用于治療蓬佩氏病的方法和材料的制作方法
【專利摘要】本文件涉及具有酸性alpha葡糖苷酶活性和至少一處修飾的分子復(fù)合物，所述修飾導(dǎo)致分子復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部的能力增強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】用于治療蓬佩氏病的方法和材料
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)61/611，485的權(quán)益。認(rèn) 為先前申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容是本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容（并且通過(guò)提及并入其中）的一部分。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及具有酸性alpha葡糖苷酶活性的分離的分子復(fù)合物，且更具體地涉及 包含通過(guò)蛋白水解從前體分子衍生的至少兩個(gè)多肽的分子復(fù)合物，其中所述分子復(fù)合物包 含至少一處修飾，其導(dǎo)致所述分子復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部的能力增強(qiáng)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 蓬佩（Pompe)氏?。ㄓ址Q為糖原I&積?。╣lycogen-storage disease) II 型或酸 性麥芽糖酶缺陷）是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性病癥，其由于酸性alpha葡糖苷酶（GAA)缺 陷而導(dǎo)致糖原在溶酶體中的積累。糖原的積累引起遍及全身的進(jìn)行性肌無(wú)力（progressive muscle weakness)(肌病），并且影響各個(gè)身體組織，包括心臟、骨骼肌、肝、和神經(jīng)系統(tǒng)。
[0006] 蓬佩氏病被寬泛地分成嬰兒期發(fā)作性和遲發(fā)性形式。在嬰兒期發(fā)作性形式中，嬰 兒通常在嬰兒期早期（4-8個(gè)月齡）期間呈現(xiàn)無(wú)力和懶散（floppiness)，并且不能舉起他 們的手，而且不能進(jìn)行對(duì)于其年齡而言常見(jiàn)的其他運(yùn)動(dòng)任務(wù)，諸如翻身。在不治療的情況 下，具有蓬佩氏病的嬰兒通常由于心力衰竭（heart failure)和呼吸虛弱（respiratory weakness)而在12個(gè)月齡前死亡。參見(jiàn)United Pompe Foundation。遲發(fā)性形式（包括青少 年和成年形式）比嬰兒期形式具有更晚的發(fā)作并且更慢地進(jìn)展。重組人GAA(Myozyme? 或Lumizyme?)用于治療蓬佩氏病。然而，Myozyme?.或Lumizyme?:都是非常昂貴 的，每年費(fèi)用完全超過(guò)300, 000美元。因而，需要改善的蓬佩氏病治療。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 在一個(gè)方面，本文件的特征在于一種分離的分子復(fù)合物，其具有酸性alpha葡糖 苷酶（GAA)活性，且包含至少兩個(gè)多肽（例如至少三個(gè)或至少四個(gè)多肽），每個(gè)多肽與SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85% (例如至少90%、95%、99%、或100%) 序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之 間或氨基酸60和氨基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序 列的蛋白水解衍生。所述分子復(fù)合物包含至少一處修飾，其導(dǎo)致所述分子復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到 哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部的能力增強(qiáng)。對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解進(jìn)一步可 以包括在SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之間的一個(gè)或多個(gè) 位點(diǎn)處的切割或在SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之間的一 個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切割。蛋白水解進(jìn)一步可以包括在SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的 氨基酸719和氨基酸746之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切割和在SEQ ID NO: 1中所列的氨基 酸序列的氨基酸137和氨基酸151之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切割。
[0009] 在本文中描述的任何分子復(fù)合物中，至少一個(gè)多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)磷酸化的 N-聚糖，且所述修飾可以包含至少一個(gè)磷酸化的N-聚糖的脫帽（uncapping)和脫甘露糖基 化（demannosylation)。至少一個(gè)多肽上的至少40% (例如至少60%、80%、90%、95%、或 99%)的N-聚糖可以是脫帽且脫甘露糖基化的。
[0010] 在本文中描述的任何分子復(fù)合物中，對(duì)于所述至少兩個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,且其中對(duì)于所述至少兩個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至896。
[0011] 在含有至少三個(gè)多肽的本文中描述的任何分子復(fù)合物中，對(duì)于所述至少三個(gè)多肽 之一，所述區(qū)段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,其中對(duì)于所述至少三個(gè)多肽之一，所述 區(qū)段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至726,且其中對(duì)于所述至少三個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包 含SEQ ID NO: 1的氨基酸736至896。
[0012] 在含有至少四個(gè)多肽的本文中描述的任何分子復(fù)合物中，對(duì)于所述至少四個(gè)多肽 之一，所述區(qū)段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,其中對(duì)于所述至少四個(gè)多肽之一，所 述區(qū)段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至143,其中對(duì)于所述至少四個(gè)多肽之一，所述區(qū)段 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸158至726,且其中對(duì)于所述至少四個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 736 至 896。
[0013] 在本文中描述的任何分子復(fù)合物中，所述至少一處修飾可以包括與分子復(fù)合物中 至少一個(gè)多肽融合的下列至少一種：胞外受體的配體，結(jié)合靶細(xì)胞表面上的受體胞外域的 靶向域，尿激酶型纖維蛋白溶酶原受體，或人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的識(shí)別域。
[0014] 本文件的特征還在于包含本文中描述的任何分子復(fù)合物的組合物，其中分子復(fù)合 物是凍干的。所述組合物可以以一次性管形瓶（Single use vial)包裝。
[0015] 本文件的特征還在于藥物組合物，其包含本文中描述的任何分子復(fù)合物和藥學(xué)可 接受載體。所述組合物可以被配制用于靜脈內(nèi)或皮下施用。所述組合物可以被配制用于靜 脈內(nèi)輸注。
[0016] 在另一個(gè)方面，本文件的特征在于治療蓬佩氏病的方法。所述方法包括對(duì)診斷為 蓬佩氏病的患者施用本文中描述的任何組合物。所述患者可以診斷為嬰兒期發(fā)作性蓬佩氏 病或遲發(fā)性蓬佩氏病。
[0017] 本文件的特征還在于生成分子復(fù)合物的方法。所述方法包括使與SEQ ID NO: 1中 所列的氨基酸序列具有至少85 %序列同一性的多肽與蛋白酶接觸，所述蛋白酶與SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少85% (例如至少90%，至少95%，至少99%，或100% ) 序列同一性，其中所述蛋白酶在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68 之間或氨基酸60和氨基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處切割所述多肽。可以在體外實(shí)施 接觸步驟。
[0018] 本文件的特征還在于用于生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子 復(fù)合物的方法。該方法包括使分子復(fù)合物與甘露糖苷酶接觸，所述甘露糖苷酶能夠（i)將 甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸及（ii)水解末端alpha-1，2甘露 糖，alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖連接，所述分子復(fù)合物具有GAA活性且包 含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序 列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間 或氨基酸60和氨基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序 列的蛋白水解衍生，其中在接觸前，至少一個(gè)所述多肽包含含有一個(gè)或多個(gè)甘露糖-1-磷 酸-6-甘露糖模塊的磷酸化N-聚糖。甘露糖苷酶可以是家族38糖基水解酶（例如直生刀 豆（Canavalia ensiformis)甘露糖苷酶或解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)甘露糖 苷酶）?？梢栽诒磉_(dá)甘露糖苷酶的重組真菌細(xì)胞中發(fā)生所述接觸。
[0019] 本文件的特征還在于生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合 物的方法。該方法包括使分子復(fù)合物與甘露糖苷酶接觸，所述甘露糖苷酶能夠水解末端 alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖連接，所述分子復(fù)合物具有 GAA活性且包含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至 少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸 68之間或氨基酸60和氨基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基 酸序列的蛋白水解衍生，其中至少一個(gè)多肽在接觸前包含含有脫帽的甘露糖-6-磷酸模塊 的磷酸化N-聚糖。甘露糖苷酶可以是家族47糖基水解酶（例如齋藤曲霉（Aspergillus satoi)甘露糖苷酶），家族92糖基水解酶（例如纖維化纖維微細(xì)菌（Cellulosimicrobium cellulans)甘露糖苷酶），或家族38糖基水解酶（例如直生刀豆甘露糖苷酶）。可以在表 達(dá)甘露糖苷酶的重組真菌細(xì)胞中發(fā)生所述接觸。
[0020] 本文件的特征還在于生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù) 合物的方法。該方法包括使分子復(fù)合物與甘露糖苷酶接觸，所述甘露糖苷酶能夠?qū)⒏事?糖-1-磷酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸，所述分子復(fù)合物具有GAA活性并且包 含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列 同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或 氨基酸60和氨基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的 蛋白水解衍生，其中在接觸前，至少一個(gè)多肽包含一個(gè)或多個(gè)甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模 塊。甘露糖苷酶可以是家族38糖基水解酶（例如直生刀豆甘露糖苷酶或解脂耶氏酵母甘 露糖苷酶）。
[0021] 在另一個(gè)方面，本文件的特征在于生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚 糖的分子復(fù)合物的方法。該方法包括a)使分子復(fù)合物與能夠?qū)⒏事短?1-磷酸-6-甘露 糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸的甘露糖苷酶接觸以使所述分子復(fù)合物中的至少一個(gè)多肽 上的甘露糖-6-磷酸模塊脫帽，所述分子復(fù)合物具有GAA活性且包含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多 肽與SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)在 氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或氨基酸60和氨基酸65之 間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生；并b)使所 述分子復(fù)合物與能夠水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘 露糖連接的甘露糖苷酶接觸?？梢酝ㄟ^(guò)兩種不同酶催化或者通過(guò)單一酶催化步驟（a)和步 驟（b)。接觸步驟可以一起或分開(kāi)且以任一次序?qū)嵤??？梢栽谥亟M真菌宿主細(xì)胞中發(fā)生接 觸，所述真菌宿主細(xì)胞表達(dá)能夠催化步驟（a)的甘露糖苷酶和能夠催化步驟（b)的甘露糖 苷酶?？梢栽谥亟M真菌宿主細(xì)胞中發(fā)生接觸，所述真菌宿主表達(dá)能夠催化步驟（a)和（b) 的甘露糖苷酶。
[0022] 可以使用包含至少一個(gè)脫帽且脫甘露糖基化的N-聚糖的本文中描述的任何分子 復(fù)合物接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中在接觸后，分子復(fù)合物以增強(qiáng)的效率轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的內(nèi)部。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是人細(xì)胞。
[0023] 本文件的特征還在于將具有GAA活性的分子復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的方法。所述 方法包括使哺乳動(dòng)物細(xì)胞與所述分子復(fù)合物接觸，所述分子復(fù)合物包含至少兩個(gè)多肽，每 個(gè)多肽與SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通 過(guò)在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或氨基酸60和氨基酸 65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生；其中 至少一個(gè)所述多肽上的磷酸化N-聚糖已經(jīng)如本文中描述的方法中所列的那樣脫帽并脫甘 露糖基化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以在體外或在哺乳動(dòng)物受試者中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是人細(xì)胞。
[0024] 在另一個(gè)方面，本文件的特征在于將具有GAA活性的分子復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部 的方法。所述方法包括使哺乳動(dòng)物細(xì)胞與所述分子復(fù)合物接觸，所述分子復(fù)合物包含至少 兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性， 每個(gè)區(qū)段通過(guò)在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或氨基酸 60和氨基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水 解衍生，所述分子復(fù)合物包含至少一處修飾，其導(dǎo)致分子復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi) 部的能力增強(qiáng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以在體外或在哺乳動(dòng)物受試者中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是人 細(xì)胞。所述修飾可以包括與分子復(fù)合物中至少一個(gè)多肽融合的下列任一種：胞外受體的配 體，結(jié)合靶細(xì)胞表面上的受體胞外域的靶向域，尿激酶型纖維蛋白溶酶原受體，或人胰島素 樣生長(zhǎng)因子II的識(shí)別域。
[0025] 在另一個(gè)方面，本文件的特征在于包含編碼堿性蛋白酶的外源核酸的分離的真菌 細(xì)胞，所述堿性蛋白酶與SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。
[0026] 本文件的特征還在于分離的真菌細(xì)胞，其包含編碼SEQ ID NO: 1中所列的GAA氨 基酸序列的核酸和編碼與SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的堿 性蛋白酶的核酸。所述真菌細(xì)胞生成具有GAA活性且包含至少兩個(gè)多肽的分子復(fù)合物，每 個(gè)多肽與SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通 過(guò)所述堿性蛋白酶在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或氨基 酸60和氨基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白 水解衍生。在一些實(shí)施方案中，真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷 酶能夠?qū)⒏事短?1-磷酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸。在一些實(shí)施方案中，真 菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解末端alpha-1，2甘露 糖，alpha-1，3甘露糖和/或alpha-1，6甘露糖連接。在一些實(shí)施方案中，真菌細(xì)胞進(jìn)一步 可以包含編碼甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能夠（i)將甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖 模塊水解成甘露糖-6-磷酸并（ii)水解末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3甘露糖和/或 alpha-1，6甘露糖連接。任何此類真菌細(xì)胞進(jìn)一步可以包括編碼能夠促進(jìn)甘露糖基磷酸化 的多肽的核酸和/或遺傳工程化改造為OCHl活性缺陷。
[0027] 除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員的通常理解具有相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材 料可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，下文描述了例示性的方法和材料。本文中提及的所有出版 物，專利申請(qǐng)，專利，Genbank?·登錄號(hào)，和其它參考文獻(xiàn)通過(guò)提及完整并入。在沖突的情 況下，應(yīng)以本申請(qǐng)（包括定義）為準(zhǔn)。材料，方法和例子僅僅是例示的，而并不意圖為限制 的。
[0028] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從以下詳細(xì)描述及從權(quán)利要求書看會(huì)是顯而易見(jiàn)的。
[0029] 附圖簡(jiǎn)述
[0030] 圖1是切割信號(hào)序列后人酸性alpha葡糖苷酶（GAA)的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1) 的圖。
[0031] 圖2A是DsbA-纖維化纖維微細(xì)菌甘露糖苷酶5 (CcMan5)的可讀框（ORF)的核苷 酸序列（SEQ ID NO:2)的圖。
[0032] 圖2B是具有粗體的信號(hào)序列的CcMan5多肽的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)的圖。
[0033] 圖2C是沒(méi)有信號(hào)序列的CcMan5多肽的氨基酸序列（SEQ ID N0:4)的圖。沒(méi)有信 號(hào)序列的CcMan5多肽的預(yù)測(cè)分子量是173kDa。
[0034] 圖3A和3B是一系列電泳圖，其描繪了用CcMan5和JbMan處理的rhGAA的N-聚糖 分析。使用DNA測(cè)序儀輔助的、熒光團(tuán)輔助的碳水化合物電泳（DSA-FACE)實(shí)施分析。Y軸 代表相對(duì)熒光單位，作為每個(gè)N-聚糖結(jié)構(gòu)的量的指示。X軸代表每個(gè)N-聚糖結(jié)構(gòu)通過(guò)毛細(xì) 管的相對(duì)遷移率。在圖3A和圖3B兩者中，小圖A是含有用PNGaseF從RNaseB釋放的N-聚 糖的參照樣品。在圖3A中，小圖B和C含有分別用CcMan5和JbMan處理之前和之后來(lái)自 huGAA(76kD變體）的N-聚糖分析。在圖3B中，小圖B、C、和D分別含有來(lái)自huGAA76kD形 式、95kD形式、和IlOkD形式的N-聚糖分析。
[0035] 圖4是使用家兔肝糖原作為底物用My〇Zyme( · )，76kDa GAA( ▲ )，95kDa GAA(V)，和IlOkDa GAA( ?)每分鐘形成的葡萄糖量的線圖。
[0036] 圖5A含有心臟中各個(gè)小鼠的糖原水平（μ g/mg蛋白質(zhì)）的兩幅圖。圖5B含有骨 骼肌中各個(gè)小鼠的糖原水平（μ g/mg蛋白質(zhì)）的兩幅圖。紅色點(diǎn)是雌性，黑色點(diǎn)是雄性。線 代表每組的中值。
[0037] 圖6含有解脂耶氏酵母AMSl甘露糖苷酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 5)的圖。
[0038] 圖7含有齋藤曲霉甘露糖苷酶的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)的圖。
[0039] 圖8含有纖維化纖維微細(xì)菌甘露糖苷酶4 (CcMan4, SEQ ID NO: 7)的氨基酸序列的 圖，信號(hào)序列為粗體。沒(méi)有信號(hào)序列的CcMan4多肽的預(yù)測(cè)分子量是184kDa。
[0040] 圖9含有包含信號(hào)肽（21個(gè)氨基酸），前肽（pro-p印tide) (100個(gè)氨基酸）和成熟 蛋白質(zhì)（282個(gè)氨基酸）的米曲霉（Aspergillus oryzae)堿性蛋白酶的氨基酸序列（SEQ ID N0:9)的圖。
[0041] 圖10含有融合構(gòu)建體的核苷酸序列的圖，所述融合構(gòu)建體含有編碼米曲霉堿性 蛋白酶的經(jīng)解脂耶氏酵母密碼子優(yōu)化的序列（SEQ ID N0:10)。用于克隆的限制性位點(diǎn)加下 劃線。編碼接頭的核苷酸序列為粗體，并且編碼His標(biāo)簽（10個(gè)His殘基）的核苷酸序列 為斜體。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] 一般而言，本文件提供了分離的分子復(fù)合物，其具有酸性alpha-葡糖苷酶（GAA) 活性和至少一處修飾，該修飾導(dǎo)致被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部的能力增強(qiáng)。GAA以含有 N-連接的聚糖的IlOkDa前體合成。前體被蛋白水解加工以除去信號(hào)序列，然后進(jìn)一步蛋白 水解加工成95kDa，76kDa，和70kDa的主要種類。然而，從前體釋放的至少一些肽仍然與主 要種類聯(lián)合。參見(jiàn)例如Moreland等，J. Biol. Chem.，280:6780-6791 (2005)。如此，具有本 文中描述的GAA活性的分子復(fù)合物包含至少兩個(gè)多肽（至少兩個(gè)，三個(gè)，或四個(gè)多肽），其通 過(guò)在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)前體分子的蛋白水解切割衍生。分子復(fù)合物中的至少兩個(gè)多肽源 自前體中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解切割。例如，SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的 蛋白水解可以介于氨基酸50和氨基酸74之間，例如在氨基酸56和氨基酸68之間或在氨 基酸60和氨基酸65之間，以生成至少兩個(gè)多肽。含有兩個(gè)多肽的分子復(fù)合物在本文中稱 為95kDa形式。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，分子復(fù)合物中的至少三個(gè)多肽源自前體中兩個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn) 的蛋白水解切割。例如，SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解在氨基酸50和氨基 酸74之間（例如氨基酸50和氨基酸74之間或氨基酸60和氨基酸65之間）的切割外可 以包括SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之間的一個(gè)或多個(gè)位 點(diǎn)處的切割或氨基酸137和氨基酸151之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切割。含有三個(gè)多肽的 分子復(fù)合物在本文中稱為76kDa形式。
[0045] 在一些實(shí)施方案中，分子復(fù)合物中的至少四個(gè)多肽源自前體中三個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn) 處的蛋白水解切割。例如，SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解在氨基酸50和氨 基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或氨基酸60和氨基酸65之間）的切割外 可以包括SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之間的一個(gè)或多個(gè) 位點(diǎn)處的切割或SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之間的一個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)處的切割。含有四個(gè)多肽的分子復(fù)合物在本文中稱為70kDa形式。
[0046] 應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，可以在一個(gè)分子中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處發(fā)生切割，且切割位點(diǎn)在不同 分子中可以是不同的。
[0047] 可以使用含有來(lái)自米曲霉的蛋白酶的商品化蛋白酶混合物（例如來(lái)自Sigma或 NovozymesCorp)在氨基酸50和74之間，例如在氨基酸56和68之間或氨基酸60和65之間 切割SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列。或者，可以使用與來(lái)自米曲霉的堿性蛋白酶（SEQ ID N0:8)具有至少85% (例如，至少90%、95%、97%、98%、99%、或100%)序列同一性的 堿性蛋白酶。例如，如本文中描述的，可以使具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的GAA 多肽與蛋白酶接觸，所述蛋白酶與SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9中所列的氨基酸序列具有至 少85%序列同一性。SEQ ID N0:8是成熟米曲霉堿性蛋白酶的氨基酸序列。SEQ ID N0:9 是包含信號(hào)肽、前肽和成熟蛋白的米曲霉蛋白酶的氨基酸序列?？梢允褂米悦浊狗蛛x或 已經(jīng)重組生成的蛋白酶在體外發(fā)生接觸?；蛘?，可以將真菌宿主工程化改造為使得GAA多 肽和堿性蛋白酶都被分泌到培養(yǎng)基中，其中堿性蛋白酶可以在氨基酸50和氨基酸74之間 (例如氨基酸56和68之間或氨基酸60和氨基酸65之間）切割SEQ ID NO: 1中所列的氨 基酸序列。
[0048] 本文中描述的分離的分子復(fù)合物具有至少一處修飾，該修飾導(dǎo)致被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng) 物細(xì)胞內(nèi)部的能力增強(qiáng)。增強(qiáng)復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部的能力的修飾的非限制性 例子包括磷酸化的N-聚糖的脫帽和脫甘露糖基化或促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)的肽標(biāo)簽。本文中描述了用 于制備含有標(biāo)簽或脫帽且脫甘露糖基化的N-聚糖的分子復(fù)合物的方法和材料。
[0049] 本文中描述的分離的分子復(fù)合物特別可用于治療蓬佩氏病患者，包括診斷為蓬佩 氏病，即嬰兒期發(fā)作性蓬佩氏病和遲發(fā)性蓬佩氏病兩者的患者。蓬佩氏病由于GAA缺陷而 導(dǎo)致糖原在溶酶體中的積累。糖原的積累引起遍及全身的進(jìn)行性肌無(wú)力（肌?。?，并且影響 各個(gè)身體組織，包括心臟、骨骼肌、肝、和神經(jīng)系統(tǒng)。
[0050] 分子復(fù)合物中的每個(gè)多肽與SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少 85%序列同一性（例如至少90%，95%，97%，98%，99%，或100% )，每個(gè)區(qū)段通過(guò)在氨基 酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或氨基酸60和氨基酸65之間） 的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生?？梢匀缦聹y(cè)定 特定的氨基酸序列和SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列之間的百分比同一性。首先，使用 來(lái)自含有BLASTP第2. 0. 14版的BLASTZ單機(jī)版本的BLAST 2 Sequences (B12seq)程序比 對(duì)氨基酸序列。BLASTZ的此單機(jī)版本可以獲自Fish&Richardson站點(diǎn)（例如www. fr. com/ blast/)或美國(guó)政府的國(guó)立生物技術(shù)信息中心站點(diǎn)（www. ncbi.nlm.nih.gov)。解釋如何使 用B12seq程序的指導(dǎo)可以參見(jiàn)BLASTZ所附的自述文件。B12seq使用BLASTP算法實(shí)施兩 種氨基酸序列之間的比較。為了比較兩種氨基酸序列，B12seq的選項(xiàng)如下設(shè)置：-i設(shè)置為 含有要比較的第一氨基酸序列的文件（例如C:\seql. txt) ;_j設(shè)置為含有要比較的第二氨 基酸序列的文件（例如C:\seq2. txt) ;_p設(shè)置為blastp ;_〇設(shè)置為任何期望的文件名稱 (例如C:\output. txt);并且所有其他選項(xiàng)保留為其缺省設(shè)置。例如，可以使用以下命令來(lái) 產(chǎn)生含有兩種氨基酸序列見(jiàn)的比較的輸出文件：C:\B12seq - ic:\seql. txt - j c:\seq2. txt-p blastp-ο c:\output. txt。若兩個(gè)比較序列共享同源性，則指定的輸出文件會(huì)呈 現(xiàn)與比對(duì)序列的同源性的那些區(qū)域。若兩個(gè)比對(duì)序列不共享同源性，則指定的輸出文件不 會(huì)呈現(xiàn)比對(duì)序列。核酸序列可以遵循相似的規(guī)程，只是使用blastn。
[0051] 在比對(duì)后，通過(guò)計(jì)算兩個(gè)序列中呈現(xiàn)相同氨基酸殘基的位置的數(shù)目測(cè)定匹配數(shù) 目。通過(guò)用匹配的數(shù)目除以全長(zhǎng)多肽氨基酸序列的長(zhǎng)度，接著用所得的數(shù)值乘以100測(cè)定 百分比同一性。
[0052] 注意到，百分比同一性數(shù)值四舍五入到最近的十分位。例如，78. 11，78. 12, 78. 13， 和78. 14向下四舍五入到78. 1，而78. 15, 78. 16, 78. 17, 78. 18,和78. 19向上四舍五入到 78.2。還注意到長(zhǎng)度數(shù)值會(huì)總是整數(shù)。
[0053] 應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，許多核酸可以編碼具有特定氨基酸序列的多肽。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性是 本領(lǐng)域公知的；即對(duì)于許多氨基酸，存在有超過(guò)一個(gè)充當(dāng)氨基酸密碼子的核苷酸三聯(lián)體。例 如，可以修飾給定GAA多肽的編碼序列中的密碼子，使得特定物種（例如細(xì)菌或真菌）中的 最佳表達(dá)使用適合于所述物種的密碼子偏愛(ài)表獲得。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，分子復(fù)合物可以包含至少兩個(gè)多肽，其中一個(gè)多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,且另一個(gè)多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至896。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，分子復(fù)合物可以包含至少三個(gè)多肽，其中一個(gè)多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57, 一個(gè)多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至726,且一個(gè)多肽包 含SEQ ID NO: 1的氨基酸736至896。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，分子復(fù)合物可以包含至少四個(gè)多肽，其中一個(gè)多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57, 一個(gè)多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至143, 一個(gè)多肽包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸158至726,且一個(gè)多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸736至896。
[0057] 相對(duì)于SEQ ID NO: 1中所列的序列，GAA的生物學(xué)活性變體可以含有添加，缺失， 或取代。具有取代的GAA蛋白一般會(huì)具有不超過(guò)10個(gè)（例如不超過(guò)1、2、3、4、5、6、7、8、9、 或10)個(gè)保守氨基酸取代。保守取代是用一個(gè)氨基酸取代具有相似特征的另一個(gè)。保守取 代包括下組內(nèi)的取代：纈氨酸，丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸，纈氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和 谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸，半胱氨酸，和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸 和酪氨酸。非極性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬 酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的（堿性）氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的 (酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。將上文提及的極性、堿性或酸性組的一個(gè)成員用相 同組的另一成員的任何取代可以視為保守取代。比較而言，非保守取代是用一個(gè)氨基酸取 代具有不同特征的另一個(gè)。
[0058] 在一些實(shí)施方案中，GAA多肽可以是與異源氨基酸序列的融合蛋白，所述異源氨 基酸序列諸如用于純化重組蛋白的序列（例如FLAG，多組氨酸（例如六組氨酸），血凝素 (hemagluttanin) (HA)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)，或麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP))。
[0059] 在一些實(shí)施方案中，使用異源氨基酸序列增強(qiáng)將分子復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中的效率。例如，可以將復(fù)合物中的至少一個(gè)多肽與胞外受體的配體，結(jié)合靶細(xì)胞表面上的 受體的胞外域的靶向域，尿激酶型纖維蛋白溶酶原受體，或結(jié)合甘露糖-6-磷酸受體的人 胰島素樣生長(zhǎng)因子II的結(jié)構(gòu)域（例如人胰島素樣生長(zhǎng)因子的氨基酸1-67或1-87 ;至少氨 基酸48-55 ;至少氨基酸8-28和41-61 ;或至少氨基酸8-87 ;人胰島素樣生長(zhǎng)因子III的 其序列變體（例如R68A)或人胰島素樣生長(zhǎng)因子的截短形式（例如從第62位起的C端截 短））融合。異源氨基酸序列可以在多肽的N端或C端融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)間隔 物（例如5-30個(gè)氨基酸或10-25個(gè)氨基酸）將肽標(biāo)簽與多肽的N或C端融合。參見(jiàn)例如 美國(guó)專利 No. 7, 785, 856。
[0060] 異源氨基序列還可以是可用作診斷或可檢測(cè)標(biāo)志物的蛋白質(zhì)，例如螢光素酶，綠 色熒光蛋白（GFP)，或氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT)。
[0061] 在某些宿主細(xì)胞（例如酵母宿主細(xì)胞）中，可以通過(guò)使用異源信號(hào)序列提高靶蛋 白的表達(dá)和/或分泌。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引發(fā)免疫應(yīng)答以 生成抗體的載體（例如KLH)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體保留信號(hào)。異源序列可以具有不同的長(zhǎng) 度，并且在一些情況下可以是比與異源序列附接的全長(zhǎng)靶蛋白更長(zhǎng)的序列。
[0062] 使糖蛋白脫甘露糖基化，或脫帽并脫甘露糖基化的方法
[0063] 可以使含有磷酸化的N-聚糖的糖蛋白脫甘露糖基化，并且可以使含有含甘露 糖-1-磷酸-6-甘露糖連接或模塊的磷酸化的N-聚糖的糖蛋白脫帽并脫甘露糖基化，其通 過(guò)使糖蛋白與甘露糖苷酶接觸進(jìn)行，所述甘露糖苷酶能夠（i)將甘露糖-1-磷酸-6-甘露 糖連接或模塊水解成甘露糖-6-磷酸及（ii)水解末端alpha-1，2甘露糖，alpha-1，3甘露 糖和/或alpha-1，6甘露糖連接或模塊。每個(gè)甘露糖苷酶的非限制性例子包括直生刀豆 (刀豆（Jack bean))甘露糖苷酶和解脂耶氏酵母甘露糖苷酶（例如AMSl)。刀豆和AMSl 甘露糖苷酶兩者是家族38糖苷水解酶。
[0064] 刀豆甘露糖苷酶以硫酸銨懸浮液（產(chǎn)品目錄編號(hào)M7257)和蛋白質(zhì)組學(xué)級(jí)制劑 (產(chǎn)品目錄編號(hào)M5573)可購(gòu)自例如Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。此類商業(yè)制劑可以例 如通過(guò)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化以除去污染物，諸如磷酸酶。刀豆甘露糖苷酶含有具有以 下氨基酸序列 NKIPRAGWQIDPFGHSAVQG(SEQ ID N0:11)的區(qū)段。參見(jiàn) Howard 等，J. Biol. Chem.，273(4):2067 - 2072, 1998。
[0065] 解脂耶氏酵母AMSl甘露糖苷酶可以是重組生成的。AMSl多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:5中列出（還可見(jiàn)圖6)。
[0066] 在一些實(shí)施方案中，脫帽和脫甘露糖基化步驟通過(guò)兩種不同的酶催化。例如，可以 使用來(lái)自纖維化纖維微細(xì)菌的甘露糖苷酶（例如CcMan5)實(shí)施甘露糖-1-磷酸-6甘露糖 連接或模塊的脫帽。編碼CcMan5多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO:2中列出（參見(jiàn)圖2A)。 含有信號(hào)序列的CcMan5多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO: 3中列出（參見(jiàn)圖2B)。沒(méi)有信號(hào) 序列的CcMan5多肽的氨基酸序列在SEQ ID N0:4中列出（參見(jiàn)圖2C)。在一些實(shí)施方案 中，使用CcMan5多肽的生物學(xué)活性片段。例如，生物學(xué)活性片段可以包含SEQ ID N0:4中 所列的氨基酸序列的殘基1-774。還可見(jiàn)WO 2011/039634。CcMan5甘露糖苷酶是家族92 糖苷水解酶。
[0067] 可以使用來(lái)自齋藤曲霉（As)(又稱為海麥曲霉（Aspergillus phoenicis))的甘 露糖苷酶或來(lái)自纖維化纖維微細(xì)菌的甘露糖苷酶（例如CcMan4)催化脫帽的糖蛋白或糖蛋 白的分子復(fù)合物的脫甘露糖基化。齋藤曲霉甘露糖苷酶是家族47糖苷水解酶，而CcMan4甘 露糖苷酶是家族92糖苷水解酶。齋藤曲霉甘露糖苷酶的氨基酸序列在圖7(SEQ ID N0:6) 和GenBank登錄號(hào)BAA08634中列出。CcMan4多肽的氨基酸序列在圖8(SEQ ID N0:7)中列 出。
[0068] 還可以使用來(lái)自家族38糖苷水解酶的甘露糖苷酶，諸如直生刀豆（刀豆）甘露糖 苷酶或解脂耶氏酵母甘露糖苷酶（例如AMSl)催化脫帽的糖蛋白或糖蛋白的分子復(fù)合物 的脫甘露糖基化。例如，可以使用CcMan5使糖蛋白（或糖蛋白的分子復(fù)合物）上的甘露 糖-1-磷酸-6甘露糖模塊脫帽，并且可以使用刀豆甘露糖苷酶使脫帽的糖蛋白（或糖蛋白 的分子復(fù)合物）脫甘露糖基化。
[0069] 為了生成脫甘露糖基化的糖蛋白（或糖蛋白的分子復(fù)合物），或脫帽并脫甘露糖 基化的糖蛋白（或糖蛋白的分子復(fù)合物），在合適的條件下使含有甘露糖-1-磷酸-6甘露 糖連接或模塊的靶分子（或分子復(fù)合物）與合適的甘露糖苷酶和/或含有合適的重組生成 的甘露糖苷酶的細(xì)胞裂解物接觸。上文描述了合適的甘露糖苷酶。細(xì)胞裂解物可以來(lái)自任 何遺傳工程細(xì)胞，包括真菌細(xì)胞，植物細(xì)胞，或動(dòng)物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞的非限制性例子包括線 蟲、昆蟲、植物、禽、爬行動(dòng)物、和哺乳動(dòng)物諸如小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、 牛、馬、鯨、猴、或人。
[0070] 在使靶分子（例如分子復(fù)合物）與純化的甘露糖苷酶和/或細(xì)胞裂解物接觸后， 可以將甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接或模塊水解成磷酸-6-甘露糖，并可以水解此類含 有磷酸根的聚糖的末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖連 接或模塊以生成脫帽并脫甘露糖基化的靶分子。在一些實(shí)施方案中，使用一種甘露糖苷酶， 其催化脫帽和脫甘露糖基化步驟兩者。在一些實(shí)施方案中，使用一種甘露糖苷酶催化脫帽 步驟，并使用不同甘露糖苷酶催化脫甘露糖基化步驟。在甘露糖苷酶處理后，可以分離靶分 子或分子復(fù)合物。
[0071] 保持裂解物中甘露糖苷酶活性的活性或完整性的適合于獲得細(xì)胞裂解物的方 法可以包括使用合適的緩沖液和/或抑制劑，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，其 保持細(xì)胞裂解物中的N-糖基化活性或者使細(xì)胞裂解物中的N-糖基化活性的變化最小 化。此類抑制劑包括例如螯合劑諸如乙二胺四乙酸（EDTA)、乙二醇二（P-氨乙基醚） N，N，N1，N1-四乙酸（EGTA)、蛋白酶抑制劑諸如苯甲磺酰氟（PMSF)、抑肽酶、亮抑酶肽 (Ieupeptin)、抗蛋白酶（antipain)等等，及磷酸酶抑制劑諸如磷酸鹽、氟化鈉、f凡酸鹽， 等等。適合于獲得包含酶促活性的裂解物的緩沖液和條件記載于例如Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John ffiley&Sons, New York (1999)； Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) ；Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry,3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. ff. B. Saunders, Philadelphia, (1999)〇
[0072] 在適當(dāng)時(shí)，可以將細(xì)胞裂解物進(jìn)一步加工以消除干擾性物質(zhì)或使干擾性物質(zhì)的存 在最小化。若想要的話，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法將細(xì)胞裂解物分級(jí)，所述 方法包括亞細(xì)胞分級(jí)、和層析技術(shù)諸如離子交換、疏水性和反相、大小排阻、親和、疏水性電 荷誘導(dǎo)層析，等等。
[0073] 在一些實(shí)施方案中，可以制備細(xì)胞裂解物，其中整個(gè)細(xì)胞細(xì)胞器保持完整和/或 功能性。例如，裂解物可以含有下列一種或多種：完整的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、完整的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 或完整的高爾基體。適合于制備含有完整細(xì)胞細(xì)胞器的裂解物及測(cè)試細(xì)胞器功能性的方法 記載于例如 Moreau 等（1991) J. Biol. Chem. 266(7) :4329-4333 ;Moreau 等（1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328 ;Rexach 等（1991)J. Cell Biol. 114(2):219-229 ;and Paulik 等 (1999)Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273。
[0074] 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞與含有脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合物接觸 后，分子復(fù)合物可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞（例如人細(xì)胞）內(nèi)部。具有脫帽的，但未脫甘露 糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合物實(shí)質(zhì)上不結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受 體，并且因此沒(méi)有被有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的內(nèi)部。如本文中使用的，"實(shí)質(zhì)上不結(jié)合"意指小于 15% (例如小于 14%，12%，10%，8%，6%，4%，2%，1%，0.5%，或更小，或0%)的糖蛋 白分子結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受體。然而，若使此類分子復(fù)合物與能夠在 下層甘露糖被磷酸化時(shí)水解末端alpha-1，2甘露糖連接連接或模塊的甘露糖苷酶接觸，生 成脫甘露糖基化的糖蛋白，其實(shí)質(zhì)上結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受體，并且被 有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部。如本文中使用的，"實(shí)質(zhì)上結(jié)合"意指15%或更多（例如大于16%， 18 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%或95%)的分子復(fù)合物結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受體。應(yīng)當(dāng)理解，含有 使磷酸化的N-聚糖脫帽但不脫甘露糖基化的酶的制備物（例如重組宿主細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞制 備物）可以被使磷酸化N-聚糖脫甘露糖基化的酶污染。與此類制備物接觸后的靶蛋白樣 品可以含有具有僅脫帽的一些磷酸化N-聚糖和脫帽并脫甘露糖基化的其它磷酸化N-聚糖 的蛋白質(zhì)分子。自然地，含有脫帽并脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的那些蛋白質(zhì)分子實(shí)際 上可以結(jié)合甘露糖-6-磷酸受體。"實(shí)際上不結(jié)合"的上述定義不適用于此類靶蛋白樣品， 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子上的磷酸化N-聚糖不能表征為脫帽但未脫甘露糖基化的。
[0075] 如此，本文件提供了將分子復(fù)合物從不結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受 體的第一種形式轉(zhuǎn)化為確實(shí)結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受體的第二種形式的 方法。如下的分子復(fù)合物為第一種形式，其中復(fù)合物中的至少一個(gè)多肽包含含有一個(gè)或多 個(gè)甘露糖殘基的一個(gè)或多個(gè)N-聚糖，所述甘露糖殘基在1位與在6位含有磷酸根殘基的甘 露糖殘基連接。在此類方法中，使分子復(fù)合物的第一種形式與使末端甘露糖殘基脫甘露糖 基化的甘露糖苷酶接觸，從而導(dǎo)致在6位含有磷酸根的甘露糖變?yōu)槟┒烁事短恰Ｔ谝恍?shí) 施方案中，甘露糖苷酶具有脫帽和脫甘露糖基化活性兩者（例如直生刀豆（Jack bean)或 解脂耶氏酵母AMSl甘露糖苷酶）。在一些實(shí)施方案中，甘露糖苷酶沒(méi)有脫帽活性（例如來(lái) 自齋藤曲霉的甘露糖苷酶或來(lái)自纖維化纖維微細(xì)菌的甘露糖苷酶（例如CcMan4))。
[0076] 可以使用細(xì)胞攝取測(cè)定法評(píng)估糖蛋白或分子復(fù)合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，可 以使哺乳動(dòng)物細(xì)胞和含有脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合物溫育，然后 將細(xì)胞清洗并裂解。細(xì)胞裂解物可以評(píng)估GAA復(fù)合物的存在（例如通過(guò)Western印跡）或 通過(guò)細(xì)胞裂解物中的GAA活性評(píng)估。例如，可以在酸性alpha葡糖苷酶活性缺陷的成纖維 細(xì)胞中評(píng)估攝取?？梢允褂?-甲基傘形酮基-alpha-D-葡糖批喃糖苷（4-methylumbellif eryl-alpha-D-glucopyranoside，4_MUG)測(cè)定法評(píng)估alpha葡糖苷酶的胞內(nèi)活性。葡糖苷 酶對(duì)底物4-MUG的切割導(dǎo)致產(chǎn)生熒光生成性產(chǎn)物4-MU，其可以通過(guò)用UV光照射顯現(xiàn)或檢 測(cè)。
[0077] 多肽的重組生成
[0078] 可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成編碼多肽（例如甘露糖苷酶、堿性蛋白酶、或GAA或其片 段）的分離的核酸分子。術(shù)語(yǔ)"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互換使用，指RNA和DNA兩 者，包括cDNA、基因組DNA、合成的DNA、和含有核酸類似物的DNA (或RNA)。多核苷酸可以 具有任何三維結(jié)構(gòu)。核酸可以是雙鏈或單鏈（即，有義鏈或反義鏈）。多核苷酸的非限制性 例子包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA (mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、s i RNA、微 小RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何 序列的分離的RNA、核酸探針、和引物，以及核酸類似物。
[0079] "分離的核酸"指與存在于天然存在的基因組的其它核酸分子分開(kāi)的核酸，包括通 常在天然存在的基因組（例如，酵母基因組）中的核酸的一側(cè)或兩側(cè)側(cè)翼的核酸。如本文 中所使用的，術(shù)語(yǔ)"分離的"就核酸而言還包括任何非天然存在的核酸序列，因?yàn)榇祟惙翘?然存在的序列不存在于自然界，并且在天然存在的基因組中沒(méi)有剛好連續(xù)的序列。
[0080] 分離的核酸可以是例如，DNA分子，只要通常剛剛在天然存在的基因組中的DNA分 子側(cè)翼找到的核酸序列之一被除去或缺乏。如此，分離的核酸包括但不限于作為不依賴于 其它序列的不同分子（例如，化學(xué)合成的核酸、或通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理生成的 cDNA或基因組DNA片段）存在的DNA分子以及摻入載體、自主復(fù)制型質(zhì)粒、病毒（例如，任 何副粘液病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、或皰疹病毒）中，或摻入原核生物或真核生物 的基因組DNA中的DNA。另外，分離的核酸可以包括經(jīng)工程化改造的核酸諸如作為雜合或融 合核酸的一部分的DNA分子。認(rèn)為存在于例如cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，或含有基因組DNA 限制性消化物的凝膠切片內(nèi)的數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)個(gè)其它核酸間的核酸不是分離的核酸。
[0081] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"外源的"就核酸和特定宿主細(xì)胞而言意指不存在于（并 且不能獲自）如自然界中找到的所述特定細(xì)胞的任何核酸。如此，認(rèn)為一旦導(dǎo)入宿主細(xì)胞 中，非天然存在的核酸對(duì)于宿主細(xì)胞而言是外源的。重要的是，注意到非天然存在的核酸可 以含有自然界中找到的核酸亞序列或核酸序列片段，只要整個(gè)核酸不存在于自然界中。例 如，在表達(dá)載體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且如此一旦導(dǎo) 入宿主細(xì)胞中，對(duì)于宿主細(xì)胞而言是外源的，因?yàn)檎麄€(gè)核酸分子（基因組DNA加載體DNA) 不存在于自然界中。如此，認(rèn)為作為整體不存在于自然界中的任何載體、自主復(fù)制型質(zhì)粒、 或病毒（例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、或皰疹病毒）是非天然存在的核酸。由此可見(jiàn)，認(rèn)為通 過(guò)PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段及cDNA是非天然存在的核酸，因?yàn)?它們以自然界中找不到的分開(kāi)的分子存在。由此還可見(jiàn)，以自然界中找不到的排列含有啟 動(dòng)子序列和多肽編碼序列（例如，cDNA或基因組DNA)的任何核酸是非天然存在的核酸。天 然存在的核酸可以是特定細(xì)胞外源的。例如，一旦自酵母X細(xì)胞分離的整個(gè)染色體被導(dǎo)入 酵母細(xì)胞中，所述染色體對(duì)于酵母y細(xì)胞而言是外源核酸。
[0082] 可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)來(lái)獲得含有本文中所描述的核苷酸序列的 分離的核酸。可以使用PCR從DNA及RNA (包含來(lái)自總基因組DNA或總細(xì)胞RNA的序列） 擴(kuò)增特定序列。一般地，采用來(lái)自感興趣區(qū)域末端或之外的序列信息來(lái)設(shè)計(jì)與要擴(kuò)增的模 板的相反鏈在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。多種PCR策略也是可用的，通過(guò)所述PCR 策略可以將位點(diǎn)特異性核苷酸序列修飾引入模板核酸中。分離的核酸也可以作為單一核酸 分子（例如使用亞磷酰胺（phosphoramidite)技術(shù)以3'至5'方向使用自動(dòng)化DNA合成） 或者作為一系列寡核苷酸化學(xué)合成。例如，可以合成含有期望序列的一對(duì)或多對(duì)長(zhǎng)的寡核 苷酸（例如，大于100個(gè)核苷酸），其中每對(duì)含有短的互補(bǔ)性區(qū)段（例如，約15個(gè)核苷酸）， 使得在寡核苷酸對(duì)退火時(shí)形成雙鏈體。使用DNA聚合酶來(lái)延長(zhǎng)寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸對(duì) 生成單一的、雙鏈核酸分子，然后，可以將其連接到載體中。也可以通過(guò)例如對(duì)天然存在的 DNA的誘變來(lái)獲得分離的核酸。
[0083] 為了重組生成多肽（例如甘露糖苷酶，堿性蛋白酶，或GAA或其片段），使用含有與 編碼多肽的核酸可操作連接的啟動(dòng)子的載體。如本文中所使用的，"啟動(dòng)子"指使基因能夠 得到轉(zhuǎn)錄的DNA序列。RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子，然后其啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。如此，啟動(dòng)子含有由RNA 聚合酶直接結(jié)合的，或者牽涉RNA聚合酶募集的DNA序列。啟動(dòng)子序列還可以包含"增強(qiáng)子 區(qū)"，其是一種或多種可以與蛋白質(zhì)（即，反式作用因子，很像一組轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合以增強(qiáng)基 因簇中基因的轉(zhuǎn)錄水平（因此得名）的DNA區(qū)。雖然通常在編碼區(qū)的5'端，增強(qiáng)子也可以 與啟動(dòng)子序列分開(kāi)，并且可以例如在基因的內(nèi)含子區(qū)內(nèi)或在基因編碼區(qū)的3'。
[0084] 如本文中所使用的，"可操作連接"意指摻入遺傳構(gòu)建體（例如，載體）中，使得表 達(dá)控制序列有效控制感興趣的編碼序列表達(dá)。
[0085] 可以將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中（例如，通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染來(lái)進(jìn)行）以表達(dá)編碼 的多肽，然后，可以將所述編碼的多肽純化?？梢杂糜诙嚯模ɡ绺事短擒彰?，堿性蛋白 酶，或GAA或其片段）的小規(guī)?；虼笠?guī)模生成的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于微生物體，諸如 用含有核酸分子的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌（例如， 大腸桿菌（E. coli))，和用含有核酸分子的重組真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的真菌（例如解脂耶 氏酵母、Arxula adeninivorans、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)、多形漢森酵母 (Hansenula polymorpha)、Ogataea minuta、甲醇畢赤酵母（Pichia methanolica)、黑曲 霉（Aspergillus niger)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))。有用的表達(dá)系統(tǒng)還包括用含有核酸分子的重組病毒表達(dá)載體（例如桿狀病 毒）感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、和用重組病毒表達(dá)載體（例如，煙草花葉病毒）感染或用含有核 酸分子的重組質(zhì)粒表達(dá)載體（例如Ti質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)。也可以使用哺乳動(dòng)物表 達(dá)系統(tǒng)來(lái)生成甘露糖苷酶或堿性蛋白酶多肽，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)包括含有重組表達(dá)構(gòu) 建體的細(xì)胞（例如，永生化細(xì)胞系諸如COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、人胚腎293 細(xì)胞、和3T3L1細(xì)胞），所述重組表達(dá)構(gòu)建體含有源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組（例如，金屬硫蛋 白啟動(dòng)子）或哺乳動(dòng)物病毒（例如腺病毒晚期啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子）的啟動(dòng)子。
[0086] 通常，可以用異源氨基酸序列諸如FLAG、多組氨酸（例如，六組氨酸）、血凝素 (HA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)給重組多肽諸如甘露糖苷酶 加標(biāo)簽以幫助純化蛋白質(zhì)。用于純化蛋白質(zhì)的其它方法包括層析技術(shù)諸如離子交換、 疏水性和反相、大小排阻、親和、疏水性電荷誘導(dǎo)層析，等等（參見(jiàn)例如Scopes, Protein Purification!Principles and Practice,third edition,Springer-Verlagj New York(1993) ；Burton and Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81(1998)) 〇
[0087] 使糖蛋白脫帽和脫甘露糖基化的體內(nèi)方法
[0088] 可以使用本文中描述的遺傳工程化細(xì)胞生成具有GAA活性的分子復(fù)合物。例如， 可以使用遺傳工程化細(xì)胞生成分子復(fù)合物，該分子復(fù)合物具有GAA活性并且包含至少兩個(gè) 多肽，每個(gè)多肽與SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè) 區(qū)段通過(guò)在氨基酸50和氨基酸74之間（例如氨基酸56和氨基酸68之間或氨基酸60和氨 基酸65之間）的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處對(duì)SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生。 例如，真菌細(xì)胞可以工程化改造為包含編碼SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的核酸和編 碼與SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的堿性蛋白酶的核酸，使 得每個(gè)編碼的多肽被分泌到培養(yǎng)基中，其中堿性蛋白酶可以切割SEQ ID NO: 1中所列的氨 基酸序列。如實(shí)施例12中描述的，在重組GAA被分泌到具有堿性蛋白酶的培養(yǎng)基中時(shí)，完 成將IlOkDa前體加工成95kDa形式，即沒(méi)有檢出IlOkDa前體。
[0089] 還可以使用本文中描述的遺傳工程化細(xì)胞生成脫帽且脫甘露糖基化的分子復(fù)合 物。此類遺傳工程化細(xì)胞可以包含編碼具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的多肽的核 酸，編碼如本文中描述的甘露糖苷酶的核酸，和任選編碼堿性蛋白酶的核酸，所述堿性蛋白 酶與SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。
[0090] 生成脫帽且脫甘露糖基化的分子復(fù)合物的基于細(xì)胞的方法可以包括導(dǎo)入真菌細(xì) 胞中，所述真菌細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化改造以包含編碼能夠?qū)⒏事短?1-磷酸-6-甘露糖連接 或模塊水解成磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸，編碼具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基 酸序列的多肽的核酸和任選編碼與SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列 同一性的堿性蛋白酶的核酸，其中所述細(xì)胞生成包含脫帽的磷酸化N-聚糖的本文中描述 的分子復(fù)合物。如上文描述的，可以使此類磷酸化N-聚糖脫甘露糖基化。在一些實(shí)施方案 中，編碼甘露糖苷酶和GAA的核酸含有分泌序列，使得甘露糖苷酶和GAA被共分泌。在包含 編碼堿性蛋白酶的核酸的遺傳工程化細(xì)胞中，分子復(fù)合物可以被加工成95kDa形式。
[0091] 另一種基于細(xì)胞的方法可以包括導(dǎo)入真菌細(xì)胞中的步驟，所述真菌細(xì)胞經(jīng)遺傳工 程化改造以包含編碼甘露糖苷酶的核酸，編碼具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的多 肽的核酸，和任選編碼與SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的堿 性蛋白酶的核酸，其中所述細(xì)胞生成脫帽的且脫甘露糖基化的分子復(fù)合物，所述甘露糖苷 酶能夠（i)將甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接或模塊水解成磷酸-6-甘露糖，并（ii)水解 含有磷酸根的聚糖的末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖 連接或模塊。在一些實(shí)施方案中，編碼甘露糖苷酶和GAA的核酸含有分泌序列，使得甘露糖 苷酶和靶分子被共分泌。在包含編碼堿性蛋白酶的核酸的遺傳工程化細(xì)胞中，分子復(fù)合物 可以被加工成95kDa形式。
[0092] 適合于靶分子或分子復(fù)合物的體內(nèi)生成的細(xì)胞可以是真菌起源的，包括解脂 耶氏酵母、Arxulaadeninivorans、甲基營(yíng)養(yǎng)酵母（methylotrophic yeast)(諸如念 珠菌屬（Candida)、漢森酵母屬（Hansenula)、0ogataea、畢赤酵母屬（Pichia)或球擬 酵母屬（Torulopsis)的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母）或曲霉屬、木霉屬（Trichoderma)、脈孢菌屬 (Neurospora)、鐮孢菌屬（Fusarium)、或金孢子菌屬（Chrysosporium)的絲狀真菌。例 示性真菌物種包括但不限于異常畢赤酵母（Pichia anomala)、異常畢赤酵母（Pichia anomala)、牛畢赤酵母（Pichia bovis)、加拿大畢赤酵母（Pichia canadensis)、卡 氏畢赤酵母（Pichia carsonii)、粉狀畢赤酵母（Pichiafarinose)、發(fā)酵畢赤酵母 (Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens)、 膜購(gòu)畢赤酵母（Pichia membranaefaciens)、粗狀假絲酵母（Candida valida)、白念珠 菌（Candida albicans)、Candida ascalaphidarum、Candida amphixiae、南極假絲酵母 (Candida Antarctica)、大西洋假絲酵母（Candida atlantica)'Candida atmosphaerica、 蟲章鄉(xiāng)假絲酵母（Candida blattae)、果生假絲酵母（Candida carpophila)、Candida cerambycidarum、Candida chauliodes、延古月索假絲酵母（Candida corydalis)、Candida dosseyi、杜氏假絲酵母(Candida dubliniensis)、Candida ergatensis、Candida fructus、光滑假絲酵母（Candida glabrata)、發(fā)酵假絲酵母（Candida fermentati)、吉 利蒙假絲酵母（Candida guiIliermondii)、黑馬朗假絲酵母（Candida haemulonii)、 Candida insectamens、Candida insectorum、中型假絲酵母（Candida intermedia)、 Candida jeffresii、乳酒假絲酵母（Candida kefyr)、克魯斯氏念珠菌（Candida krusei)、 葡萄牙假絲酵母（Candida lusitaniae)、Candida lyxosophila、麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa)、膜醭假絲酵母（Candida membranifaciens)、梅林假絲酵母（Candida milleri)、 撤攬假絲酵母（Candida oleophila)、俄勒同假絲酵母（Candida oregonensis)、近平滑 念珠菌（Candida parapsilosis)、桔假絲酵母（Candida quercitrusa)、休哈塔假絲酵 母（Candida shehatea)、Candida temnochilae、纖維假絲酵母（Candida tenuis)、熱 帶假絲酵母(Candida tropicalis)、Candida tsuchiyae、Candida sinolaborantiu、 大顯假絲酵母（Candida sojae)、維斯假絲酵母（Candida viswanathii)、產(chǎn)I元假絲酵 母（Candida utilis)、Oogataea minuta、膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens)、 Pichia silvestris、膜醭畢赤酵母、Pichia chodati、膜醭畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、 Pichia minuscule、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)、Pichia pseudopolymorpha、 Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichia silvestrisi、Pichia strasburgensis、陸生畢赤酵母(Pichia terricola)、Pichia vanriji、Pseudozyma Antarctica、圓紅冬抱酵母菌（Rhodosporidium toruloides)、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、 Saccharomyces momdshuricus、葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum)、貝酵母、釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)、二抱酵母（Saccharomyces bisporus)、謝瓦利埃酵 母（Saccharomyces chevalieri)、德?tīng)柌冀湍福⊿accharomyces delbrueckii)、少抱 酵母（Saccharomyces exiguous)、發(fā)酵性酵母（Saccharomyces fermentati)、脆壁酵 母（Saccharomyces fragilis)、Saccharomyces marxianus、蜂蜜酵母（Saccharomyces mellis)、羅斯酵母（Saccharomyces roseii)、魯酵母（Saccharomyces rouxii)、葡萄 汁酵母（Saccharomyces uvarum)、魏氏酵母（Saccharomyces willianus)、路氏類酵母 (Saccharomycodes Iudwigii)、莢復(fù)膜抱酵母（Saccharomycopsis capsularis)、扣囊復(fù)膜 酵母（Saccharomycopsis fibuligera)、扣囊復(fù)膜酵母、Endomyces hordei、Endomycopsis fobuligera. Saturnispora saitoi、八抱裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus)、 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis)、德?tīng)柌加斜A酵母（Torulaspora delbrueckii)、德?tīng)柌加斜A酵母、 Saccharomyces dairensis、德?tīng)柌加斜A酵母、Torulaspora fermentati、發(fā)酵性酵 母（Saccharomyces fermentati)、德?tīng)柌加斜A酵母、羅斯有抱圓酵母（Torulaspora rosei)、羅斯有孢圓酵母、德?tīng)柌加墟邎A酵母、羅斯酵母、德?tīng)柌加墟邎A酵母、德?tīng)柌冀?母、德?tīng)柌加斜A酵母、德?tīng)柌冀湍浮ygosaccharomyces mongolicus、Dorulaspora globosa、球形德巴利酵母（Debaryomyces globosus)、球擬圓酵母（Torulopsis globosa)、 皮狀絲抱酵母（Trichosporon cutaneum)、三角酵母（Trigonopsis variabilis)、 Williopsis californica、土 星擬威爾酵母（Williopsis saturnus)、二抱接合酵 母(Zygosaccharomyces bisporus)、二抱接合酵母、Debaryomyces disporua、二抱 酵母（Saccharomyces bisporas)、二抱接合酵母、二抱酵母、Zygosaccharomyces mellis、Zygosaccharomyces priorianus、Zygosaccharomyces rouxiim、魯氏接合酵 母（Zygosaccharomyces rouxii)、巴格式結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces barker i)、 魯酵母、魯氏接合酵母、醬醒接合酵母（Zygosaccharomyces majori)、Saccharomyces rousii、異常畢赤酵母（Pichia anomala)、牛畢赤酵母（Pichia bovis)、加拿大畢赤酵 母（Pichia Canadensis)、卡氏畢赤酵母（Pichia carsonii)、粉末畢赤酵母（Pichia farinose)、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens)、Pichia pseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、 Pseudozyma Antarctica、圓紅冬抱酵母菌（Rhodosporidium toruloides)、圓紅冬抱酵 母菌、膠紅類酵母菌（Rhodotorula glutinis)、貝酵母（Saccharomyces bayanus)、貝酵 母、二孢酵母、釀酒酵母、謝瓦利埃酵母、德?tīng)柌冀湍?、發(fā)酵性酵母、脆壁酵母、路氏類酵母 (Saccharomycodes Iudwigii)、粟酒裂殖酵母、西方許旺酵母、德?tīng)柌加墟邎A酵母、球有孢 圓酵母（Torulaspora globosa)、變異三角酵母（Trigonopsis variabilis)、Williopsis californica、土星擬威爾酵母、二孢接合酵母、Zygosaccharomyces mellis、魯氏接合酵 母。例示性的絲狀真菌包括曲霉屬（Aspergillus)的多種物種，包括但不限于淺藍(lán)灰曲霉 (Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉（Aspergillus candidus)、肉色曲霉（Aspergillus carneus)、棒曲霉（Aspergillus clavatus)、彎頭曲霉（Aspergillus deflectus)、黃曲 霉（Aspergillus flavus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、灰綠曲霉（Aspergillus glaucus)、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉、赫曲霉（Aspergillus ochraceus)、 米曲霉（Aspergillus oryzae)、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)、帚狀曲霉 (Aspergillus penicilloides)、局限曲霉（Aspergillus restrictus)、醬油曲霉 (Aspergillus sojae)、聚多曲霉（Aspergillus sydowi)、溜曲霉（Aspergillus tamari)、 土曲霉（Aspergillus terreus)、焦曲霉（Aspergillus ustus)、或花斑曲霉（Aspergillus versicolor)。在如本文中規(guī)定的遺傳工程前，此類細(xì)胞可以獲自多種商業(yè)來(lái)源和研究資源 機(jī)構(gòu)，諸如例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（Rockville, MD)。
[0093] 在編碼甘露糖苷酶、GAA、和/或堿性蛋白酶的外源核酸外，細(xì)胞的遺傳工程可以 包括一處或多處遺傳修飾，諸如：（i)編碼外部鏈延長(zhǎng)（Outer CHain elongation, 0CH1)蛋 白的內(nèi)源基因的缺失；（ii)引入編碼能夠促進(jìn)甘露糖基磷酸化的多肽（例如來(lái)自解脂耶氏 酵母、釀酒酵母、Ogataea minuta、巴斯德畢赤酵母、或白念珠菌的MNM多肽，或來(lái)自巴斯 德畢赤酵母的PNOl多肽）的重組核酸以提高甘露糖殘基的磷酸化；（iii)干擾OCHl蛋白 的功能性表達(dá)的RNA分子的引入或表達(dá)；（iv)引入編碼具有N-糖基化活性的野生型（例 如內(nèi)源或外源）蛋白質(zhì)的重組核酸（即表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)）；或（V)改變 編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件，如此改 變其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)。RNA分子包括例如小干擾RNA(SiRNA)，短發(fā)夾RNA(shRNA)，反義 RNA，或微小RNA (miRNA)。遺傳工程化還包括改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源 基因以生成具有添加（例如異源序列）、缺失、或取代（例如突變，諸如點(diǎn)突變，保守或非保 守突變）的蛋白質(zhì)。突變可以特異性引入（例如通過(guò)定點(diǎn)誘變或同源重組）或可以隨機(jī) 引入（例如，細(xì)胞可以化學(xué)誘變，如記載于例如Newman and Ferro_Novick(1987)J. Cell Biol. 105(4) :1587 的）。
[0094] 本文中描述的遺傳修飾可以導(dǎo)致下列一項(xiàng)或多項(xiàng)：（i)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中的一 種或多種活性的升高，（ii)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中的一種或多種活性的降低，或（iii)經(jīng)遺 傳修飾的細(xì)胞中的一種或多種活性的定位或胞內(nèi)分布的變化。應(yīng)當(dāng)理解，特定活性（例如 促進(jìn)甘露糖基磷酸化）的量增加可以由于過(guò)表達(dá)一種或多種能夠促進(jìn)甘露糖基磷酸化的 蛋白質(zhì)、內(nèi)源基因的拷貝數(shù)目增加（例如，基因復(fù)制）、或刺激由基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)升 高的內(nèi)源基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的變化所致。一種或多種特定活性的降低可以是由于突變 體形式（例如，顯性負(fù)性形式）的過(guò)表達(dá)、導(dǎo)入或表達(dá)降低具有特定活性的一種或多種蛋白 質(zhì)的表達(dá)的一種或多種干擾RNA分子，或刪除編碼具有特定活性的蛋白質(zhì)的一種或多種內(nèi) 源基因所致。
[0095] 為了通過(guò)同源重組破壞基因，"基因替換"載體可以以如下的方式構(gòu)建以包含選擇 標(biāo)志物基因。選擇標(biāo)志物基因可以在5'和3'端兩者與足以介導(dǎo)同源重組的長(zhǎng)度的基因的 部分可操作連接。選擇標(biāo)志物可以是互補(bǔ)宿主細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷型或提供抗生素抗性的眾多基 因之一，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合適的選擇標(biāo)志物包括CAT基因，其對(duì)酵母細(xì) 胞賦予氯霉素抗性，或IacZ基因，其由于表達(dá)β-半乳糖苷酶而導(dǎo)致藍(lán)色菌落。然后，使用 本領(lǐng)域中公知的方法（見(jiàn)下文）將基因替換載體的線性化DNA片段導(dǎo)入細(xì)胞中。線性片段 對(duì)基因組的整合和基因的破壞可以基于選擇標(biāo)志物測(cè)定，并且可以例如通過(guò)Southern印 跡分析確認(rèn)?？梢酝ㄟ^(guò)例如Cre-IoxP系統(tǒng)（參見(jiàn)下文）從宿主細(xì)胞的基因組中除去選擇 標(biāo)志物。
[0096] 或者，基因替換載體可以以如下的方式構(gòu)建，使得包含要破壞的基因部分，該部分 缺乏任何內(nèi)源基因啟動(dòng)子序列并編碼無(wú)一基因編碼序列或基因編碼序列的無(wú)活性片段。 "無(wú)活性片段"指編碼具有從基因的全長(zhǎng)編碼序列生成的蛋白質(zhì)的活性的例如小于約10% (例如小于約9 %，小于約8 %，小于約7 %，小于約6 %，小于約5 %，小于約4%，小于約3 %， 小于約2%，小于約1%，或0%)的蛋白質(zhì)的基因片段。將此類基因的部分以如下的方式在 載體中插入，使得無(wú)已知啟動(dòng)子序列與基因序列可操作連接，但是終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止 序列與基因序列的部分可操作連接。隨后，可以將此載體在基因序列的該部分中線性化，并 轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中。通過(guò)單同源重組，此線性化載體然后被整合在基因的內(nèi)源對(duì)應(yīng)物中。
[0097] 表達(dá)載體可以是自主的或整合的。可以將重組核酸（例如編碼甘露糖苷酶，GAA， 或堿性蛋白酶的重組核酸）以表達(dá)載體形式諸如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘?；虿《绢w粒導(dǎo) 入細(xì)胞中?？梢詫⒅亟M核酸在染色體外維持或者可以將其整合入酵母細(xì)胞染色體DNA中。 表達(dá)載體可以含有編碼在選定的條件下對(duì)于細(xì)胞存活力需要的蛋白質(zhì)的選擇標(biāo)志物基因 (例如，URA3,其編碼尿嘧啶生物合成必需的酶，或TRP1，其編碼色氨酸生物合成需要的酶） 以容許檢測(cè)和/或選擇用期望的核酸轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞（見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 4, 704, 362)。 表達(dá)載體還可以包含自主復(fù)制序列（ARS)。例如，美國(guó)專利No. 4, 837，148描述了提供適合 于維持巴斯德畢赤酵母中的質(zhì)粒的手段的自主復(fù)制序列。
[0098] 整合性載體披露于例如美國(guó)專利No. 4, 882, 279。整合性載體一般包含至少第一 可插入DNA片段、選擇標(biāo)志基因、和第二可插入DNA片段的連續(xù)排列序列。第一和第二可插 入DNA片段各為約200 (例如，約250、約300、約350、約400、約450、約500、或約1000或更 多）個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并且具有與要轉(zhuǎn)化的物種的基因組DNA的一部分同源的核苷酸序列。 含有表達(dá)的感興趣基因（例如，編碼GAA的基因）的核苷酸序列在此載體中在第一和第二 可插入DNA片段間插入，無(wú)論在標(biāo)志物基因之前還是之后?？梢栽诮湍皋D(zhuǎn)化前將整合性載 體線性化以便于感興趣的核苷酸序列對(duì)宿主細(xì)胞基因組的整合。
[0099] 表達(dá)載體的特征可以是在酵母（例如，解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、巴 斯德畢赤酵母、或其它合適的真菌物種）啟動(dòng)子（其使它們能夠在真菌細(xì)胞中表達(dá)）的控 制下的重組核酸。合適的酵母啟動(dòng)子包括例如ADC1、TPI1、ADH2、hp4d、Ρ0Χ、和GallO (參 見(jiàn)例如 Guarente 等（1982)Proc. Natl. Acad Sci. USA 79(23):7410)啟動(dòng)子。其它合適的 啟動(dòng)子記載于例如 Zhu and Zhang(1999)Bioinformatics 15(7-8) :608-611 及美國(guó)專利 No. 6, 265, 185。
[0100]啟動(dòng)子可以是組成性或誘導(dǎo)型（條件性的）。組成性啟動(dòng)子理解為其表達(dá)在標(biāo)準(zhǔn) 的培養(yǎng)條件下恒定的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是響應(yīng)一種或多種誘導(dǎo)信號(hào)的啟動(dòng)子。例如，可 以將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子化學(xué)調(diào)節(jié)（例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到化學(xué)誘導(dǎo)劑諸如醇、四環(huán)素、類固醇、 金屬、或其它小分子的存在或缺乏調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子）或物理調(diào)節(jié)（例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到物理 誘導(dǎo)物諸如光或高或低溫的存在或缺乏調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子）。也可以通過(guò)自身受到化學(xué)或物理 信號(hào)直接調(diào)節(jié)的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子間接調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0101] 應(yīng)當(dāng)理解，其它遺傳工程修飾也可以是條件性的。例如，可以使用例如，位點(diǎn)特異 性DNA重組酶諸如 Cre-IoxP 系統(tǒng)（見(jiàn)例如 Gossen 等（2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173 及美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)文本No. 20060014264)來(lái)?xiàng)l件性刪除基因。
[0102] 可以使用多種方法諸如原生質(zhì)球技術(shù)或全細(xì)胞氯化鋰酵母轉(zhuǎn)化方法來(lái)將重組核 酸導(dǎo)入本文中所描述的細(xì)胞中。其它可用于將質(zhì)粒或線性核酸載體轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中的方法 記載于例如，美國(guó)專利 No. 4, 929, 555 ;Hinnen 等（1978) Proc. Nat. Acad Sci. USA 75:1929 ; Ito 等（1983) J. Bacteriol. 153:163 ;美國(guó)專利 No. 4, 879, 231 ;及 Sreekrishna 等（1987) Gene 59:115,每篇的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提及完整并入本文。也可以使用電穿孔和PEG1000 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化規(guī)程，如由 Cregg and Russel，Methods in Molecular Biology:Pichia Protocols，Chapter 3，Humana Press，Totowa，N.J.，pp. 27-39(1998)所描述的。
[0103] 可以通過(guò)使用合適的技術(shù)，包括但不限于在轉(zhuǎn)化后在缺乏需要的生物化學(xué)產(chǎn)物 (由于細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷型所致）的情況中培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，選擇并檢測(cè)新表型，或在存 在抗生素的情況中培養(yǎng)來(lái)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，所述抗生素在缺乏轉(zhuǎn)化體中含有的抗性 基因的情況中對(duì)于酵母是毒性。也可以通過(guò)將表達(dá)盒整合入基因組中來(lái)選擇和/或確認(rèn)轉(zhuǎn) 化體，其可以通過(guò)例如Southern印跡或PCR分析來(lái)評(píng)估。
[0104] 在將載體導(dǎo)入感興趣的靶細(xì)胞中前，可以將載體在細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌 (Escherichia coli，E.coli)中增加（例如，擴(kuò)增），如上文描述的?？梢酝ㄟ^(guò)導(dǎo)致載體DNA 自細(xì)菌環(huán)境（milieu)純化的本領(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)自細(xì)菌細(xì)胞分離載體DNA。可以用 酚、氯仿、和乙醚來(lái)廣泛提取純化的載體DNA，以確保質(zhì)粒DNA制備物中不存在大腸桿菌蛋 白質(zhì)，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是毒性的。
[0105] 在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化真菌細(xì)胞缺乏OCHl基因或其基因產(chǎn)物（例如mRNA 或蛋白質(zhì)），并且是OCHl活性缺陷的。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化細(xì)胞表達(dá)能夠促進(jìn)甘 露糖基磷酸化的多肽（例如來(lái)自解脂耶氏酵母、釀酒酵母、Ogataea minuta、巴斯德畢赤酵 母、或白念珠菌的MNM多肽，或來(lái)自巴斯德畢赤酵母的PNOl多肽）。例如，真菌細(xì)胞可以 表達(dá)來(lái)自解脂耶氏酵母的MNM多肽（ Genbank?登錄號(hào)：XM_503217, Genolevures Ref : YALI0D24101g)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化細(xì)胞是OCHl活性缺陷的，并且表達(dá)能夠促 進(jìn)甘露糖基磷酸化的多肽。
[0106] 在脫帽和脫甘露糖基化后，可以分離分子復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，將分子復(fù) 合物在酵母細(xì)胞內(nèi)維持，并且在細(xì)胞裂解后釋放。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由由指導(dǎo)分子從 細(xì)胞中分泌的編碼序列（對(duì)于外源核酸而言天然的或工程化改造到表達(dá)載體中）提供的 機(jī)制將分子復(fù)合物分泌到培養(yǎng)基中。可以通過(guò)多種用于檢測(cè)分子存在的標(biāo)準(zhǔn)方案，例如用 對(duì)GAA特異性的抗體進(jìn)行的免疫印跡或放射性免疫沉淀，或測(cè)試酶比活（specific enzyme activity)(例如糖原降解）確認(rèn)細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)基中脫帽且脫甘露糖基化的分子復(fù)合 物的存在。
[0107] 在一些實(shí)施方案中，在分離后，可以將脫帽且脫甘露糖基化的靶分子或分子復(fù)合 物與異源模塊附接，例如使用酶促或化學(xué)手段。"異源模塊"指與改變的靶分子連接（例如 共價(jià)或非共價(jià)）的任何組成，該組成不同于最初存在于改變的靶分子上的組成。異源模塊 包括例如聚合物，載體，佐劑，免疫毒素，或可檢測(cè)（例如熒光，發(fā)光，或放射性）模塊。在一 些實(shí)施方案中，可以將額外的N-聚糖添加到改變的靶分子。
[0108] 用于檢測(cè)分子的糖基化的方法包括DNA測(cè)序儀輔助（DSA)、熒光團(tuán)輔助碳水化合 物電泳（FACE)或表面增強(qiáng)的激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜術(shù)（SELDI-TOF MS)。例如，分 析可以利用DSA-FACE，其中例如，將糖蛋白變性，接著在例如膜上固定化。然后，可以用合適 的還原劑諸如二硫蘇糖醇（DTT)或β-巰基乙醇來(lái)還原糖蛋白。可以使用酸諸如碘乙酸來(lái) 將蛋白質(zhì)的硫氫基基團(tuán)羧化。接著，可以使用酶諸如N-糖苷酶F自蛋白質(zhì)釋放N-聚糖。任 選地,可以將N-聚糖重建，并通過(guò)還原性胺化來(lái)衍生化。例如，可以通過(guò)還原胺化在還原端 用突光團(tuán)，如 APTS (8-氨基花-1，3, 6-三橫酸（8-aminopyrene-l, 3, 6-trisulfonic acid)) 標(biāo)記釋放的N-聚糖。標(biāo)記的化學(xué)計(jì)量學(xué)使得僅將一個(gè)APTS分子附接于每個(gè)寡糖分子。然 后，可以將衍生化的N-聚糖濃縮。適合于N-聚糖分析的設(shè)備包括例如ABI PRISM? 377 DNA 測(cè)序儀（Applied Biosystems)?？梢允褂美?GENESCAN? 3.1 軟件（Applied Biosystems)來(lái)實(shí)施數(shù)據(jù)分析。可以用一種或多種酶諸如小牛腸磷酸酶進(jìn)一步處理分離的 甘露糖蛋白（mannoprotein)以確認(rèn)其N-聚糖狀態(tài)。N-聚糖分析的其它方法包括例如質(zhì)譜 術(shù)（例如MALDI-TOF-MS)、正常相的高壓液相層析（HPLC)、反相和離子交換層析（例如，在 未標(biāo)記聚糖時(shí)通過(guò)脈沖安培計(jì)檢測(cè)，且若將聚糖適當(dāng)標(biāo)記，則通過(guò)UV吸光度或熒光）。還 可見(jiàn) Callewaert 等（2〇01)Glycobiology 11(4) :275_281 及 Freire 等（2〇〇6)Bioconjug. Chem. 17(2) : 559-564。
[0109] 工程化細(xì)胞的培養(yǎng)
[0110] 本文件還提供了本文中所描述的任何遺傳工程化細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物。如本 文中所使用的，遺傳工程化細(xì)胞的"基本上純的培養(yǎng)物"是所述細(xì)胞的如下培養(yǎng)物，其中培 養(yǎng)物中活細(xì)胞總數(shù)的小于約40% ( S卩，小于約：35% ;30% ;25% ;20% ;15% ;10% ;5% ; 2% ;1% ;0. 5% ;0. 25% ;0. 1% ;0. 01% ;0. 001% ;0. 0001% ;或甚至更少）是與遺傳工程 化細(xì)胞不同的活細(xì)胞，例如，細(xì)菌、真菌（包括酵母）、支原體、或原生動(dòng)物細(xì)胞。在本上下文 中的術(shù)語(yǔ)"約"意味著相關(guān)百分比可以是在規(guī)定的百分比之上或之下的規(guī)定百分比的15% 百分比。如此，例如，約20%可以是17%至23%。遺傳工程化細(xì)胞的此類培養(yǎng)物包括細(xì)胞 和生長(zhǎng)、貯存、或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是液體、半固體（例如，凝膠狀培養(yǎng)基）、或冷凍 的。培養(yǎng)基包括在液體中或在半固體培養(yǎng)基中/上生長(zhǎng)或在貯存或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，包括冷凍 貯存或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中貯存或轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞。培養(yǎng)物在培養(yǎng)容器或貯存容器或基片（例如，培 養(yǎng)皿、燒瓶、或管或貯存小瓶或管）中。
[0111] 可以將本文中所描述的遺傳工程化細(xì)胞例如，以冷凍的細(xì)胞懸浮液在例如含有凍 干保護(hù)劑諸如甘油或蔗糖的緩沖液中以凍干細(xì)胞貯存?；蛘撸梢詫⑺鼈兝缫岳缤ㄟ^(guò) 流化床干燥或噴霧干燥，或任何其它合適的干燥方法獲得的干燥細(xì)胞制備物貯存。
[0112] 藥物組合物和治療方法
[0113] 可以將本文中描述的GAA分子和分子復(fù)合物，例如含有至少一處增強(qiáng)對(duì)哺乳動(dòng)物 細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)的修飾的分子復(fù)合物摻入藥物組合物中，所述藥物組合物含有治療有效量的 分子和一種或多種佐劑、賦形劑、載體、和/或稀釋劑?？山邮艿南♂寗?、載體和賦形劑通常 沒(méi)有不利地影響接受體的穩(wěn)態(tài)（例如，電解質(zhì)平衡）。可接受載體包括生物相容性、惰性或 生物可吸收鹽、緩沖劑、寡或多糖、聚合物、粘性改善劑、防腐劑等。一種例示性的載體是生 理鹽水（0. 15M NaCl，pH 7. 0至7. 4)。另一種例示性的載體是50mM磷酸鈉、IOOmM氯化鈉。 關(guān)于配制和施用藥物組合物的技術(shù)的更多詳情可參見(jiàn)例如Remington' s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co.，Easton, Pa.)。補(bǔ)充性活性化合物也可以慘入組合物中。
[0114] 含有具有本文中描述的一處或多處修飾的分子復(fù)合物的藥物組合物的施用可以 是系統(tǒng)的或局部的?？梢匀缦屡渲扑幬锝M合物，使得它們適合于胃腸外和/或非胃腸外施 用。具體的施用模式包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、口服、直腸、含服、表面、 鼻、眼、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、支氣管、淋巴系統(tǒng)、陰道、和子宮內(nèi)施用。
[0115] 施用可以是通過(guò)周期性注射藥物組合物的推注或者可以通過(guò)自外部（例如，IV 袋）或內(nèi)部（例如，生物可蝕性植入物、生物人工器官、或植入的經(jīng)改變的N-糖基化分子生 成細(xì)胞的集落）的儲(chǔ)庫(kù)的靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用而是不中斷的或連續(xù)的。見(jiàn)例如美國(guó)專利 4, 407, 957, 5, 798, 113和5, 800, 828?？梢允褂煤线m的投遞手段來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物組合物的施用， 諸如：泵（見(jiàn)例如 Annals of Pharmacotherapy, 27:912(1993) ;Cancer, 41:1270(1993); Cancer Research,44:1698(1984);微囊化（microencapsulation)(見(jiàn)例如美國(guó) 專利4, 352, 883 ;4, 353, 888 ;和5, 084, 350);連續(xù)釋放聚合物植入物（見(jiàn)例如 Sabel,美國(guó)專利No. 4, 883, 666);宏囊化（macroencapsulation)(見(jiàn)例如美國(guó)專利 5, 284, 761，5, 158, 881，4, 976, 859 和 4, 968, 733 及公布的 PCT 專利申請(qǐng) W092/19195, WO 95/05452);注射（皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或?qū)ζ渌线m的部位）；或口服施用（在 膠囊、液體、片劑、丸劑、或延長(zhǎng)釋放的配制劑中）。
[0116] 胃腸外投遞系統(tǒng)的例子包括乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入輸 注系統(tǒng)、泵投遞、包囊細(xì)胞投遞、脂質(zhì)體投遞、針投遞注射、無(wú)針注射、噴霧器、氣霧器、電穿 孔、和經(jīng)皮貼片。
[0117] 適合于胃腸外施用的配制劑通常含有經(jīng)改變的N-糖基化分子的無(wú)菌水性制備 物，其優(yōu)選地是與接受體的血液等張的（例如，生理鹽水溶液）。配制劑可以以單位劑量或 多劑形式呈現(xiàn)。
[0118] 適合于口服施用的配制劑可以以離散單元呈現(xiàn)，諸如膠囊、扁囊劑、片劑、或錠劑， 它們各自含有預(yù)定量的經(jīng)改變的N-糖基化分子；或水性液體或非水性液體中的懸浮液，諸 如糖楽劑、酏劑、乳劑、或頓服水劑（draught)。
[0119] 可以對(duì)哺乳動(dòng)物（例如，人患者）以例如膏劑、噴霧劑、泡沫、凝膠、油膏、軟膏、或 干擦（dry rub)施用適合于表面施用的含有至少一處增強(qiáng)復(fù)合物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn) 運(yùn)的修飾的分子復(fù)合物。干擦在施用部位可以是再水合的。此類分子也可以直接輸注入 (例如，浸入并干燥）繃帶、紗布、或貼片，其然后可以直接表面應(yīng)用。此類分子也可以以 半液體、膠化、或完全液體狀態(tài)在供表面施用的繃帶、紗布或貼片中維持（見(jiàn)例如美國(guó)專利 No. 4, 307, 717)。
[0120] 可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定的劑量方案對(duì)有此需要的受試者施用治療有效量 的藥物組合物。例如，可以對(duì)受試者以每劑〇. 01 μ g/kg至10, 000μ g/kg受試者體重的劑量 系統(tǒng)性施用組合物。在另一個(gè)例子中，劑量是每劑1 μ g/kg至100 μ g/kg受試者體重。在 另一個(gè)例子中，劑量是每劑1 μ g/kg至30 μ g/kg受試者體重，例如，每劑3 μ g/kg至10 μ g/ kg受試者體重。
[0121] 為了優(yōu)化治療效力，首先可以以不同給藥方案施用本文中描述的分子復(fù)合物。單 位劑量和方案取決于如下因素，其包括例如，哺乳動(dòng)物物種、其免疫狀態(tài)、哺乳動(dòng)物的體重。 通常，可以使用合適的篩選測(cè)定法作為臨床測(cè)試規(guī)程的一部分來(lái)監(jiān)測(cè)此類分子復(fù)合物在組 織中的水平，例如以測(cè)定給定治療方案的功效。
[0122] 本文中描述的分子復(fù)合物的給藥頻率在醫(yī)學(xué)從業(yè)人員（例如醫(yī)生或護(hù)士）的技術(shù) 和臨床判斷內(nèi)。通常，通過(guò)可以建立最佳施用參數(shù)的臨床試驗(yàn)來(lái)建立施用方案。然而，從業(yè) 人員可以依照受試者的年齡、健康、重量、性別和醫(yī)學(xué)狀態(tài)來(lái)改變此類施用方案?？梢愿鶕?jù) 治療是預(yù)防性還是治療性來(lái)改變給藥頻率。
[0123] 可以通過(guò)例如細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的已知藥學(xué)規(guī)程來(lái)確定此類分子復(fù)合物 或其藥物組合物的毒性和治療效力。例如，可以使用這些規(guī)程來(lái)測(cè)定LD50 (對(duì)50%的群體 致死的劑量）和ED50(在50%的群體中治療有效的劑量）。毒性與治療效果之間的劑量比 率是治療系數(shù)，并且其可以表示為比率LD50/ED50。優(yōu)選展現(xiàn)出高的治療系數(shù)的藥物組合 物。雖然可以使用展現(xiàn)出毒性副作用的藥物組合物，但是要注意設(shè)計(jì)如下的投遞系統(tǒng)，其將 此類化合物靶向受累組織位置以使對(duì)正常細(xì)胞（例如，非靶定細(xì)胞）的潛在損害最小化，由 此降低副作用。
[0124] 可以在配制合適受試者（例如，人患者）用劑量范圍中使用自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法和 動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)。此類藥物組合物的劑量一般位于包括具有少許毒性或沒(méi)有毒性的 ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以在此范圍內(nèi)變化，這取決于所采用的劑量形式和所利用 的施用路徑。對(duì)于如本文中所描述的那樣使用的藥物組合物（例如，用于治療受試者中的 代謝紊亂），最初可以自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法評(píng)估治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量以 達(dá)到包括IC50 ( S卩，實(shí)現(xiàn)對(duì)癥狀的半最大抑制的藥物組合物的濃度）的循環(huán)血漿濃度范圍， 如在細(xì)胞培養(yǎng)中所測(cè)定的?？梢允褂么祟愋畔?lái)更精確地確定人中有用的劑量?？梢岳?通過(guò)高效液相層析來(lái)測(cè)量血漿中的水平。
[0125] 如本文中所定義的，分子復(fù)合物的"治療有效量"是能夠在經(jīng)治療的受試者中產(chǎn)生 醫(yī)學(xué)上期望的結(jié)果（例如，改善蓬佩氏病的一種或多種癥狀）的復(fù)合物的量。治療有效量 (即，有效劑量）可以包括每千克受試者或樣品重量毫克或微克量的化合物（例如，每千克 約1微克至每千克約500毫克、每千克約100微克至每千克約5毫克、或每千克約1微克至 每千克約50微克）。
[0126] 受試者可以是任何哺乳動(dòng)物，例如，人（例如，人患者）或非人靈長(zhǎng)類（例如，黑猩 猩、狒狒、或猴）、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、倉(cāng)鼠、馬、一類牲畜（例如，母牛、豬、綿羊、或山 羊）、犬、貓、或鯨。
[0127] 本文中描述的分子復(fù)合物或其藥物組合物可以作為與用于蓬佩氏病的另一種治 療的聯(lián)合療法對(duì)受試者施用。例如，聯(lián)合療法可以包括對(duì)受試者（例如人患者）施用一種 或多種別的藥劑，其對(duì)已經(jīng)形成或有風(fēng)險(xiǎn)形成（由于編碼GAA的基因中的突變）蓬佩氏病 的受試者提供治療益處。如此，化合物或藥物組合物和一種或多種別的藥劑可以同時(shí)施用。 或者，可以首先施用分子復(fù)合物，接著施用一種或多種別的藥劑，或反之亦然。
[0128] 本文中描述的任何分子復(fù)合物可以是凍干的。
[0129] 本文中所描述的任何藥物組合物可以與施用用法說(shuō)明書一起包含在容器、包裝、 或分配器中。
[0130] 本文中描述的任何藥物組合物可以與施用說(shuō)明書一起包含在容器，包裝，或分配 器中。在一些實(shí)施方案中，組合物可以以一次性管形瓶包裝。
[0131] 以下是本發(fā)明實(shí)施的實(shí)施例。它們不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0132] 實(shí)施例1
[0133] 用CcMan5和刀豆α -甘露糖苷酶對(duì)重纟目huGAA的脫帽和脫甘露糖某化
[0134] 如W02011/039634中描述的，使用解脂耶氏酵母生產(chǎn)菌株0XYY1589生成重組人 GAA (rhGAA)，所述解脂耶氏酵母生產(chǎn)菌株0XYY1589含有三個(gè)拷貝的人alpha葡糖苷酶基 因（又稱為酸性alpha葡糖苷酶或酸性麥芽糖酶EC3. 2. 1.3)和兩個(gè)拷貝的解脂耶氏酵母 MNM基因。人GAA的氨基酸序列在圖1中列出。菌株0XY1589的基因型如下：
[0135] MatA，leu2_958, ura3_302, xpr2_322，
[0136] gut2_744,ade2_844
[0137] P0X2-Lip2pre-huGAA:URA3Ex::zeta
[0138] P0X2-Lip2pre-huGAA:LEU2Ex::zeta
[0139] P0X2-Lip2pre-hGM_CSF:⑶TEx::zeta
[0140] YlMNN4-P0X2-hp4d-YLMNN4:ADE2::PT targeted
[0141] 用纖維化纖維微細(xì)菌甘露糖苷酶（CcMan5)和刀豆α甘露糖苷酶（JbMan) (Sigma Product M7257, 3. OM磷酸銨懸浮液）使RhGAA脫帽并脫甘露糖基化。如下重組生成CcMan5， 首先將編碼CcMan5多肽的核酸（圖2A)克隆到載體pLSAH36中，該載體pLSAH36含有DsbA 信號(hào)序列，并且導(dǎo)致具有N端HIS標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的表達(dá)。圖2B和2C分別含有具有和沒(méi)有 信號(hào)序列的CcMan5多肽的氨基酸序列。將質(zhì)粒pLSAH36克隆到大腸桿菌B21細(xì)胞中，并使 用Talon柱將駐留于周質(zhì)中的蛋白質(zhì)分離并純化。在使用JbMan的硫酸銨懸浮液前，將其 通過(guò)凝膠過(guò)濾過(guò)Superdex 200柱以除去污染性磷酸酶活性來(lái)進(jìn)一步純化。
[0142] 通過(guò)以對(duì)于huGAA: CcMan5: JbMan為100:5:10的w: w比率與CcMan5 (憐酸鹽緩沖 鹽水（PBS)中約 0· 15-0. 30mg/mL)和 JbMan (PBS 中約 0· 5-lmg/mL) -起溫育使 RhGAA (20mM 乙酸鈉（NaOAc)緩沖液，pH 5. 0中約5mg/mL的濃度）脫帽并脫甘露糖基化。用500mM NaOAc 緩沖液，pH 5. 0和IOOmM CaCl2稀釋總反應(yīng)體積以獲得IOOmM NaOAc和2mM CaCl2的終濃 度。將反應(yīng)混合物于30°C溫育16小時(shí)。
[0143] 為了評(píng)估脫帽過(guò)程及分析純化的huGAA的N-聚糖概況，將5 μ g糖蛋白的N-聚糖 用N-糖苷酶F (PNGaseF)釋放，用APTS (8-氨基-1，3, 6-芘三磺酸；三鈉鹽）標(biāo)記，隨后在 DSA-FACE (DNA測(cè)序儀輔助熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳）上分析。該方法基本上遵循Laroy 等，Nature Protocols, 1:397-405(2006)中描述的方案。
[0144] 圖3A中呈現(xiàn)了用CcMan5和JbMan處理之前（小圖B)和之后（小圖C)的來(lái)自 huGAA(76kD形式）的N-聚糖的DSA-FACE電泳圖。小圖A是含有用PNGaseF從RNaseB釋 放的N-聚糖的參照樣品。從加帽的huGAA釋放的N-聚糖混合物主要由ManP-Man 8GlcNAc2 和（ManP)2-Man8GlcNAc2組成（圖3A，小圖B)。比ManP-Man 8GlcNAc2略快運(yùn)行的峰可以 歸為ManP-Man7Gl cNAc2。脫帽和脫甘露糖基化后觀察到的主峰可以歸為雙重磷酸化的 P2-Man6GlcNAc2 和單磷酸化的 P-Man4GlcNAc2、P-Man5GlcNAc2 和 P-Man6GlcNAc2 (小圖 C)。
[0145] huGAA的不同經(jīng)加工形式的脫帽對(duì)于76kD形式（小圖B)，95kD形式（小圖C)和 IlOkD形式（小圖D)產(chǎn)生相同的N-聚糖概況（圖3B)。
[0146] 實(shí)施例2
[0147] IlOkDa rhGAA 的鈍化
[0148] 如下從菌株0XYY1589分離rhGAA的IlOkDa形式。在收獲后，將培養(yǎng)液離心，并使 用Durapore膜（Merck Millipore)過(guò)濾。將硫酸銨（AMS)添加至IM的濃度，并過(guò)濾溶質(zhì)， 之后在疏水性相互作用層析（HIC)柱上加載，該柱在20mM磷酸鈉 pH 6, IM硫酸銨中平衡。 用20mM磷酸鈉 pH 6洗脫產(chǎn)物。
[0149] 在第二層析柱上加載前，首先將產(chǎn)物經(jīng)由再生纖維素膜上的切向流過(guò)濾（TFF)濃 縮，然后從緩沖液更換為20mM乙酸鈉 pH 4. 5。在用20mM乙酸鈉 pH4. 5平衡的陽(yáng)離子交換 層析（CEX)柱上加載此材料。在柱加載后，將其用平衡緩沖液清洗，直到UV吸光度信號(hào)達(dá) 到基線，然后用20mM乙酸鈉 pH 4. 5, 50mM NaCl清洗。將產(chǎn)物在20mM乙酸鈉 pH 4. 5, 150mM NaCl中洗脫，并濃縮，并從緩沖液更換成20mM乙酸鈉 pH 5。（參見(jiàn)下文）
[0150] 如實(shí)施例中描述的那樣使樣品脫帽并脫甘露糖基化，然后將D-甘露醇添加至 IOOmM的濃度。將所述材料的四分之三使用具有IOkDa分子量截留（MWCO)的再生纖維素膜 經(jīng)由TFF在柱中減少，并在Superdex 200柱上經(jīng)由大小排阻層析（SEC)進(jìn)一步純化，所述 Superdex 200柱于4°C用25mM磷酸鈉 pH6，150mM NaCl，100mM D-甘露醇平衡。然后，在變 性條件下在Cibacron藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)級(jí)分篩選純度。將合并的級(jí)分經(jīng)由TFF 濃縮，并使用IOkD MWCO(再生纖維素膜，Merck Millipore)的Amicon離心濾器超速離心。
[0151] 實(shí)施例3
[0152] IlOkDa rhGAA 的鈍化
[0153] 如下從菌株0XYY1589分離rhGAA的IlOkDa形式。在收獲后，將材料離心并過(guò)濾， 之后將AMS的濃度提高到1M。將溶質(zhì)再次過(guò)濾，并將產(chǎn)物在用20mM磷酸鈉 pH 6, IM AMS平 衡的HIC柱上捕捉，并在20mM磷酸鈉 pH 6緩沖液中在1至OM AMS的逐步梯度中釋放。
[0154] 將洗脫液濃縮，并在 Vivaflow 200 型（PES 膜，IOkD MWCO, Sartorius)上經(jīng)由 TFF 將緩沖液更換為IOmM BIS-TRIS，pH 6。將經(jīng)脫鹽的材料引入陰離子交換層析（AEC)柱 上。在柱清洗到UV信號(hào)幾乎達(dá)到基線后，應(yīng)用兩相連續(xù)鹽梯度；第一梯度從0變?yōu)?. 3M NaCl，第二梯度從0.3變?yōu)镮M NaCl。將級(jí)分在梯度期間收集，并經(jīng)由定性4-甲基傘形酮 基-a-D-葡糖吡喃糖苷（4-MUG)篩選GAA。在4-MUG測(cè)定法中，通過(guò)將反應(yīng)緩沖液添加至 10 μ 1洗脫級(jí)分開(kāi)始反應(yīng)，所述反應(yīng)緩沖液由10:1體積比例的0. 35mM 4-MUG，0. 1% BSA和 IOOmM乙酸鈉 pH 4組成。于37°C溫育30分鐘至1小時(shí)后，添加等體積的IOOmM甘氨酸pH 11 以停止反應(yīng)。在UV光下觀察突光生成反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferone) 的釋放。
[0155] 將含有GAA的級(jí)分合并，并通過(guò)Vivaflow 200模塊（PES膜，IOkD MWCO, Sartorius)上的TFF和使用IOkD MWCO的Amicon離心濾器（再生纖維素膜，Merck Millipore)進(jìn)行的超速離心濃縮。
[0156] 將濃縮的材料分成兩份，并在Superdex 200柱上進(jìn)一步純化，所述Superdex 200 柱于41：用501111磷酸鈉？!1 6,2501111恥(：1，0.05%了￥6611-20平衡。隨后，在變性條件下 在Cibacron-藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)級(jí)分篩選純度，并使用對(duì)硝基苯磷酸鹽（其在 405nm波長(zhǎng)測(cè)量黃色的對(duì)硝基苯酚鹽反應(yīng)產(chǎn)物的酶促釋放）使用比色測(cè)試測(cè)定磷酸酶含 量。
[0157] 從含有GAA的級(jí)分制備實(shí)驗(yàn)用（pilot)合并物。經(jīng)由Bradford測(cè)定法測(cè)定實(shí)驗(yàn) 用合并物的總蛋白質(zhì)。將選擇的級(jí)分合并以濃縮到Vivaflow 200TFF模塊（PES膜，IOkD MWCO, Sartorius)上。使用IOkD MWCO的15ml Amicon離心濾器（再生纖維素膜，Merck Millipore)進(jìn)一步減少體積。
[0158] 將濃縮的材料進(jìn)行第二輪大小排阻層析（SEC)，使用與第一 SEC步驟相同的條件 進(jìn)行。在變性條件下在Cibacron-藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)級(jí)分再洗篩選純度。將級(jí) 分依照選擇的實(shí)驗(yàn)用合并物合并，并在15ml Amicon離心濾器（IOkD MWC0,再生纖維素膜， Merck Millipore)上濃縮。
[0159] 實(shí)施例4
[0160] 95kDa rhGAA 的純化
[0161] 如下從菌株0XYY1589分離rhGAA的95kDa形式。在收獲后，將培養(yǎng)液離心，并使 用Durapore膜（Merck Millipore)過(guò)濾。然后，在具有IOkD分子量截留（MWCO)的改良聚 醚砜（PES)膜上經(jīng)由TFF濃縮產(chǎn)物。將AMS添加至IM的濃度，并過(guò)濾溶質(zhì)，之后在HIC柱 上加載，該HIC柱在20mM磷酸鈉 pH 6, IM AMS中平衡。將產(chǎn)物用水洗脫，將洗脫液的pH通 過(guò)將IOOmM BIS-TRISpH 6的儲(chǔ)液緩沖液添加至IOmM的濃度調(diào)節(jié)，并將其于4°C貯存13天。
[0162] 在AEX柱上加載前，將產(chǎn)物在具有IOkD MWCO的再生纖維素膜上經(jīng)由TFF濃縮，并 將緩沖液更換為IOmM BIS-TRIS pH 6。將經(jīng)脫鹽的材料經(jīng)由AEX層析進(jìn)一步加工，所述AEX 層析如實(shí)施例3中描述的那樣實(shí)施。將級(jí)分在梯度期間收集，并經(jīng)由定性4-MUG測(cè)定法篩 選GAA。將含有GAA的級(jí)分合并以進(jìn)一步純化。
[0163] 對(duì)于第三個(gè)層析步驟，將AMS的濃度提高到1M，并且在過(guò)濾后，經(jīng)由HIC進(jìn)一步純 化材料。在梯度過(guò)程中收集級(jí)分期間應(yīng)用1至OM AMS的連續(xù)鹽梯度。經(jīng)由定性測(cè)定法對(duì) 所有級(jí)分篩選GAA，并且將那些含有GAA的級(jí)分合并以進(jìn)一步加工。
[0164] 將合并物使用IOkD MWCO再生纖維素膜的15ml Amicon離心濾器經(jīng)由超速離心濃 縮，并經(jīng)由SEC使用與實(shí)施例3中所述相同的規(guī)程進(jìn)一步純化。然后，在變性條件下在經(jīng) Cibacron-藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)級(jí)分篩選純度。將90%純的GAA級(jí)分合并，并首先 在 TFF Vivaflow 200 模塊（PES 膜，IOkDMWCO, Sartorius)上濃縮，然后使用 15ml Amicon 離心濾器（IOkD MWC0,再生纖維素膜，Merck Millipore)進(jìn)行超速離心。將濃縮的材料進(jìn) 行第二輪SEC，使用與第一 SEC步驟相同的條件進(jìn)行。使用定性4-MUG GAA測(cè)定法對(duì)級(jí)分篩 選GAA。將具有GAA活性的級(jí)分合并并濃縮。
[0165] 在如實(shí)施例1中所列的脫帽和脫甘露糖基化后，將D-甘露醇添加至IOOmM的濃 度，并將體積再次減少，之后加載到最終的Superdex 200凝膠過(guò)濾柱上，該凝膠過(guò)濾柱于 4°C用25mM磷酸鈉 pH 6，150mM NaCl，100mM D-甘露醇平衡。使用4-MUG定性測(cè)定法對(duì)級(jí) 分篩選GAA，并將那些含有產(chǎn)物的級(jí)分合并并濃縮。
[0166] 實(shí)施例5
[0167] 95-1 IOkDa rhGAA 混合物的鈍化
[0168] 如下從菌株0XYY1589分離rhGAA的IlOkDa前體和95kDa形式兩者。在收獲后，將 材料進(jìn)行第二層析步驟，如實(shí)施例2中描述的。在HIC步驟后，將產(chǎn)物濃縮，并經(jīng)由TFF將 緩沖液更換成IOmM BIS-TRIS pH 6,并在AEX柱上加載。將產(chǎn)物在0至300mM NaCl的單一 步驟中于pH 6(10mM BIS-TRIS)洗脫，然后使用Pellicon XL50TFF模塊（具有IOkD MWCO 的再生纖維素膜）濃縮。將一半的材料經(jīng)由大小排阻層析進(jìn)一步純化。如實(shí)施例3中描述 的那樣實(shí)施層析步驟，但是僅基于變性條件下經(jīng)Cibacron-藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠上的 純度進(jìn)行級(jí)分的選擇以進(jìn)一步加工。
[0169] 將一半的合并物濃縮，并與AEX材料的剩余部分組合。在脫帽和脫甘露糖基化后， 將D-甘露醇的濃度提高到IOOmM,并且遵循與實(shí)施例2中的描述相同的規(guī)程進(jìn)行隨后的濃 縮和SEC步驟。將級(jí)分基于4-MUG定性測(cè)定法合并，并與來(lái)自實(shí)施例6的脫帽產(chǎn)物合并。
[0170] 實(shí)施例6
[0171] 95kDa rhGAA 的鈍化
[0172] 如下從菌株0XYY1589分離rhGAA的95kDa形式。在收獲后，將材料加工，直到且 包括AEX步驟，如實(shí)施例3中描述的。在AEX步驟中，相當(dāng)大量的產(chǎn)物由于加載過(guò)程中電導(dǎo) 率的增加而駐留于流過(guò)級(jí)分中。因此，將流過(guò)材料再次滲濾到合適的緩沖液，并進(jìn)行第二輪 AEX層析。在分開(kāi)加工后，兩個(gè)量（批次A和批次B)都來(lái)自這里。
[0173] 將批次A與來(lái)自實(shí)施例5的SEC合并物的剩余部分和來(lái)自實(shí)施例2的CEX合并物 的剩余部分組合，隨后將合并物濃縮并滲濾到含有IOmM BIS-TRIS pH 6, 300mM NaCl的緩 沖液。將材料于30°C溫育65h。然后，通過(guò)將IM乙酸鈉儲(chǔ)液緩沖液pH 5添加至125mM的 濃度將PH降低到pH 5,并將樣品于30°C再次溫育。在24h后，使用40:1重量：重量比產(chǎn) 物的總蛋白含量對(duì)蛋白酶混合物用Flavourzyme (Novozymes Corp)( -種來(lái)自米曲霉的蛋 白酶混合物）處理產(chǎn)物，并且最后一次于30°C溫育。在過(guò)夜溫育后，經(jīng)由第一 SEC步驟純 化材料，所述第一 SEC步驟在與實(shí)施例3中的描述相同的條件下實(shí)施。將級(jí)分合并，該級(jí)分 基于還原性條件下經(jīng)Cibacron-藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)評(píng)估含有純的產(chǎn)物。在濃縮并 緩沖液更換為20mM乙酸鈉 pH 5后，將材料脫帽并脫甘露糖基化，如實(shí)施例1中所列的。將 D-甘露醇添加至IOOmM的濃度，并將材料與來(lái)自實(shí)施例5的脫帽并脫甘露糖基化的材料合 并。如實(shí)施例2中所描述的那樣實(shí)施最終的SEC步驟及隨后的樣品操作。
[0174] 將批次B與來(lái)自實(shí)施例3的終產(chǎn)物合并，并將合并物濃縮，并滲濾到含有IOmM BIS-TRIS pH 6, 300mM NaCl的緩沖液。然后，使用與實(shí)施例5中的描述相同的重量比將產(chǎn) 物于30°C用米曲霉蛋白酶混合物處理過(guò)夜溫育時(shí)段，然后經(jīng)由第一 SEC步驟純化，實(shí)施第 一 SEC步驟在如實(shí)施例3中描述的相同條件下實(shí)施。如實(shí)施例5中描述的那樣完成產(chǎn)物的 進(jìn)一步加工。
[0175] 在最終批次中，將來(lái)自批次A和批次B的產(chǎn)物以在GAA含量上14:1的比率混合。
[0176] 實(shí)施例7
[0177] 76kDa rhGAA 的鈍化
[0178] 如下從菌株0XYY1589分離rhGAA的76kDa形式。在收獲后，將培養(yǎng)物進(jìn)行二輪連 續(xù)離心。將上清液合并，并將AMS引入到約IM的濃度。在溶解后，將在20mM磷酸鈉 pH 6, IM AMS中預(yù)平衡的1個(gè)體積的HIC樹(shù)脂在攪動(dòng)的情況下添加到50個(gè)體積的上清液，以在批次 吸收模式（batch uptake mode)中結(jié)合產(chǎn)物。將所得的楽體于4°C在不攪動(dòng)的情況下I&存 過(guò)夜。在此時(shí)段期間，褐色層停留在溶質(zhì)上方，該溶質(zhì)經(jīng)由溫和抽吸在早餐除去。將樹(shù)脂在 每個(gè)輪次中用三個(gè)體積的前導(dǎo)緩沖液（20mM磷酸鈉 pH 6, IM AMS)清洗三次，之后將其填充 到柱中。將填充樹(shù)脂清洗，直到UV信號(hào)幾乎達(dá)到基線，然后，用水洗脫產(chǎn)物。通過(guò)將IOOmM BIS-TRIS pH 6的儲(chǔ)液緩沖液添加到IOmM的濃度調(diào)節(jié)洗脫液的pH。然后，將材料在袋中無(wú) 菌過(guò)濾，并且于4°C貯存11天的時(shí)段。
[0179] 如實(shí)施例4中所描述的，實(shí)施第二和第三層析步驟和附隨的材料操作。首先， 將第三層析步驟后的合并物在兩個(gè)平衡偶聯(lián)的TFF Vivaflow 200模塊（PES膜，IOkD MWCO, Sartorius)上濃縮約7倍，然后使用IOkD MWCO的15ml Amicon離心濾器（再生纖維 素膜，Merck Millipore)超速離心。將濃縮的材料分成兩份，并使用與實(shí)施例4中的描述 相同的條件經(jīng)由SEC進(jìn)一步純化。然后，在變性條件下在經(jīng)Cibacron-藍(lán)染色的聚丙烯酰 胺凝膠上對(duì)級(jí)分篩選純度。將選擇的級(jí)分合并以濃縮到兩個(gè)平行偶聯(lián)的Vivaflow 200 TFF 模塊（PES 膜，IOkD MWCO, Sartorius)上。使用 IOkD MWCO 的 15ml Amicon 離心濾器（再 生纖維素膜，Merck Millipore)進(jìn)一步減少體積。
[0180] 在脫帽和脫甘露糖基化后，將D-甘露醇添加到IOOmM的濃度，并將樣品在 Vivaflow 50 TFF模塊（PES膜，IOkD MWCO，Sartorius)上再次濃縮，之后加載到最終的SEC 柱上，其以與實(shí)施例4中的描述相同的方式實(shí)施。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并并濃縮。
[0181] 實(shí)施例8
[0182] 俥用人工牛色底物對(duì)硝某苯某-a -D-葡糖吡喃糖苷對(duì)huGAA的不同奪體
[0183] (76,95和IlOkD奪體）的酶促表征
[0184] 使用人工生色底物對(duì)硝基苯基-a -D-葡糖吡喃糖苷（PNPG)測(cè)定實(shí)施例2中獲得 的未加工的huGAA(llOkDa)和實(shí)施例7(76kDa)，實(shí)施例6(95kDa)和實(shí)施例4(95kDa)中獲 得的經(jīng)加工的huGAA變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。用商業(yè)人α-葡糖苷酶「Myozyme? (阿葡糖苷 酶alpha, Genzyme)進(jìn)行比較。
[0185] 將酶在含有0. 1 % BSA和IOOmM AMS的IOOmM乙酸鈉緩沖液pH 4. 0 (反應(yīng)緩沖液） 中稀釋至20 μ g/ml。將10 μ 1酶溶液一式三份添加到96孔板。將PNPG底物（Sigma)在反 應(yīng)緩沖液中稀釋至多個(gè)底物濃度（10,6,4, 2,1. 6,1. 2,0. 8,和0. 4mM)，并將90 μ 1稀釋底物 添加至每孔。將酶促反應(yīng)于37°C溫育60分鐘，接著添加100 μ 1 10%碳酸鈉 ，pH 12以淬滅 反應(yīng)。于405nm測(cè)量吸光度。測(cè)量用對(duì)硝基酚（PNP)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算每分鐘形成的 產(chǎn)物量。以μ M/min表示的速度以產(chǎn)生Michaelis-Menten曲線的不同底物濃度的函數(shù)繪 圖。依照對(duì)Michaelis-Menten等式的直接擬合，使用GraphPad Prism計(jì)算Vmax和Km。計(jì) 算催化常數(shù)kcat和催化效率kcat/Km。各種酶的比活以U/mg報(bào)告，其中1個(gè)單位定義為在 IOOmM乙酸鈉緩沖液，pH 4. 0+0. 1 % BSA和IOOmMAMS中在2mM底物濃度每分鐘催化Inmol 底物水解的酶量。表1中顯示了結(jié)果。
[0186] 表 1
[0187]
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的分子復(fù)合物，其具有酸性alpha葡糖苷酶（GAA)活性，且包含至少兩個(gè)多 肽，每個(gè)多肽與SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū) 段通過(guò)對(duì)SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位 點(diǎn)處的蛋白水解衍生；其中所述分子復(fù)合物包含至少一處修飾，其導(dǎo)致所述分子復(fù)合物被 轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部的能力增強(qiáng)。
2. 權(quán)利要求1的分子復(fù)合物，其中每個(gè)區(qū)段通過(guò)對(duì)SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列 在氨基酸60和氨基酸65之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解衍生。
3. 權(quán)利要求1的分子復(fù)合物，所述復(fù)合物包含至少三個(gè)多肽。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中所述對(duì)SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序 列的蛋白水解進(jìn)一步包括在SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746 之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切割或氨基酸137和氨基酸151之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切 割。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，所述復(fù)合物包含至少四個(gè)多肽。
6. 權(quán)利要求5的分子復(fù)合物，其中所述蛋白水解進(jìn)一步包括在SEQIDNO: 1中所列的 氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切割和在SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的切割。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中至少一個(gè)所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)磷酸 化的N-聚糖，且其中所述修飾包含至少一個(gè)磷酸化的N-聚糖的脫帽和脫甘露糖基化。
8. 權(quán)利要求5的分子復(fù)合物，其中所述多肽上至少40%的N-聚糖是脫帽且脫甘露糖 基化的。
9. 權(quán)利要求8的分子復(fù)合物，其中所述多肽上至少60%的N-聚糖是脫帽且脫甘露糖 基化的。
10. 權(quán)利要求8的分子復(fù)合物，其中所述多肽上至少80 %的N-聚糖是脫帽且脫甘露糖 基化的。
11. 權(quán)利要求8的分子復(fù)合物，其中所述多肽上至少90%的N-聚糖是脫帽且脫甘露糖 基化的。
12. 權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中每個(gè)多肽與SEQIDNO: 1中所列的氨 基酸序列的區(qū)段具有至少90%序列同一性。
13. 權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中每個(gè)多肽與SEQIDNO: 1中所列的氨 基酸序列的區(qū)段具有至少95%序列同一性。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中對(duì)于所述至少兩個(gè)多肽之一，所述區(qū) 段包含SEQIDNO: 1的氨基酸22至57,且其中對(duì)于所述至少兩個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含 SEQIDNO: 1的氨基酸66至896。
15. 權(quán)利要求3-14中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中對(duì)于所述至少三個(gè)多肽之一，所述區(qū) 段包含SEQIDNO: 1的氨基酸22至57,其中對(duì)于所述至少三個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含 SEQIDNO: 1的氨基酸66至726,且其中對(duì)于所述至少三個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含SEQID NO: 1的氨基酸736至896。
16. 權(quán)利要求5-14中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中對(duì)于所述至少四個(gè)多肽之一，所述區(qū) 段包含SEQIDNO: 1的氨基酸22至57,其中對(duì)于所述至少四個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含SEQ IDNO: 1的氨基酸66至143,其中對(duì)于所述至少四個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含SEQIDNO: 1 的氨基酸158至726,且其中對(duì)于所述至少四個(gè)多肽之一，所述區(qū)段包含SEQIDNO: 1的氨 基酸736至896。
17. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中所述至少一處修飾包括與至少一個(gè)所 述多肽融合的胞外受體的配體。
18. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中所述至少一處修飾包括與至少一個(gè)所 述多肽融合的靶向域，其中所述靶向域結(jié)合靶細(xì)胞的表面上的受體的胞外域。
19. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中所述至少一處修飾包括與至少一個(gè)所 述多肽融合的尿激酶型纖維蛋白溶酶原受體。
20. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中所述至少一處修飾包括與至少一個(gè)所 述多肽融合的人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的識(shí)別域。
21. -種組合物，其包含權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物，其中所述分子復(fù)合物 是凍干的。
22. 權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物以一次性管形瓶包裝。
23. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的分子復(fù)合物和藥學(xué)可接受載 體。
24. 權(quán)利要求23的組合物，其中所述組合物被配制用于靜脈內(nèi)或皮下施用。
25. 權(quán)利要求23的組合物，其中所述組合物被配制用于靜脈內(nèi)輸注。
26. -種治療蓬佩（Pompe)氏病的方法，所述方法包括對(duì)診斷為蓬佩氏病的患者施用 權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的所述組合物。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述患者診斷為嬰兒期發(fā)作性（infantileonset)蓬佩 氏病。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述患者診斷為遲發(fā)性蓬佩氏病。
29. -種用于生成分子復(fù)合物的方法，所述方法包括使具有SEQIDNO: 1中所列的氨 基酸序列的多肽與蛋白酶接觸，所述蛋白酶與SEQIDN0:8中所列的氨基酸序列具有至少 85%序列同一性，其中所述蛋白酶在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處切割 所述多肽。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中在體外實(shí)施所述接觸。
31. 權(quán)利要求29或權(quán)利要求30的方法，其中所述蛋白酶在氨基酸60和氨基酸65之間 的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處切割所述多肽。
32. -種用于生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合物的方法， 所述方法包括使分子復(fù)合物與甘露糖苷酶接觸，所述甘露糖苷酶能夠（i)將甘露糖-1-磷 酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸及（ii)水解末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3 甘露糖和/或alpha-1，6甘露糖連接，所述分子復(fù)合物具有GAA活性且包含至少兩個(gè)多肽， 每個(gè)多肽與SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段 通過(guò)對(duì)SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn) 處的蛋白水解衍生，其中至少一個(gè)所述多肽包含含有一個(gè)或多個(gè)甘露糖-1-磷酸-6-甘露 糖模塊的磷酸化N-聚糖。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
34. 權(quán)利要求32或33的方法，其中所述甘露糖苷酶是直生刀豆（Canavalia ensiformis)甘露糖苷酶。
35. 權(quán)利要求32或33的方法，其中所述甘露糖苷酶是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)甘露糖苷酶。
36. 權(quán)利要求32-35中任一項(xiàng)的方法，其中在重組真菌細(xì)胞中發(fā)生所述接觸，所述真菌 細(xì)胞表達(dá)所述甘露糖苷酶。
37. -種生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合物的方法，所 述方法包括使分子復(fù)合物與能夠水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或 alpha-1，6甘露糖連接的甘露糖苷酶接觸，所述分子復(fù)合物具有GAA活性且包含至少兩個(gè) 多肽，每個(gè)多肽與SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每 個(gè)區(qū)段通過(guò)對(duì)SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或 多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解衍生，其中在所述接觸前，至少一個(gè)所述多肽包含含有脫帽的甘露 糖-6-磷酸模塊的磷酸化N-聚糖。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族47糖基水解酶。
39. 權(quán)利要求37或38的方法，其中所述甘露糖苷酶是齋藤曲霉（Aspergillussatoi) 甘露糖苷酶。
40. 權(quán)利要求37的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族92糖基水解酶。
41. 權(quán)利要求37或40的方法，其中甘露糖苷酶是纖維化纖維微細(xì)菌 (Cellulosimicrobiumcellulans)甘露糖苷酶。
42. 權(quán)利要求37的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
43. 權(quán)利要求37或權(quán)利要求42的方法，其中所述甘露糖苷酶是直生刀豆甘露糖苷酶。
44. 權(quán)利要求37-43中任一項(xiàng)的方法，其中在重組真菌細(xì)胞中發(fā)生所述接觸，所述真菌 細(xì)胞表達(dá)所述甘露糖苷酶。
45. -種生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合物的方法，所述方 法包括使分子復(fù)合物與能夠?qū)⒏事短?1-磷酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸的 甘露糖苷酶接觸，所述分子復(fù)合物具有GAA活性且包含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)對(duì)SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解衍生， 其中在所述接觸前，至少一個(gè)所述多肽包含甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模塊。
46. 權(quán)利要求45的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
47. 權(quán)利要求45或46的方法，其中所述甘露糖苷酶是直生刀豆甘露糖苷酶。
48. 權(quán)利要求45或46的方法，其中所述甘露糖苷酶是解脂耶氏酵母甘露糖苷酶。
49. 一種生成包含脫帽且脫甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子復(fù)合物的方法，所述方 法包括： a)使分子復(fù)合物與能夠?qū)⒏事短?1-磷酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸的甘 露糖苷酶接觸以使所述分子復(fù)合物中的至少一個(gè)多肽上的甘露糖-6-磷酸模塊脫帽，所述 分子復(fù)合物具有GAA活性且包含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQIDNO: 1中所列的氨基酸 序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)對(duì)SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列 在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解衍生；并 b)使所述分子復(fù)合物與能夠水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1，6甘露糖連接的甘露糖苷酶接觸。
50. 權(quán)利要求49的方法，其中通過(guò)兩種不同酶催化步驟（a)和步驟（b)。
51. 權(quán)利要求49的方法，其中通過(guò)單一酶催化步驟（a)和步驟（b)。
52. 權(quán)利要求49或50的方法，其中在重組真菌宿主細(xì)胞中發(fā)生所述接觸，所述真菌宿 主細(xì)胞表達(dá)能夠催化步驟（a)的甘露糖苷酶和能夠催化步驟（b)的甘露糖苷酶。
53. 權(quán)利要求49或51的方法，其中在重組真菌宿主細(xì)胞中發(fā)生所述接觸，所述真菌宿 主表達(dá)能夠催化步驟（a)和（b)的甘露糖苷酶。
54. 權(quán)利要求32-53中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括使哺乳動(dòng)物細(xì)胞與包含至 少一個(gè)多肽的所述分子復(fù)合物接觸，所述多肽包含所述脫帽且脫甘露糖基化的N-聚糖，其 中在所述接觸后，所述分子復(fù)合物以增強(qiáng)的效率轉(zhuǎn)運(yùn)到所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)部。
55. 權(quán)利要求54的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
56. -種將具有GAA活性的分子復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的方法，所述方法包括使哺乳 動(dòng)物細(xì)胞與所述分子復(fù)合物接觸，所述分子復(fù)合物包含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)對(duì)SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解衍生； 其中至少一個(gè)所述多肽上的磷酸化N-聚糖已經(jīng)如權(quán)利要求33-55中任一項(xiàng)的方法中所列 的那樣脫帽并脫甘露糖基化。
57. -種將具有GAA活性的分子復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的方法，所述方法包括使哺乳 動(dòng)物細(xì)胞與所述分子復(fù)合物接觸，所述分子復(fù)合物包含至少兩個(gè)多肽，每個(gè)多肽與SEQID NO: 1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)對(duì)SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解衍生， 所述分子復(fù)合物包含至少一處修飾，其導(dǎo)致所述分子復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部的 能力增強(qiáng)。
58. 權(quán)利要求56或權(quán)利要求57的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外。
59. 權(quán)利要求56或權(quán)利要求57的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在哺乳動(dòng)物受試者中。
60. 權(quán)利要求58-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
61. 權(quán)利要求57-60中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾包括與至少一個(gè)所述多肽融合的 靶向域，其中所述靶向域結(jié)合靶細(xì)胞的表面上的受體的胞外域。
62. 權(quán)利要求57-60中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一處修飾包括與至少一個(gè)所述多 肽融合的尿激酶型纖維蛋白溶酶原受體。
63. 權(quán)利要求57-60中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一處修飾包括與至少一個(gè)所述多 肽融合的人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的識(shí)別域。
64. -種分離的真菌細(xì)胞，其包含編碼SEQIDNO: 1中所列的GAA氨基酸序列的核酸和 編碼與SEQIDN0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的堿性蛋白酶的核酸， 其中所述真菌細(xì)胞生成具有GAA活性且包含至少兩個(gè)多肽的分子復(fù)合物，每個(gè)多肽與SEQ IDN0:1中所列的氨基酸序列的區(qū)段具有至少85%序列同一性，每個(gè)區(qū)段通過(guò)所述堿性蛋 白酶對(duì)SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn) 處的蛋白水解衍生。
65. 權(quán)利要求64的分離的真菌細(xì)胞，每個(gè)區(qū)段通過(guò)所述堿性蛋白酶對(duì)SEQIDNO: 1中 所列的氨基酸序列在氨基酸60和氨基酸65之間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解衍生。
66. 權(quán)利要求64或權(quán)利要求65的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼甘露糖苷酶 的核酸，所述甘露糖苷酶能夠（i)將甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷 酸及（ii)水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖連接。
67. 權(quán)利要求64或權(quán)利要求65的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼甘露糖苷酶 的核酸，所述甘露糖苷酶能夠?qū)⒏事短?1-磷酸-6-甘露糖模塊水解成甘露糖-6-磷酸。
68. 權(quán)利要求64或權(quán)利要求65的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼甘露糖 苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解末端alpha-1，2甘露糖、alpha-1，3甘露糖和/或 alpha-1, 6甘露糖連接。
69. 權(quán)利要求65的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼多肽的核酸，所述多肽能 夠促進(jìn)甘露糖基憐酸化。
70. 權(quán)利要求64-69中任一項(xiàng)的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞被遺傳工程化改造為 0CH1活性缺陷。
71. -種分離的真菌細(xì)胞，其包含編碼堿性蛋白酶的外源核酸，所述堿性蛋白酶與SEQ IDN0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。
【文檔編號(hào)】A61K38/47GK104379162SQ201380024824
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月15日
【發(fā)明者】W.沃維肯, K.C.T.A.M.皮恩斯, J.R.L.斯陶特, G.N.派納爾特 申請(qǐng)人:奧克西雷恩英國(guó)有限公司