飾）以便治療多發性硬化癥。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療多發性硬化癥的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有至少約70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。在其它實施方案中，施用至受試者以用于治療多發性硬化癥的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有約 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% -96%、91% -99%、92% -98%、93% -97%、 94% -96%同一性的序列。在仍然其它實施方案中，施用至受試者以用于治療多發性硬化癥的可溶性 Toso 蛋白包含具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20個氨基酸取代的SEQ ID N0. 5。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療多發性硬化癥的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8個氨基酸取代的SEQ ID N0 :5。在仍然其它實施方案中，用根據本文所描述的任何組合物的可溶性Toso 蛋白治療用于延遲多發性硬化癥的進展。在示例性實施方案中，將約10-20、11-19、12-18、 13-17、14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。在其它示例性實施方案中，將約 10、10. 1、10. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、 11. 4、11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、 12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、14、14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、 14. 5、14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、15. 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg 的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解，可溶性Toso蛋白的量可使用用于將來自實驗動物的劑量轉換至人的廣泛接受的體表面積（BSA)標準化方法基于動物研究來確定。（參見 Reagan-Shaw、S.，Nihal，M?和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)。對于本文進一步詳細地描述的實驗來說，50ii g劑量用于疾病模型中，所述劑量在20g小鼠中將大約是2. 5mg/kg。使用BSA轉換，所述劑量將是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或對于60kg成人來說大約12. 2mg。
[0209] 在其它實施方案中，本發明的方法和組合物用于治療處于關節炎的風險或具有關節炎的受試者。在其它實施方案中，將藥學上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試者以用于治療或預防關節炎。在一些實施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白包括和Fc結構域和/或接頭。在一些實施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白包括細胞外Toso結構域和/或Fc結構域和/或信號序列和/或接頭。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID N0 :1-25中的任一個的序列。還可使用SEQ ID N0: 1-25中的任一個的組合（作為單獨的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療關節炎。所述多肽還可根據本文的描述進行進一步修飾（包括化學修飾）以便治療關節炎。在仍然其它實施方案中，所述可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療關節炎的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%同一性的序列。在其它實施方案中，施用至受試者以用于治療關節炎的可溶性Toso蛋白具有與 SEQ ID 勵.5具有約75%-99%、80%-98%、85%-97%、90%-96%、91%-99%、 92% -98%、93% -97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它實施方案中，施用至受試者以用于治療關節炎的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20個氨基酸取代的SEQ ID N0. 5。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療關節炎的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8個氨基酸取代的SEQ ID N0 :5。在仍然其它實施方案中，用根據本文所描述的任何組合物的可溶性Toso蛋白治療用于預防關節炎的發病或針對關節炎的嚴重程度進行保護。
[0210] 在具體實施方案中，本發明的方法和組合物用于治療處于哮喘的風險或具有哮喘的受試者。在其它實施方案中，將藥學上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試者。在一些實施方案中，施用至受試者以便治療哮喘的可溶性Toso蛋白包括細胞外Toso 結構域和/或Fc結構域和/或信號序列和/或接頭。在仍然其它實施方案中，所述可溶性 Toso蛋白包含根據SEQ ID N0:l-25中的任一個的序列或本文所討論的SEQ ID N0:l-25 的任何變體。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白包括與 SEQ ID N0:l-25 中的任一個具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。還可使用5￡0 1〇勵.：1-25中的任一個的組合（作為單獨的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療哮喘。所述多肽還可根據本文的描述進行進一步修飾（包括化學修飾）以便治療哮喘。在仍然其它實施方案中，用于針對哮喘治療受試者的可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白具有與 SEQ ID 吣.5具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %冋一性的序列。在其它實施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶性 Toso 蛋白具有與 SEQ ID NO. 5 具有約 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% -96%、 91% _99%、92% _98%、93% _97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它實施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、 14、15、16、17、18、19或20個氨基酸取代的5￡〇10勵.5。在又其它實施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8 個氨基酸取代的SEQ ID NO :5。在仍然其它實施方案中，用根據本文所描述的任何組合物的可溶性Toso蛋白治療用于改進受試者中的葡萄糖耐量，并且由此治療哮喘。在示例性實施方案中，將約10-20、11-19、12-18、13-17、14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。在其它示例性實施方案中，將約l〇、l〇. l、l〇. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、 10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、11. 4、11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、 12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、 14、 14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、14. 5、14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、 15、 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解，可溶性Toso蛋白的量可使用用于將來自實驗動物的劑量轉換至人的廣泛接受的體表面積 (BSA)標準化方法基于動物研究來確定。（參見Reagan_Shaw、S.，Nihal，M?和Admad，N.Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)〇對于本文進一步詳細地描述的實驗來說，50 y g劑量用于疾病模型中，所述劑量在20g小鼠中將大約是2. 5mg/kg。使用BSA轉換，所述劑量將是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或對于60kg 成人來說大約12. 2mg。
[0211] 在其它實施方案中，本文所描述的可溶性Toso蛋白，包括包含SEQ ID NO. 1-25的多肽中的任何一種或多種的可溶性Toso蛋白是呈用作藥劑的形式。在其它實施方案中，本發明提供一種用作藥劑的可溶性Toso蛋白，所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0. 1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 的多肽中的任何一種或多種（或任何一種或多種的一部分）。在仍然其它實施方案中，本發明提供用于使用包含SEQ ID N0. 1-25的多肽中的任何一種或多種的可溶性Toso蛋白用于治療以下病癥中的任一種的方法：自身免疫性病癥（包括但不限于1型糖尿病或2型糖尿病、多發性硬化癥或類風濕關節炎）、哮喘、過敏癥、慢性阻塞性肺病（"C0PD")、高-IgM綜合癥、狼瘡、癌癥或中性白細胞增多癥相關的病癥（包括但不限于中性粒細胞減少癥、重度先天性中性粒細胞減少癥、環狀中性粒細胞減少癥、抗體介導的中性粒細胞減少癥、網狀發育不良、白細胞粘附缺陷、常見骨髓增生性疾病、慢性髓細胞性白血病、常見感冒蕁麻疹和白細胞增多以及慢性肉芽腫病）。
[0212] 如以上所討論，在一些實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白用于治療癌癥。在其它實施方案中，根據本發明的治療癌癥的方法包括通過調節Toso活性來抑制腫瘤侵襲和/或轉移的方法。在示例性實施方案中，本發明的組合物用于治療有需要的受試者中的腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤或畸胎癌的組中的任一個。在其它實施方案中，本發明的組合物用于治療患有以下中的一個或多個中的癌癥的受試者：腎上腺、膀胱、骨、骨髓、腦、乳房、子宮頸、膽囊、神經節、胃腸道、心臟、腎、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、陰莖、前列腺、唾液腺、皮膚、脾、睪丸、胸腺、甲狀腺或子宮。
[0213] 實施例1 :T〇S〇在關節炎的發病機制中起作用
[0214] 將TOSO+小鼠和野生型小鼠皮下注射于完全弗氏佐劑中的II型雞膠原并且監測隨時間推移的疾病進展。暴露于II型膠原的動物發展具有與人類風濕性關節炎（RA)類似的免疫學、病理學和組織學特征的疾病。如使用數字測徑器通過踝關節厚度的變化測量的關節炎癥在T〇S〇+小鼠中顯著減輕（圖1A)。此外，基于可見腫脹和活動性針對每個關節從0-4對疾病嚴重程度進行計分。與野生型對照相比，TOSO+小鼠具有顯著降低的臨床得分（圖1B)。對引流淋巴結中的淋巴細胞群體的流式細胞術分析顯示B220+B細胞的顯著減少（圖1C)。這些數據表明Toso在關節炎的發病機制中具有重要作用。
[0215] 實施例2 :用Toso-Fc治療針對關節炎進行保護
[0216] 這個實施例顯示用Toso-Fc(SEQIDN0 :5)治療針對關節炎進行保護。將易患關節炎的小鼠DBA1腹膜內預先給藥50ygToso-Fc，用于完全弗氏佐劑中的II型膠原進行免疫以便誘導疾病，并且然后在實驗過程中每周三次用Toso-Fc進行治療。Toso-Fc治療的小鼠被針對疾病的嚴重程度和發病率兩者保護，從而表明Toso-Fc施用可適用于管理關節炎。例如，圖24A示出如與對照小鼠（僅用媒介物治療）相比，累加關節炎得分在Toso-Fc 治療的小鼠中是可忽略不計的。類似地，圖24B也示出如與對照相比，關節炎的發病率百分比在Toso-Fc治療的小鼠中是可忽略不計的。關節炎的臨床癥狀被評定如下：0=正常，1 =輕微腫脹和/或紅斑，2 =顯著腫脹，3 =關節強直。添加每個小鼠的單獨肢得分，從而得到12的最大疾病得分。當觀察到小鼠在一個肢中具有1的疾病得分時，注意到疾病的發病率。
[0217] 圖25提供顯示來自用膠原刺激的Toso-Fc治療的小鼠和媒介物治療的小鼠的脾細胞的回憶應答（增殖）的另外數據。如圖中所示，來自用Toso-Fc治療的小鼠的脾細胞顯示比來自媒介物治療的對照的脾細胞減少的增殖應答。
[0218] 實施例3 :-旦關節炎形成，Toso-Fc是針對所述疾病有效的
[0219] 如以上所示，Toso-Fc的預防性施用在類風濕性關節炎的鼠類模型中改善疾病癥狀。這個實施例顯示施用Toso-Fc在治療性背景下（S卩，當疾病已經形成時）也是有效的。
[0220] 將雌性DBA. 1小鼠（6至8周大）隨機分配成2組，當觀察到疾病時一組接受媒介物治療，并且另一組接受Toso-Fc。將所有小鼠用膠原進行接種以便誘導疾病。在免疫后第 43天觀察到疾病癥狀的引發。將所述動物在第52天時用媒介物對照或Toso-Fc進行治療，如由曲線上的箭頭所指示（圖26)。在第57天之后，Toso-Fc的治療性施用顯著降低總疾病得分和關節炎發病率（參見圖26)。這些數據指示當疾病已經形成時，Toso-Fc可有效地管理關節炎癥狀，并且因此可以在治療性以及預防性背景下是有效的。
[0221] 實施例4 :Toso在哮喘的發展中起作用
[0222] 哮喘是以異常TH2活化、IgE的產生、支氣管高反應性以及白細胞外滲至支氣管粘膜中的過敏性病癥。嗜酸性粒細胞增多是過敏性哮喘的標志并且被認為是炎癥中的關鍵參與者。哮喘的病理表現引起肺收縮，從而導致氣喘、呼吸短促、胸悶和咳嗽。
[0223] 對Toso-/-小鼠和野生型小鼠進行0VA誘導的哮喘模型（圖2A)。在第0天、第7 天和第14天腹膜內遞送OVA (10mg/kg)。小鼠然后在第21天、第22天和第23天接受霧化 0VA(lmg/ml)達30分鐘，并且在2天之后處死。如通過DifQuik染色所評定，Toso-/-小鼠在嗜酸性粒細胞遷移至支氣管肺泡空間方面具有顯著減少（圖2B)。基于形態，通過對每個載玻片至少200個白細胞進行計數來量化嗜酸性粒細胞（圖2C)。
[0224] 哮喘和其它過敏性疾病典型特征具有天然T細胞優先分化成TH2細胞的典型特征。評定了支氣管肺泡灌洗液（BALF)中TH2相關細胞因子和趨化因子的存在。如通過 ELISA所評定，Toso-/-小鼠在BALF中具有0VA誘導的TH2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13 的顯著減少（圖3A-C)。與受阻抑的嗜酸性粒細胞遷移至肺中一致，Toso-/-小鼠在BALF 中具有顯著減少的嗜酸性細胞活化趨化因子（一種嗜酸性粒細胞虜獲C-C趨化因子）（圖 3D)。支氣管平滑肌細胞已知響應于TNF a產生嗜酸性細胞活化趨化因子。既然Toso已知在肺中表達，并且Toso缺陷使小鼠對TNF頑固，本發明人尋求解決Toso對嗜酸性粒細胞趨化因子水平的作用是否是肺固有的。培養的Toso-/-支氣管平滑肌細胞具有顯著降低的響應于TNF a治療產生的嗜酸性粒細胞趨化因子的水平（圖3E)。這些數據一起表明Toso缺陷影響肺中的0VA誘導的TH2細胞因子和嗜酸性粒細胞趨化因子水平。
[0225] 過敏性哮喘的一個標志是IgE的過量產生。產生抗體的B細胞被誘導以便由TH2 細胞因子如 IL-4 產生 IgE(0ettgen，H.C?和 R.S.Geha，IgE regulation and roles in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol，2001.107(3) :p. 429-40)。血清中 OVA誘導的總IgE水平和OVA特異性IgE水平在Toso-/-小鼠中受到顯著阻抑（圖4A和B)，而 0VA特異性IgGl在野生型和敲除的之間類似（圖4C)。這些數據表明Toso的遺傳消融或可能治療性阻斷可以減少IgE的產生。
[0226] 代表過敏性氣喘的炎癥事件在引起限制氣流至肺的氣道重塑中達到頂點。因此，通過使用全身體積描記法測量響應于增加的乙酰甲膽堿劑量的增強間歇（Penh)來評定 Toso缺陷是否影響0VA誘導的氣道高反應性。Toso-/-小鼠被顯著保護免于0VA誘導的氣道高反應性，如通過與野生型對照相比Penh值的顯著降低所指示（圖5)。這些數據表明 Toso阻斷是用于減輕過敏性哮喘中的氣道反應性的有效策略。
[0227] 實施例5 :Toso消融影響樹突細胞活性
[0228] Toso消融對過敏性和炎性疾病的發作具有廣泛作用。一種可能的非限制性機制是Toso在全局水平下調控這些疾病過程，可能通過樹突細胞（DC)將抗原呈遞至天然T細胞的功能。
[0229] 為了測試TOSO+樹突細胞在疾病的發作或在T細胞的活化中的功能相關性，本發明人確定負載抗原的T 〇S〇-/-DC的轉移是否引發與野生型對應受體類似的疾病過程。
[0230] 通過與GM-CSF -起培養來制備源自野生型和Tosof骨髓的DC (參見Lutz， M. B.等人，An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods,1999. 223(1)： p. 77-92,所述文獻特此出于所有目的并且特別是出于關于培養樹突細胞的所有教導的目的而以引用的方式整體并入）。與Lambrecht等人的方案類似，本實驗中的DC負載有 0VA。將負載抗原的DC滴入C57BL6動物的氣管中（參見Lambrecht，B. N.，等人，Myeloid dendritic cells induce Th2 responses to inhaled antigen，leading to eosinophilic airway inflammation. J Clin Invest，2000. 106(4) :p. 551-9,所述文獻特此出于所有目的并且特別是出于涉及樹突細胞的所有教導的目的而以引用的方式并入）。一周之后，將動物按照哮喘研究用霧化0VA進行治療持續連續三天。顯著地，負載0VA的T 〇S〇f樹突細胞與野生型對照相比在其誘導至BALF中的TH2細胞因子產生的能力方面被顯著降低（圖7A)。 2d2TCR轉基因品系包含對用于引發EAE的M0G35-55肽具有特異性的T細胞（Bettelli， E.，等人，Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med, 2003.197(9)： p. 1073-81)。源自2d2小鼠的T細胞未能在與負載M0G35-55的Tos〇-/-DC共培養時增殖（圖7B)。在大鼠胰島素啟動子（RIP)的控制下表達來自淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒 (LCMV)的主要糖蛋白（GP)的小鼠發展糖尿病，如通過增加的血清葡萄糖水平所評定。類似地，接受負載GP肽的DC的RIP-GP發展疾病。T 〇S〇-/-DC顯示與野生型對照相比在其引發疾病的能力方面的損傷，并且接受負載肽的T〇S〇-/-DC的RIP-GP小鼠比接受負載肽的野生型DC的那些小鼠顯著更好地存活（圖7C)。這些結果一起表明Toso對于樹突細胞活化T 細胞并且誘導疾病的能力來說是必要的。
[0231] 實施例6 :施用可溶性Toso蛋白廢除哮喘疾病量度
[0232] 為了產生可溶性受體，將來自人脾cDNA文庫的Toso的胞外結構域進行擴增并且然后用源自C末端處的人IgGl的Fc結構域框內克隆至IL2信號序列下游的 pFuse-hIgGle3-Fc2中，從而允許最佳分泌至培養物上清液中（圖8A-信號序列由盒指示，并且Fc結構域用下劃線指示）。此外，Fc區包含幾種突變（E233P/L234V/L235A/AG236/ A327G/A330S/P331S)，所述突變已經顯示消除抗體依賴性和補體依賴性細胞毒性。當體內施用時，這些突變可增強蛋白質的半衰期并且賦予有利的藥物代謝動力學曲線。將這種 Toso-Fc構建體以及空載體對照使用自由式表達系統轉染至于400ml的不含血清的培養基細胞中的3x 108個293F細胞中。兩天之后，收集上清液并且將細胞重懸浮于另外400ml的培養基中。在再培養2天之后，收集第二上清液并且將其與第一上清液組合。使用ELISA 來確認Toso-Fc可溶性受體的分泌（圖8B)，通過蛋白質G色譜法進行純化，并且用lOOmM 甘氨酸（pH 2. 3)洗脫。將lml洗脫液級分收集至60 ill的中和緩沖液（1M Tris pH 9. 5) 中并且通過使用針對Fc區的抗體蛋白質印跡（圖8C i)和考馬斯藍染色（圖8Cii)進行確認。
[0233] 在鼠類脾細胞上測試所述可溶性受體的結合。將大約106個細胞與指示量的于 100 ii 1 FACS染色緩沖液（PBS+1 % BSA+0. 05% NaN3)中的Toso-Fc在冰上一起孵育2小時。將細胞在FACS緩沖液中進行洗滌并且與FITC綴合的抗人FC g F(ab'）2片段在冰上一起孵育30分鐘，并且在FACS Canto流式細胞儀上獲得。大約10%的脾細胞在10 y g下結合至所述可溶性受體（圖8D)。純化的Fc蛋白質獨自不顯示與脾細胞的顯著結合，從而表明Toso-Fc結合是特異性的。進一步詳細的分析指示Toso-Fc最顯著地結合脾中的 ⑶llc+MHChi成熟樹突細胞或⑶11C+B220+漿細胞樣DC (圖8E)。這些數據說明Toso-Fc 可溶性受體是功能性的，并且Toso的配體可被表達于成熟樹突細胞上。
[0234] 在0VA誘導的哮喘的鼠類模型中評定了 Toso-Fc施用的治療性效用。疾病是如以上所描述在略微修改的情況下引發。將雌性BALB/c小鼠如所描述進行治療，除了在霧化 0VA激發之前腹膜內施用50 y g的Toso-Fc持續連續3天（圖9A)。通過評估BALF中的Th2 細胞因子（圖9B)、BALF中的細胞結構（圖9C)來評定疾病的嚴重程度。用Toso-Fc預治療顯著廢除疾病度量，從而表明施用Toso-Fc可以是哮喘管理中的有用治療模式。
[0235] 實施例7 :Toso是治療多發性硬化癥的潛在靶標
[0236] 實驗性自身免疫性腦炎（EAE)是用于人MS的有用小鼠模型。這一系統涉及 CD4+TH1/TH17細胞的抗原依賴性活化和導致脫髓鞘的單核細胞的血管周圍積聚以及后肢麻痹。在C57BL/6背景下，EAE被認為是慢性進行性的，因為疾病隨時間增加并且是通過注射髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白肽M0G35-55與完全弗氏佐劑中的百日咳毒素引發的。每日從0至5對疾病嚴重程度進行計分持續大約1個月（其中0 =無疾病病征，1 =跛行的尾部或后肢虛弱但不是兩者，2 =跋行的尾部和后肢虛弱,3 =部分后肢麻搏,4 =完全后肢麻搏,5 =垂死狀態或由于EAE死亡）。
[0237] 在上述M0G誘導的模型中，與野生型對照相比，Toso-/-小鼠被明顯保護免于EAE 的發作（圖6)。這些數據表明阻斷Toso功能可以代表用于MS的新穎治療策略。
[0238] 實施例8 :用Toso-Fc治療延遲EAE的發作
[0239] 這個實施例證明用Toso-Fc (SEQ ID N0 :5)治療延遲EAE的發作。如以上所討論， EAE小鼠模型是用于人MS的有用模型。對于圖23A中描繪的實驗來說，將C57BL/6小鼠在用誘導疾病的M0G肽進行免疫之前用Toso-Fc進行預治療。在免疫之后，將小鼠每周三次腹膜內使用50 y g Toso-Fc (或對于對照小鼠來說PBS)進行治療持續30天。如圖23B中所示，Toso-Fc延遲EAE的進展，從而顯示Toso-Fc在多發性硬化癥中的緩和作用。
[0240] 實施例9 :T〇S〇減弱先天性抗細菌免疫應答
[0241] 這個實施例證明粒細胞在細菌感染之后在Toso缺陷的小鼠中早期活化并且對于控制病原體來說是必要的。Toso缺陷的粒細胞顯示增強的⑶lib和⑶18表達并且展示降低的活化閾值。與這些結果一致，Toso缺陷的粒細胞顯示在周圍組織中的炎癥部位處的減少的效應子功能。由于改變的粒細胞功能，Toso缺陷的小鼠未能清除全身性李斯特氏菌感染，從而導致Toso缺陷的小鼠的快速死亡。因此，Toso影響粒細胞的活化閾值和效應子功能，并且因此關鍵性地減弱先天性抗細菌免疫應答。
[0242] 材料和方法
[0243] 小鼠：短序列是使用源自小鼠Toso cDNA序列的一系列低聚物通過對文庫分離的基因組DNA片段進行測序來獲得。6.5kbp片段是使用Bglll限制消化酶從5'端分離的并且被用作敲除構建體的長臂。650bp短臂是使用源自所述基因的3'端的序列的低聚物 (5, GTGAATACGTGAGCTTGGGCTACC 3' SEQ ID N0 :1 和 5' CAAGTGATGG GGGATTACAGTGAA3' SEQ ID N0 :2)通過聚合酶鏈式反應產生的。將長臂和短臂以與Toso翻譯正義相同的定向連接在新霉素抗性盒的任一端上。這種敲除構建體位點特異性插入胚胎干（ES)細胞基因組 DNA中首先使用在Neo的3'端中和在所述短臂的3'端下游的基因組DNA側翼區中設計的引物通過聚合酶鏈式反應（PCR)來進行篩選。使用三種引物對小鼠進行篩選。共用引物 (5'TGTTTAATATGATGTGTCAGGCTG 3'SEQ ID N0:3)位于短臂區中并且兩種其它引物是來自 Neo 的 3' 區（5, AGGGCCAGCTCAITCCTCCCACTCAT 3' SEQ ID N0 :4)或通過所述敲除構建體切除的 DNA 的 3' 區（5'AACTCTGCCCCTGCTCCTTCAITTCC 3'SEQ ID N0:5)。如此從重排的等位基因獲得的條帶具有400bp并且天然基因的條帶是450bp。將D3ES細胞用敲除構建體進行電穿孔并且在存在SOOyg/ml G418的情況下生長。然后將陽性ES克隆注射至源自 E3. 5 C57/BL6的胚泡中。針對重排等位基因的存在篩選嵌合子代并且將其與C57BL/6背景回交。0)1 ltT^小鼠源自C57BL/6背景的Jackson。
[0244] 骨髓嵌合小鼠：將小鼠用1050rad進行致死輻射處理并且用107⑶45. 1WT骨髓細胞或107CD45. 2T0S0-A骨髓細胞或5x 106CD45. 1WT骨髓細胞加5x 106CD45. 2T0S0+骨髓細胞進行重構。將用于這一研究的所有小鼠維持在C57BL/6遺傳背景上。所有實驗在單個通風籠中進行。
[0245] 李斯特氏菌感染：將李斯特氏菌生長在心臟浸液瓊脂中。如果未不同地指示，那么將小鼠用2xl0 4CFU靜脈內感染。
[0246] 在細胞因子刺激之后的粒細胞活化和FACS分析：如所描述進行FACS染色和分析 (Lang, P. A.,等人 Aggravation of viral hepatitis by platelet-derived serotonin. Nat Med 14, 756-761 (2008)，其特此出于所有目的并且特別是出于涉及FACS染色和分析的所有教導的目的而以引用的方式整體并入）。重組小鼠TNF-a來自R+D系統，LPS來自 Sigma并且GM-CSF是從X630細胞上清液獲得。在所指示的濃度下使用來自Sigma的fMLP。對于活化研究，將10 U 1血液在含有不同細胞因子還有抗Grl (eBiosciences)、二氫羅丹明 (八161丨8)和〇)1113(613；[08(^611068，如果指不）的100111培養基中進行孵育。在孵育30分鐘或45分鐘（如果未不同地指示在37°C )之后，將粒細胞固定并且使用紅細胞溶解緩沖液（BD Biociences)溶解紅細胞。對于⑶11a、⑶lib和⑶18的天然表達來說，將血液用 2 %福爾馬林固定10分鐘，并且然后用抗Grl和相應抗體在4°C下染色。Toso抗體是根據 Nguyen 等人，（Blood，2011年 7 月 21 日，118(3) :598-608)產生的。
[0247] 對于引發研究來說，將粒細胞與不同細胞因子一起孵育30分鐘，接著fMLP孵育15 分鐘。
[0248] 組織學：如 Lang，K. S.,等人 Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. J Clin Invest 116,2456-2463(2006) 中所描述在急速冷凍或福爾馬林固定的組織上進行組織學分析，所述文獻特此出于所有目的并且特別是出于涉及組織學分析的所有教導的目的而以引用的方式整體并入。
[0249] MP0 ELISA :MP0 ELISA源自Hycult biotech并且根據制造商的說明書進行。
[0250] 通過定量RT-PCR進行的mRNA基因序型分析：使用Trizol進行RNA提取和cDNA 合成。使用來自Applied Biosystems的Toso(Faim3)試劑盒Mm01302388_ml進行的基因表達分析。對于分析，將所有靶基因的表達水平針對18sRNA進行標準化（ACt)。基因表達值被表示為ACt。
[0251] 統計分析：數據被表示為平均值土S. E. M。使用學生t檢驗對兩個不同組之間的統計學上有意義的差異進行分析。如果未不同地提及，那么雙向未配對。使用單向AN0VA與另外Bonferroni或Dunnett測試來進行包括幾組的分析。使用雙向AN0VA(重復測量值）來計算多個時間點內實驗組之間的統計學上有意義的差異。P值< 〇. 05被認為是統計學上有意義的。
[0252] T0S0在粒細胞上表達但對于白細胞分化來說不是必要的
[0253] 為了分析Toso在體內的功能相關性，本發明人如材料和方法中所描述產生了一種Toso缺陷的小鼠。將Toso缺陷的小鼠與C57BL/6背景回交并且然后針對Toso RNA的表達進行分析。來自Tos〇f小鼠的RT-PCR分析顯示缺乏Toso,從而表明Toso確實不在 TOSO+小鼠中表達（圖12a)。接著使用Toso特異性抗體在淋巴細胞上對Toso蛋白進行分析。據發現與出版的文獻一致，天然B細胞而不是T細胞表達Toso (圖12b)。接著，本發明人分析了 Toso在粒細胞上的表達。本發明人發現血液和脾兩者中的粒細胞在細胞表面上表達Toso (圖12c)。為了分析Toso是否影響淋巴細胞或粒細胞發育，本發明人對T〇S〇+小鼠的外周血中的這些細胞群體進行了分析。TOSO+小鼠未顯示血液粒細胞中的任何顯著差異（圖12d)。在Toso缺陷的小鼠中存在血液淋巴細胞數目的稍微顯著減少，這被歸因于減少的B細胞數目（圖12d和e)。T 〇S〇+小鼠的脾大小是正常的并且脾淋巴細胞顯示正常分布（圖12f和g)，從而表明Toso對免疫細胞的發育不存在主要作用。
[0254] 3.活化閾值在T0S0缺陷小鼠的粒細胞中被降低
[0255] 將來自Toso+小鼠和野生型小鼠的粒細胞用粒細胞活化劑N-甲酰蛋氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP)進行活化。fMLP活化粒細胞上的fMLP受體，其模擬病原體接觸。在預活化的粒細胞中，與fMLP相接觸導致活性氧物種（R0S)的強烈產生和脫粒。相比之下，未通過細胞因子預活化的粒細胞顯示對fMLP的有限應答。當通過R0S的產生和脫粒進行分析時，僅10 %的野生型粒細胞在用fMLP處理之后被活化（圖13a)。相比之下，用fMLP 處理活化50%的TOSO+粒細胞（圖13a)。
[0256] 接著，在用TNF- a處理之后對TOSO+粒細胞的R0S產生和脫粒進行分析，TNF- a 通常僅引發粒細胞，但不會導致R0S產生。用TNF-a處理導致WT粒細胞中實際上不存在的R0S產生（圖13b)。相比之下，TOSO+粒細胞在TNF-a處理之后顯示顯著R0S產生/脫粒的粒細胞，從而表明Toso影響粒細胞活化的閾值（圖13b)。用LPS和GM-CSF處理（其也已知引發粒細胞）既未活化野生型粒細胞中的R0S也未活化TOSO+粒細胞中的R0S (圖 13c和d)。這些結果顯示Tosof粒細胞對于fMLP和TNF- a兩者來說均具有降低的活化閾值。用GM-CSF或LPS連同fMLP共處理使WT粒細胞中產生R0S的野生型粒細胞的百分比增加10倍（圖13e)。產生R0S的粒細胞的百分比在LPS或GM-CSF引發的fMLP共處理的 Tosof粒細胞中也增加（圖13e)。這些數據顯示Tosof粒細胞還在用GM-CSF或LPS引發的粒細胞的情況下展示降低的活化閾值。這表明T 〇S〇+粒細胞一般具有降低的活化閾值。
[0257] 細胞應激可活化粒細胞，其可能顯著導致（自身）炎性疾病。為了分析T〇S〇+粒細胞是否更易于這種活化，將野生型（WT)粒細胞和TOSO+粒細胞在不同溫度下進行孵育。溫度降低誘導30%的T 〇S〇+粒細胞中的脫粒，這是野生型粒細胞未顯示任何應答的一種條件（圖13f)。活化閾值的差異可通過WT粒細胞與TOSO+粒細胞之間的壽命差異來解釋。粒細胞通常具有非常有限的壽命，其通過在體外培養之后24小時內的自發性細胞凋亡加強。粒細胞活化通常與延長的壽命和減少的細胞凋亡相關。然而，在T 〇S〇+粒細胞與WT 粒細胞之間不存在自發性細胞凋亡的差異（圖17)。用GM-CSF處理減少粒細胞中的細胞凋亡，這是不依賴于Toso的一個過程（圖17)。數據證明當遇到炎性信號或應激信號時，Toso 蛋白的表達保持粒細胞處于靜止非活化狀態。
[0258] 粒細胞中的活化閾值被內在地調控
[0259] 當與野生型粒細胞相比時，源自T〇S〇+小鼠的粒細胞針對分化成效應子表型具有降低的閾值。除其內在調控之外，粒細胞活化受幾種外在體液因素（像：細胞因子、抗體、補體因素）以及周圍細胞如B細胞、T細胞、內皮細胞或血小板的活化狀態影響。為了得到關于源自T 〇S〇+小鼠的粒細胞的降低的活化閾值的機制的更多認識，對混合的骨髓嵌合體進行了分析。將C57BL/6小鼠進行輻射處理并且然后用WKTosof或混合的WT/Toso^(比例 1 : 1)骨髓進行重構。WT骨髓可以通過CD45. 1同種型的表達在嵌合小鼠中被單獨地追蹤 (圖14a)。這種混合的骨髓嵌合體允許對源自同一小鼠的WT粒細胞和Tosc^粒細胞的活化閾值的分析。活化閾值中的所觀察到的差異（尤其是混合的嵌合小鼠中的那些）將表明 Toso內在地調控粒細胞的活化。在骨髓移植之后30天對骨髓嵌合體的分析顯示T〇S〇+粒細胞以與WT粒細胞相同的數目重構，從而再次表明Toso在粒細胞的發育中不存在主要作用（圖14b)。在混合的嵌合體中，總粒細胞（WT和T 〇S〇+)是與接受來自單一小鼠品系的骨髓的小鼠可比的（圖14b)。在混合的骨髓嵌合體的競爭模式方面不存在WT粒細胞對比 TOSO+粒細胞的顯著優點（圖14b)。
[0260] 接著，對嵌合小鼠中WT粒細胞對比TOSO+粒細胞的活化閾值進行分析。用fMLP 處理在接受骨髓移植的小鼠中活化更多粒細胞（圖14a對比圖13a)，這可能是由于接受骨髓移植的小鼠中的不同細胞因子水平（但不限于這一潛在機制）。與源自T 〇S〇+小鼠的數據可比，用TOSO+骨髓重構的C57BL/6小鼠顯示降低的活化閾值（圖14c)。這也在混合的骨髓嵌合體中見到（圖14c)。這表明Toso內在地影響粒細胞的活化閾值。
[0261] 為了確定Toso是否另外影響效應子功能的強度，測定了活化的WT粒細胞和活化的TOSO+粒細胞的R0S產生量。活化的WT粒細胞顯示比活化的TOSO+粒細胞顯著更多的 R0S產生（圖14d)。這些數據顯示Toso增強了粒細胞的活化閾值。一旦粒細胞被活化，它們就在存在Toso的情況下顯示增強的效應子功能。
[0262] Toso缺陷的小鼠中李斯特氏菌的受損控制
[0263] 評定了粒細胞中Toso的缺乏對體內細菌控制的作用。用革蘭氏陽性單核細胞增生李斯特氏菌感染特別強烈地依賴于粒細胞的快速活化。用亞致死劑量的李斯特氏菌感染導致TOSO+小鼠中增加的死亡（圖15a)，從而表明Toso對于細菌的控制來說是必不可少的。在李斯特氏菌接種之后兩天，TOSO+小鼠中的血液粒細胞顯示增強的脫粒和R0S產生 (圖15b)。這與T 〇S〇+小鼠的血清中髓過氧化物酶的增強釋放相關（圖15c)。
[0264] 一個可能性是Toso+粒細胞在血液中被快速活化，但可能未能在受感染的器官中發揮其充分發展的效應子功能。為了對這種假設進行分析，將受感染的野生型小鼠或 Tosof小鼠用2x 106CFU的李斯特氏菌感染并且在20小時之后對組織學進行分析。在WT 小鼠和TOSO+小鼠兩者中均發現肉芽腫（圖15d)，從而表明Toso未參與肉芽腫形成。針對李斯特氏菌染色顯示肉芽腫中增強的細菌（圖15d)，從而表明肉芽腫中的效應子功能由 Toso實現。
[0265] 對器官中感染后一天粒細胞的分析顯示減少的效應子功能（圖15e)并且李斯特氏菌生長在T 〇S〇+小鼠的肝和脾中顯著增強（圖15f)。這與李斯特氏菌散播至血液中相關（圖18)并且最終還散播至腦，這可能是感染李斯特氏菌的T 〇S〇+小鼠的死亡原因（圖 15f)。這些數據顯示T〇S〇+小鼠顯示出對李斯特氏菌感染增強的敏感性。這與血液中增強的粒細胞活化、肝和脾中減少的效應子功能以及李斯特氏菌散播至腦中相關。
[0266] Toso調控粒細胞上的表面CDllb和CD18表達
[0267] Toso缺陷的粒細胞展示在血液中增強的活化但在組織中減少的粒細胞效應子功能。這種表型將適合整聯蛋白的不同表達和/或不同信號傳導。⑶11a、⑶lib和⑶18是對于粒細胞活化來說重要的整聯蛋白。因此在WT粒細胞和Tosc^粒細胞中比較⑶11a、 ⑶lib和⑶18的表達。存在⑶lib和⑶18在天然Toso缺陷的粒細胞上的顯著增強的表達 (圖16a)。⑶11a的表達在WT粒細胞與Tosc^粒細胞之間沒有顯著不同（圖16a)。在用 GM-CSF或LPS活化之后，⑶lib表達在WT粒細胞和Tosc^粒細胞兩者中上調，然而表達差異隨著增加LPS和GM-CSF濃度而減少（圖16b)。LPS和GM-CSF在fMLP之后降低粒細胞的活化閾值。因此，WT粒細胞與T〇S〇+粒細胞之間CDllb表達的差異可能可以解釋不不同活化閾值。為了觀察CDllb表達是否確實參與活化閾值的調控，本發明人對CDllb在系統中的作用進行了分析。如所預期，缺乏⑶lib導致減少的⑶18表達（圖16c)。Cdllb+粒細胞顯示在用fMLP連同GM-CSF處理之后減少的活化和ROS產生（圖16d)。這些數據顯示 Toso-/粒細胞顯示增強的⑶lib (影響粒細胞的活化閾值的一種整聯蛋白）基礎表達。這些發現將T〇S〇+粒細胞中增強的⑶lib表達與在不存在Toso的情況下降低的活化閾值相聯系。
[0268] 實施例10 :T〇S〇在葡萄糖耐量和胰島素敏感性中起作用
[0269] 這個實施例證明Toso在葡萄糖耐量和胰島素敏感性中起作用。圖19示出 Toso 7小鼠在開始商脂肪飲食之后具有正常食物攝取和體重。對于圖19A中的實驗，自開始高脂肪飲食（開始于5周大）監測WT和T 〇S〇+雄性小鼠的體重。對于圖19B，在高脂肪飲食后14周測量食物攝取。食物攝取通過單獨家養的動物測量，其中在2天周期的開始和結束時測定食物重量的差異。
[0270] 如圖20中所示，在進行高脂肪飲食持續10-13周之后，與野生型小鼠相比， TOSO+小鼠具有增強的葡萄糖耐量和胰島素敏感性。用自5周大開始以高脂肪飲食喂養 10-13周的野生型小鼠和T 〇S〇+小鼠進行葡萄糖耐量測試（注意使用雌性小鼠組獲得類似結果）。用自5周大開始以高脂肪飲食喂養10-13周的野生型小鼠和TOSO+小鼠進行胰島素耐量測試。
[0271] 在9 :30a. m.與11 :30a. m.之間對禁食過夜的動物進行葡萄糖耐量測試，使用腹膜內（1.?.)注射的以/1^體重的葡萄糖劑量和在注射之后0、15、30、60和120分鐘時的葡萄糖水平的測量值。
[0272] 使用在0. 5U/kg體重劑量下的人常規胰島素（Humalog)在9 :30a. m.與11 :30a. m.之間對禁食過夜的動物或在1 :00p. m與3p. m.之間對禁食4. 5小時的動物進行胰島素耐量測試，并且在注射之后0、15、30、45和60分鐘時測量血液葡萄糖水平。
[0273] 與喂以高脂肪飲食的小鼠相比，圖21示出當兩組小鼠均喂以常規食物持續10-13 周時，TOSO+具有與野生型小鼠類似的葡萄糖耐量和胰島素敏感性。用喂以常規飲食的野生型和T 〇S〇+雄性小鼠（15-18周大）進行葡萄糖耐量測試。用喂以常規飲食的野生型和T〇S〇+雄性小鼠（15-18周大）進行胰島素耐量測試。圖21表明，不受理論限制，Toso 缺陷的保護作用要求高脂肪飲食。在9 :30a.m.與11 :30a.m.之間對禁食過夜的動物進行葡萄糖耐量測試，使用腹膜內（i.P.)注射的lg/kg體重的葡萄糖劑量和在注射之后0、15、 30、60和120分鐘時的葡萄糖水平的測量值。使用在0. 5U/kg體重劑量下的人常規胰島素 (Humalog)在9 :30a. m?與11 :30a. m.之間對禁食過夜的動物或在1 :00p. m與3p. m?之間對禁食4. 5小時的動物進行胰島素耐量測試，并且在注射之后0、15、30、45和60分鐘時測量血液葡萄糖水平。
[0274] 實施例11 :用可溶性Toso治療改善用高脂肪飲食喂養的野生型小鼠中的葡萄糖耐量
[0275] 這個實施例證明用可溶性Toso蛋白（SEQ ID N0 :5)治療改善用高脂肪飲食喂養 14周的野生型小鼠中的葡萄糖耐量。圖22A示出來自在可溶性Toso治療之前的野生型雄性小鼠的數據。用自5周大開始以高脂肪飲食（60%脂肪卡路里）喂養14周的禁食野生型小鼠進行葡萄糖耐量測試。圖22B示出來自在可溶性Toso治療之后的野生型小鼠的數據。將小鼠（高脂肪飲食持續14周）在第0、2、5、7、9和12天用可溶性Toso-hlgG在腹膜內50 yg的劑量下進行治療。在禁食過夜之后第14天進行葡萄糖耐量測試。在可溶性 Toso蛋白治療過程中，將小鼠連續喂以高脂肪飲食。在9 :30a.m.與11 :30a.m.之間對禁食過夜的動物進行葡萄糖耐量測試，使用腹膜內（i.P.)注射的lg/kg體重的葡萄糖劑量和在注射之后0、15、30、60和120分鐘時的葡萄糖水平的測量值。
[0276] 實施例12 :分泌人和小鼠Toso-Fc的穩定細胞系的產生
[0277] 使用脂質體（Lipofectamine) 2000 將編碼 cDNA 的 Toso-Fc 轉染至粘附 HEK293T 細胞中。在補充有10%胎牛血清和〇. 2mg/ml博萊霉素（Zeocin)的DMEM培養基中選擇單個克隆。將高表達克隆擴大至15cm培養皿，并且在匯合時1 : 2分裂。在每次分裂，將穩定的轉染株在具有連續更多無血清自由式培養基和連續更少DMEM/FBS培養基中培養以便針對無血清生長調理細胞。（例如在分割1時-90% DMEM/FBS 10%自由式一在分割10時 100%自由式）。將調理成在無血清培養基中生長的穩定轉染株在無生存力損失的情況下生長在定軌振蕩器孵育箱（37°C，8% C02，125rpm)中的懸浮液中。
[0278] 本說明書在目前描述的技術的實施例方面中提供方法、系統和/或結構以及其用途的完整描述。雖然所述技術的多種方面已經如上在一定程度的具體性上或參考一個或多個單獨方面作了描述，但是本領域技術人員在不脫離此技術的精神或范圍的情況下能夠對所公開的方面做出大量的改變。因為可以在不脫離目前描述的技術的精神和范圍的情況下產生許多方面，所以適當的范圍存在于下文所附的權利要求書中。因此涵蓋其它方面。此夕卜，應理解的是，除非另外明確地主張或主張語言本身需要特定的順序，否則任何操作可以以任何順序進行。希望包含于以上描述和在附圖中示出的所有事物只解釋為特定方面的說明性的并且不限于所示的實施方案。除非另外從上下文清晰可見或明確說明，否則本文中提供的任何濃度值通常就混合物值或百分數給出，而不考慮添加混合物的特定組分時或之后發生的任何轉化。如果尚未明確地并入本文中，那么在本公開中提及的所有公開的參考文獻和專利文件均出于所有目的以引用的方式整體并入本文。如在以下權利要求書中所定義，可以在不脫離本技術的基本要素的情況下進行細節或結構上的改變。
【權利要求】
1. 一種治療受試者中的自身免疫性病癥的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基酸殘基 18-253。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID NO :5或6的氨基酸序列。
4. 如權利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO :5或6具有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
5. 如權利要求1至4所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚體。
6. 如權利要求5所述的方法，其中所述多聚體包含6個單體，其中每個單體包含根據 SEQ ID NO :6 的序列。
7. 如權利要求1至6所述的方法，其中所述自身免疫性病癥是選自類風濕性關節炎、多發性硬化癥、狼瘡和I型糖尿病的成員。
8. -種治療受試者中的II型糖尿病或哮喘的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者。
9. 如權利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基酸殘基 18-253。
10. 如權利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID NO :5或6 的氨基酸序列。
11. 如權利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO :5或6具有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
12. 如權利要求8-11所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚體。
13. 如權利要求12所述的方法，其中所述多聚體包含6個單體，其中每個單體包含根據 SEQ ID NO :6 的序列。
14. 一種治療受試者中的1型糖尿病、2型糖尿病、哮喘、多發性硬化癥或類風濕性關節炎的方法，所述方法包括向所述受試者施用具有SEQ ID NO :5或6的氨基酸序列或其片段或缺失變體的可溶性多肽。
15. 如權利要求14所述的方法，其中所述受試者中的Toso活性被降低。
16. 如權利要求14-15所述的方法，其中所述可溶性多肽包含SEQ ID NO :5或6的缺失變體。
17. 如權利要求16所述的方法，其中所述缺失變體包含選自：SEQ ID NO. 9-24的成員。
18. -種治療受試者中的癌癥、過敏癥、C0PD、高-IgM綜合征或中性白細胞增多癥相關的病癥的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基酸殘基18-253。
20. 如權利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根據SEQ ID NO :5或6 的氨基酸序列。
21. 如權利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO :5或6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
22. 如權利要求18-21所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚體。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述多聚體包含6個單體，其中每個單體包含根據 SEQ ID NO :6 的序列。
24. 如權利要求18-23所述的方法，其中所述自身免疫性病癥是選自類風濕性關節炎、多發性硬化癥、狼瘡和I型糖尿病的成員。
25. -種抑制受試者中的Toso活性的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的可溶性Toso多肽。 26?-種抑制Toso活性的方法，所述方法包括將可溶性Toso多肽應用至包含膜結合 Toso受體的細胞。
27. -種組合物，其包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的多肽。
28. 如權利要求27所述的組合物，其中所述組合物抑制Toso活性。
29. 如權利要求27-28所述的組合物，其中所述多肽是多聚體。
30. 如權利要求29所述的組合物，其中所述多聚體包含6個單體，其中每個單體包含根據SEQ ID NO :6的序列。
31. -種分離的核酸，其編碼如權利要求27-30所述的多肽。
32. -種宿主細胞，其包含編碼如權利要求27-30所述的多肽的核酸。
33. -種包含可溶性多肽的組合物，其中所述可溶性多肽與SEQ ID NO :5或SEQ ID NO: 6具有至少90 %序列同一性。
34. 如權利要求33所述的組合物，其中所述可溶性多肽抑制Toso活性。
35. 如權利要求33-34所述的組合物，其中所述可溶性多肽是多聚體。
36. 如權利要求35所述的組合物，其中所述多聚體包含6個單體，其中每個單體包含根據SEQ ID NO :6的序列。
37. -種分離的核酸，其編碼如權利要求33-36所述的多肽。
38. -種宿主細胞，其包含編碼如權利要求33-36所述的多肽的核酸。
39. -種融合蛋白，其包含人Toso蛋白的胞外結構域、Fc區和多聚化標簽。
40. 如權利要求39所述的融合蛋白，其中所述胞外結構域包含人Toso蛋白的氨基酸 18-253。
41. 如權利要求39-40所述的融合蛋白，其中所述多聚化標簽包含SEQ ID NO :4。
42. 如權利要求39-41所述的融合蛋白，其中所述Fc區包含SEQ ID NO :3。
43. -種分離的核酸，其編碼如權利要求39-42所述的融合蛋白。
44. 一種宿主細胞，其包含編碼如權利要求39-42所述的多肽的核酸。
45. -種分離的可溶性多肽，其包含與具有選自由SEQ ID NO. 1-24組成的組的氨基酸序列的多肽具有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
46. -種產生如權利要求45所述的多肽的方法，所述方法包括提供包含編碼所述多肽的核酸的細胞，其中將所述細胞在適于表達所述多肽的條件下進行培養。
47. -種核酸，其編碼如權利要求45所述的多肽。
48. -種產生根據SEQ ID NO :5或6的多肽的方法，所述方法包括提供包含編碼所述多肽的核酸的細胞，其中將所述細胞在適于表達所述多肽的條件下進行培養。
49. 一種核酸，其編碼根據SEQ ID NO :5或6的多肽。
50. -種宿主細胞，其包含編碼根據SEQ ID NO :5或6的多肽的核酸。
【文檔編號】A61P19/02GK104394880SQ201380023772
【公開日】2015年3月4日申請日期:2013年3月14日優先權日:2012年3月16日
【發明者】M.W.圖舍, T.W.馬克, P.S.奧哈施, P.朗, K.朗, D.布倫納, G.林申請人:大學保健網絡

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