用于治療創傷性腦損傷和用于調節神經原性細胞遷移的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本文公開了通過移植細胞來治療創傷性腦損傷的方法，所述細胞源于表達外源Notch細胞內結構域的骨髓粘附干細胞。經移植的細胞形成通路，內源神經原性細胞沿所述通路進行增殖并且從腦室下區遷移至損傷位點。
【專利說明】用于治療創傷性腦損傷和用于調節神經原性細胞遷移的方 法和組合物
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年5月16日提交的美國臨時專利申請號61/647, 893 (其說明書 和附圖通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的）的權益。
[0003] 關于聯邦政府資助的聲明
[0004] 本文中所描述的研宄中的一些得到來自國家神經學病癥和中風研宄所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke)的撥款的資助。美國政府可能享有 在本文所公開的發明中的某些權利。 發明領域
[0005] 本公開內容為用于神經學病癥的細胞療法的領域。
[0006] 發明背景
[0007] 最初用于深入檢驗細胞發育\干細胞已經成為再生醫學（包括用于治療神經學病 癥的基于細胞的療法）的基石 2'3。干細胞甚至存在于成年期中8,并且具有自我更新和分化 成多種譜系 9,促進正常的內環境穩定1(1，和內源地1H4或者在移植入受損傷的器官（即腦） 中之后 15_21發揮治療益處的能力。側腦室的腦室下區（SVZ)和海馬齒狀回的顆粒細胞下區 是成人腦中兩個主要的干細胞小生境（niche) 22'23,盡管在其他腦區域中已經檢測到靜息神 經干細胞（NSCs)24。在損傷后誘導內源干細胞將會在再生醫學中提供新的機會 2'3'&21。
[0008] 除了多能干細胞外的細胞也已經用于治療中樞神經系統的病癥。作為一個例子， 通過移植在缺血性損傷位點處或者在缺血性損傷位點附近，將SB623細胞（其為源自其中 已經表達了外源Notch細胞內結構域的骨髓粘附干細胞的細胞）用于治療中風。參見例如， 美國專利號 8, 092, 792,和 Yasuhara 等人，（2009)Stem Cells Devel. 18:1501-1513。美國 專利號7, 682, 825描述了 SB623細胞在許多中樞和周圍神經系統病癥的治療之中的另外用 途。
[0009] 盡管有這些科學進展和一些初步的臨床研宄但是在我們對于細胞療法的了 解中的根本缺口是關于經移植的細胞促進受損的神經組織修復的機制的知識。迄今為止， 在血液學和非血液學病癥中提供治療益處方面，增加的移植物存活和移植物持久存在已經 被認為是成功的細胞移植療法的關鍵。因此，許多努力指向延長經移植的細胞的存活和持 久存在。因此，不要求持久存在大量經移植的細胞的用于有效細胞療法的方法將會是有利 的。
[0010] 創傷性腦損傷（TBI)是指由于外部機械力而引起的對腦的損害。除了其他原因 夕卜，TBI尤其可以由于跌倒、火器傷、運動事故、建筑事故和交通事故而引起。TBI的受害者 可能會遭受到許多身體、認知、社交、情感和/或行為的紊亂。
[0011] 對于逆轉TBI的初始物理損害，幾乎沒有什么可以做的。因此，治療選項主要在于 用于在急性期中防止進一步損害的穩定化，和之后的康復。由于這些有限的選項，因而需要 另外的用于治療TBI的方法和組合物。
[0012] 發明概述
[0013] 本發明人已發現，SB623細胞（即源自其中已經表達了外源Notch細胞內結構域 的骨髓粘附干細胞的細胞）的移植可以用于治療創傷性腦損傷（TBI)。相比于僅接受載料 注射的因創傷而受損傷的動物而言，在TBI后接受SB623移植體的動物展示出顯著經改善 的運動和神經學功能，以及與之相關聯的顯著降低的對于皮層核心和損傷周圍皮層區域的 損害。
[0014] 發明人還已經發現，與預期相反，SB623細胞移植的治療益處并不需要大量經移植 的細胞的存活和持久存在。令人驚異地，可以通過最小和短期的移植物存活（其足以引發 強大且穩定的功能恢復）來獲得治療益處。這解決了兩個主要問題：對于充足供應可移植 的細胞的需要和對于長期移植物存活的需要。
[0015] 發明人還已經發現，SB623細胞移植在TBI治療中的有益效應是由于在腦室下區 (SVZ)中的神經原性小生境和受損傷的腦位點之間形成生物學橋（"生物橋"(biobridge)) 而引起的。已經通過免疫組織化學方式可視化并經激光捕獲的這種生物橋最初表達高水平 的細胞外基質金屬蛋白酶，并且其特征在于經移植的細胞流。在移植后的時間里，經移植的 細胞被新形成的宿主細胞替代，并且幾乎沒有經移植的細胞保留在生物橋中。因此，經移植 的SB623細胞最初在神經原性SVZ和受損傷的皮層之間形成通路，所述通路促進宿主神經 原性細胞稍后從神經原性小生境向腦損傷位點迀移。
[0016] 該連續的事件揭示了用于治療TBI的新方法，即移植SB623細胞，其形成用于引導 宿主神經原性細胞迀移的瞬時通路。也就是說，經移植的SB623細胞最初在神經原性小生 境和損傷位點之間形成生物橋；但一旦該生物橋形成，經移植的細胞被迀移至損傷位點的 宿主神經原性細胞所替代。這些發現揭示，宿主細胞從神經原性小生境向受損傷的腦位點 的長距離迀移可以通過經移植的SB623細胞來實現，所述經移植的SB623細胞用作用于引 發內源修復機制的生物橋。
[0017] 因此，本公開內容尤其提供了下列實施方案：
[0018] 1.用于在受試者中治療創傷性腦損傷的方法，所述方法包括向所述受試者的腦施 用治療有效量的SB623細胞，其中所述SB623細胞通過下述方式來獲得：（a)提供骨髓粘附 干細胞（MSCs)的培養物；(b)將步驟（a)的細胞培養物與包含編碼Notch細胞內結構域 (NICD)的序列的多核苷酸相接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長Notch蛋白；（c)選擇包含 步驟（b)的多核苷酸的細胞；和（d)在不進行選擇的情況下進一步培養步驟（c)的所選擇 出的細胞。
[0019] 2.實施方案1的方法，其中所述受試者為人。
[0020] 3.實施方案1或2的方法，其中所述MSCs從人獲得。
[0021] 4.用于移植到受試者中以治療創傷性腦損傷的細胞，其中所述細胞通過包括下列 步驟的過程來獲得：(a)提供MSCs的培養物；(b)將步驟（a)的細胞培養物與包含編碼NICD 的序列的多核苷酸相接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長Notch蛋白；（c)選擇包含步驟 (b)的多核苷酸的細胞；和（d)在不進行選擇的情況下進一步培養步驟（c)的所選擇出的 細胞。
[0022] 5.實施方案4的細胞，其中所述受試者為人。
[0023] 6.實施方案4或5的細胞，其中所述MSCs從人獲得。
[0024] 7.用于誘導內源神經原性細胞從神經原性小生境向腦損傷位點迀移的方法，所述 方法包括向受試者的腦施用治療有效量的SB623細胞，其中所述SB623細胞通過下述方式 來獲得：(a)提供MSCs的培養物；(b)將步驟（a)的細胞培養物與包含編碼Notch細胞內結 構域（NICD)的序列的多核苷酸相接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長Notch蛋白；（c)選 擇包含步驟（b)的多核苷酸的細胞；和（d)在不進行選擇的情況下進一步培養步驟（c)的 所選擇出的細胞。
[0025] 8.實施方案7的方法，其中所述神經原性小生境為腦室下區。
[0026] 9.實施方案7或8的方法，其中所述腦損傷為創傷性腦損傷。
[0027] 10.實施方案7-9中任一項的方法，其中所述受試者為人。
[0028] 11.實施方案7-10中任一項的方法，其中所述MSCs從人獲得。
[0029] 12.用于在受試者中刺激神經原性細胞增殖的方法，所述方法包括向受試者的腦 施用治療有效量的SB623細胞，其中所述SB623細胞通過下述方式來獲得：(a)提供MSCs的 培養物；(b)將步驟（a)的細胞培養物與包含編碼Notch細胞內結構域（NICD)的序列的多 核苷酸相接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長Notch蛋白；（c)選擇包含步驟（b)的多核苷 酸的細胞；和（d)在不進行選擇的情況下進一步培養步驟（c)的所選擇出的細胞。
[0030] 13.實施方案12的方法，其中所述腦損傷為創傷性腦損傷。
[0031] 14.實施方案12或13的方法，其中所述受試者為人。
[0032] 15.實施方案12-14中任一項的方法，其中所述MSCs從人獲得。
[0033] 16.用于在受試者中誘導神經原性細胞進行增殖并向腦損傷位點迀移的方法，所 述方法包括向受試者的腦施用治療有效量的SB623細胞，其中所述SB623細胞通過下述方 式來獲得：(a)提供MSCs的培養物；(b)將步驟（a)的細胞培養物與包含編碼Notch細胞 內結構域（NICD)的序列的多核苷酸相接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長Notch蛋白；（c) 選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細胞；和（d)在不進行選擇的情況下進一步培養步驟（c) 的所選擇出的細胞。
[0034] 17.實施方案16的方法，其中所述腦損傷為創傷性腦損傷。
[0035] 18.實施方案16或17的方法，其中所述受試者為人。
[0036] 19.實施方案16-18中任一項的方法，其中所述MSCs從人獲得。
[0037] 附圖簡述
[0038] 圖1顯示了在大鼠中"抬高身體擺動測試"(elevated body swing test，EBST)的 結果。提供了基線（在TBI前）以及在TBI后7天、I個月、2個月和3個月的值。大鼠接 受SB623細胞移植體（"細胞"，每對中最右邊的柱）或者載料輸注（"載料"，每對中最左 邊的柱表明了統計學顯著性，P<〇.〇5。
[0039] 圖2顯示了在經歷了 TBI并隨后接受SB623細胞移植體（"細胞"）或者載料輸注 ("載料"）的大鼠中的改進的Bederson神經學檢查的平均得分。提供了基線（在TBI前） 以及在TBI后7天、1個月、2個月和3個月的值。每對中最左邊的柱表示在輸注了載料的 大鼠中的得分；每對中最右邊的柱表示在接受了 SB623細胞移植體的大鼠中的得分。" " 表明了統計學顯著性，P < 〇. 05。
[0040] 圖3顯示了大鼠能夠保持在Rotorod裝置上的秒數的平均值。大鼠經歷了實驗性 TBI，并隨后接受SB623細胞移植體（"細胞"）或者載料輸注（"載料"）。提供了基線（在 TBI前）以及在TBI后7天、1個月、2個月和3個月的值。每對中最左邊的柱表示在輸注 了載料的大鼠中的得分；每對中最右邊的柱表示在接受了 SB623細胞移植體的大鼠中的得 分。表明了統計學顯著性，ρ<〇·〇5。
[0041] 圖4Α和4Β顯示了在經歷了 TBI的大鼠中對于皮層核心（"核心"）以及對于在沖 擊位點中和周圍的皮層區域（"損傷周圍"）的損害的檢驗的結果。圖4Α顯示了來自接受 SB623細胞移植體的大鼠（圖版a-d)的腦的Η&Ε切片，相比于接受載料輸注的大鼠（圖版 al-dl)而言。在圖4B中，將結果表示為相對于經歷了 TBI并接受載料輸注的動物而言的損 傷區域的百分比（參見實施例8)。每對中最左邊的柱顯示了核心區域的值；每對中最右邊 的柱顯示了損傷周圍區域的值。
[0042] 圖5顯示了在TBI后1個月和3個月時，相比于經歷了 TBI并接受載料輸注的動物 而言，在經歷了 TBI并接受SB623細胞移植體的動物的腦室下區（"SVZ"）和皮層（"CTX"） 中經Ki67標記的細胞的水平。" "表明了每高倍視野中所觀察到的經標記的細胞的數目 的在統計學上顯著的增加 （P < 〇. 05)。
[0043] 圖6顯示了在TBI后1個月和3個月時，相比于經歷了 TBI并接受載料輸注的動物 而言，在經歷了 TBI并接受SB623細胞移植體的動物的腦室下區（"SVZ"）和皮層（"CTX"） 中經巢蛋白標記的細胞的水平。" "表明了每高倍視野中所觀察到的經標記的細胞的數目 的在統計學上顯著的增加 （P < 〇. 05)。
[0044] 圖7顯示了在TBI后1個月和3個月時，相比于經歷了 TBI并接受載料輸注的動 物而言，在經歷了 TBI并接受SB623細胞移植體的動物的胼胝體（"CC"）和皮層（"CTX"） 中經雙皮質素標記的細胞的水平。表明了每高倍視野中所觀察到的經標記的細胞的數 目的在統計學上顯著的增加 （P < 〇. 05)。
[0045] 圖8顯示了在TBI后1個月和3個月時，在來自經歷了實驗性TBI的大鼠腦的經 激光捕獲的生物橋的勻漿物中的分解活性。將活性表示為相對于〇. 5ng重組MMP-9而言的 光密度單位，其通過掃描酶譜法凝膠來獲得。在所述2組的各具有3條柱的每一組中，最左 邊的柱表示在來自在TBI后輸注載料的大鼠的生物橋中的相對活性，中間的柱表示在來自 在TBI后移植SB623細胞的大鼠的生物橋中的相對活性，和最右邊的柱表示在來自對照即 進行假手術的大鼠的生物橋中的相對活性。
[0046] 發明詳述
[0047] 本文公開了用于治療創傷性腦損傷（TBI)的方法和組合物。本文還公開了用于調 節在腦中干細胞（例如，神經干細胞，神經元干細胞）的迀移的方法和組合物。
[0048] 發明人已經得到了令人驚訝的發現：在TBI后由于細胞移植而引起的行為和組織 學改善不要求大規模的移植物存活或長期的移植物持久存在。實際上，對于產生這些治療 益處來說僅需要適度的、短期的移植物存活。因此，發明人揭示了需要閾值劑量的經移植的 細胞的用于神經修復的新方法，所述經移植的細胞不需要在腦中持久存在，并且能夠誘導 SVZ產生新細胞和將新細胞推動至受沖擊的皮層區域。因此，移植最小有效劑量和經移植的 細胞的短期存活足以引發用于消除大量腦損傷的錯綜復雜的內源修復機制。
[0049] 除非另有指明，本公開內容的實踐使用了在細胞生物學、毒理學、分子生物學、生 物化學、細胞培養、免疫學、神經學、手術和重組DNA的領域以及相關領域中的標準方法和 常規技術，其在本領域的技能之內。這樣的技術描述在文獻中，并由此對于本領域技術人員 來說是可獲得的。參見例如Alberts，B.等人，"Molecular Biology of the Cell"，第5版， Garland Science，New York，NY，2008 ;Voet，D.等人，"Fundamentals of Biochemistry : Life at the Molecular Level"，第 3 版，John Wiley & Sons，Hoboken，NJ，2008 ; Sambrook，J.等人，"Molecular Cloning :A Laboratory Manual"，第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 ；Ausubel, F.等人，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley & Sons，New York，1987,及定期更新；Freshney，R. I. ,"Culture of Animal Cells ：A Manual of Basic Technique''，第 4 版，John Wiley & Sons，Somerset， NJ，2000;和 "Methods in Enzymology" 叢書，Academic Press，San Diego, CA0
[0050] 骨髓粘附干細胞（MSCs)
[0051] 本公開內容提供了用于在受試者中通過向腦損傷位點移植SB623細胞來治療TBI 和調節干細胞迀移的方法。通過在MSCs中表達Notch蛋白的細胞內結構域而從骨髓粘附 干細胞（MSCs)(也稱為骨髓粘附基質細胞和間充質干細胞）獲得SB623細胞。通過從骨髓 中選擇粘附細胞（即，粘附至組織培養塑料制品的細胞）而獲得MSCs。
[0052] MSCs的示例性公開內容提供在美國專利申請
【發明者】C·V·博蘭干, C·C·凱斯 申請人:桑比歐公司, 南佛羅里達大學