治療狗中的萊姆病的疫苗和方法
【專利摘要】本發明提供一種免疫原性組合物，其包含伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)的OspA蛋白質的抗原片段和含有伯氏疏螺旋體的OspC蛋白質的不同系統型的抗原片段的嵌合蛋白質。還提供合并有本發明的免疫原性組合物的疫苗，以及使用所述疫苗預防狗中的萊姆病和/或保護狗免患萊姆病的方法。
【專利說明】治療狗中的萊姆病的疫苗和方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸醫學藥物領域。更具體地說，本發明屬于治療或預防狗中的萊姆病 (Lyme disease)的疫苗的領域。

【背景技術】
[0002] 萊姆病是由疏螺旋體屬（genus Borrelia)的病原性螺旋菌引起的細菌感染。感染 可以在人類、狗、鹿、小鼠和其它動物中發生，并且通過節肢動物載體（最值得注意的是硬 蜱屬（genus Ixodes)的蜱蟲）來傳播。伯氏疏螺旋體，北美最常見的萊姆病病因，在1982 年第一次培養。疏螺旋體在蜱蟲咬傷的部位被引入宿主并且這一部位也是初始特征性皮膚 病灶（慢性游走性紅斑（erythema chronicum migrans))的位置。在狗中，萊姆病表現為 關節炎引起的跛行、厭食癥、發熱、嗜睡、淋巴結病變并且在一些情況下致死性絲球體腎炎。 最近研究表明，地方性區域中活性感染的狗的百分比可高達11%。
[0003] 可在任何時間用抗生素（如青霉素、紅霉素、四環素和頭孢曲松（ceftriaxone)) 治療感染。但是，一旦出現感染，藥物就可能不能清除螺旋菌的宿主，而僅可以起到控制疾 病的慢性形式的作用。如關節炎和疲勞等并發癥可在診斷和治療之后持續若干年。
[0004] 開發犬萊姆病疫苗以通過主要誘導OspA螺旋體酸抗體來提供保護。伯氏疏螺旋 體（B. burgdorferi)OspC是另一個用于螺旋體酸抗體介導的免疫性的潛在目標。這一蛋 白質似乎具有負責誘導螺旋體酸抗體的抗原決定基，并且在病原性疏螺旋體屬中不是保守 性。盡管OspC蛋白質的具體功能尚未知，但已提出哺乳動物感染而非蜱蟲感染需要OspC表 達。疏螺旋體在蜱蟲開始供料之后不久便表達OspC，并且必須持續表達OspC以在哺乳動物 中形成感染。因此，與OspA螺旋體酸抗體相比，OspC螺旋體酸抗體的"效力窗"顯著增加。
[0005] 卡利斯特（Callister)等人（美國專利第6, 210, 676號和第6, 464, 985號，以引用 的方式并入本文中）建議使用OspC的免疫原性多肽片段（單獨或與OspA多肽組合）制備 疫苗以保護人類和其它哺乳動物免患萊姆病。萊弗利（Livey)等人（美國專利第6, 872, 550 號，以引用的方式并入本文中）也提出由重組型0spA、0spB和OspC蛋白質的組合制備用于 對萊姆病實現免疫的疫苗。
[0006] 但是，在產生成功的疫苗之前，需要克服至少兩個障礙。首先，存在超過20種OspC 系統型，并且尚不清楚疫苗中應包括哪些系統型。其次，需要確定用于螺旋體酸抗OspC抗 體的發展的合適抗原決定基。
[0007] 因此，在本領域中仍然長期需要經改良的疫苗以用于保護哺乳動物，并且特別說 來，犬，免患萊姆病。


【發明內容】

[0008] 在一個方面中，本發明通過提供免疫原性組合物而解決這些和其它需求，所述免 疫原性組合物包含：第一蛋白質，其包含與seq id no: Umdpntvssfqvdsflwhvrkrvadqelgd APFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMGKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMNVL VSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKD KSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTEIKSDGSGKAKEVLKSYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSG EVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNAL K)至少95%-致的氨基酸序列；和第二蛋白質，其包含OspC系統型F和N的免疫顯性抗原 決定基。
[0009] 在一組實施例中，第二蛋白質包含與來自一種或一種以上OspC系統型I、H、C、M和 D的環5(環肽）和α螺旋5(螺旋肽）的免疫顯性抗原決定基至少95%-致的多個肽，其 中另外，來自每種系統型的環肽和螺旋肽彼此相鄰并且其中，環肽和螺旋肽連續排列；和以 下各者中的至少一者：彼此相鄰的OspC系統型F的環肽和螺旋肽，或與SEQ ID Ν0:3295% 一致的氨基酸序列。在一組實施例中，如果存在與SEQ ID Ν0:3295%-致的所述氨基酸序 列，那么其位于所述第二蛋白質的羧基端。
[0010] 在一組實施例中，第一蛋白質是SEQ ID Ν0:1。在另一組實施例中，系統型Ι、Η、Ν、 C、M、D和F的環和螺旋肽分別與SEQ ID Ν0:4-17至少95%-致。
[0011] 在另一組實施例中，免疫原性組合物還可以包含來自一種或一種以上OspC系統 型F、T、U、E、A、B和K的額外環和螺旋肽，其在一些實施例中，分別與SEQ ID NO: 16-29 - 致。
[0012] 在另一組實施例中，免疫原性組合物可更包含至少一種額外抗原，所述至少一 種額外抗原具有針對可引起狗中的疾病的微生物的保護性。所述微生物可選自包含以 下各者的群組：大瘟熱（CD)病毒、犬腺病毒2型（CAV-2)、犬副流感（CPI)病毒、犬小病 毒（CPV)、犬冠狀病毒（CCV)、犬皰疹病毒和狂犬病病毒。用于本發明的疫苗組合物中的 來自這些病原體的抗原可呈經修飾的活病毒制劑或非活性病毒制劑形式。其它病原體 還包括巴達維亞鉤端螺旋體（Leptospira bratislava)、雙曲鉤端螺旋體（Leptospira canicola)、感冒傷寒型鉤端螺旋體（Leptospira grippotyphosa)、黃疸出血型鉤端螺旋體 (Leptospira icterohaemorrhagiae)、波蒙那鉤端螺旋體（Leptospira pomona)、哈博維斯 鉤端螺旋體（Leptospira hardjobovis)、卩卜啉單胞菌屬（Porphyromonas spp·)、擬桿菌屬 (Bacteriodes spp·)、利什曼原蟲屬（Leishmania spp·)、艾利希體屬（Ehrlichia spp·)、 霉菜菌屬（Mycoplasma spp.)和犬小抱子菌（Microsporum canis)。
[0013] 在特定實施例中，免疫原性組合物包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 30或SEQ ID N0:31。
[0014] 在另一方面，本發明提供包含如上文所描述的免疫原性組合物的疫苗組合物。疫 苗還可以包含佐劑和藥學上可接受的載劑。在不同實施例中，佐劑包括（但不限于）礦物質 鹽、表面活性劑和微米粒子、細菌產物、細胞因子和激素、載劑、水包油乳液和油包水乳液。
[0015] 在另一方面，本發明還提供預防犬中的萊姆病的方法，其包含投予對其有需要的 犬免疫有效劑量的疫苗組合物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1說明通過從狗獲得的皮膚活檢樣品進行克隆而鑒別的OspC類型的相鄰接合 樹。
[0017] 圖2說明通過對從狗獲得的皮膚活檢體分離的伯氏疏螺旋體純系進行定序而鑒 別的OspC類型的相鄰接合樹。
[0018] 圖3A和圖3B說明嵌合序列A12CF和A10CF(分別是SEQ ID N0:31和30)，其適合 作為本文中所描述的免疫原性組合物的第二蛋白質。
[0019] 圖4說明OspC系統型A菌株B31和其它OspC系統型的蛋白質序列。

【具體實施方式】
[0020] 為了更好地理解本申請案，提供以下非限制性定義：
[0021] 術語"至少95% -致"包括介于95%與100%之間的所有一致性百分比并且包括 95%和 100%，例如 96%、97%、98%、99%等。
[0022] 術語"α螺旋5區"或"螺旋5區"是指位于OspC系統型A菌株B31的殘基160 與200之間的氨基酸序列，并且含有二級結構元件，包括環6、α螺旋5和非結構化C端域 的一部分（庫馬蘭（Kumaran)等人，2001)。
[0023] 術語"保守性取代"表示氨基酸殘基由另一種生物學上類似的殘基置換，或核酸序 列中核苷酸的置換，使得經編碼的氨基酸殘基不變化或是另一種生物學上類似的殘基。保 守性取代的實例包括一種疏水性殘基（如異白氨酸、纈氨酸、白氨酸或甲硫氨酸）由另一種 疏水性殘基取代，或一種極性殘基由另一種極性殘基取代，如精氨酸由離氨酸取代、谷氨酸 由天冬氨酸取代，或谷氨酰胺由天冬酰氨取代等。術語"保守性取代"還包括使用經取代的 氨基酸替代未經取代的親本氨基酸，其條件是針對經取代的多肽培養的抗體也與未經取代 的多肽進行免疫反應。
[0024] 術語參考蛋白質或參考核酸的"保守性變化"分別是指僅通過保守性取代而與參 考分子不同的蛋白質或核酸。
[0025] 系統型名稱前面的術語"構建體"（例如N-構建體或I-構建體）是指包含環肽和 螺旋肽的氨基酸序列。
[0026] 術語OspC的某一系統型的"螺旋肽"或" α螺旋肽"是指與來自所述系統型的OspC 蛋白質的α螺旋5區的免疫顯性抗原決定基至少95% -致的肽。因此，舉例來說，螺旋肽 N是指與來自OspC系統型N的α螺旋5區的免疫顯性抗原決定基至少95%-致的肽。
[0027] 術語"免疫顯性抗原決定基"是指分子上的抗原決定基，其與其它抗原決定基相比 誘導顯性或密集免疫反應，包括一種或兩種B細胞和T細胞反應。
[0028] 術語"線性抗原決定基"是指包含通過肽鍵接合在一起以形成肽或多肽的氨基酸 的單一、非中斷、連續鏈的抗原決定基。這類抗原決定基可由其主要結構，即鏈中氨基酸的 線性序列描述。當在OspC的重組型蛋白質亞單元中表達時，這類抗原決定基保持以與野生 型蛋白質的結合類似的方式結合感染誘導的抗體的能力。
[0029] 術語OspC的某一系統型的"環肽"是指與來自所述系統型的OspC蛋白質的環5區 的免疫顯性抗原決定基至少95% -致的肽。因此，舉例來說，環肽N是指與來自OspC系統 型N的環5區的免疫顯性抗原決定基至少95%-致的肽。
[0030] 術語"環5區"是指氨基酸序列，其通常位于OspC系統型A菌株Β31的殘基131 與159之間并且含有二級結構元件，包括α螺旋3、環5和α螺旋4的一部分。參見庫馬 蘭等人，2001。OspC系統型A菌株Β31的序列提供于SEQ ID NO:35和圖4中。
[0031] 如本文所使用的術語"治療有效量"意謂在投予時足以在受檢者中引起免疫反應 的微生物或亞單元抗原或多肽或多核苷酸分子和其組合的量。免疫反應可包含（但不限 于）細胞和/或體液免疫性的誘導。
[0032] 如本文所使用的術語"疫苗"和"疫苗組合物"意謂一種組合物，其預防或減少感 染，或其預防或減少感染的一種或一種以上病征或癥狀。針對病原體的疫苗組合物的保護 作用通常通過在受檢者中誘導免疫反應（細胞介導或體液免疫反應或兩者的組合）而實 現。一般來說，消除或減少感染發生、改善病征或癥狀，或加速從受感染的受檢者消除微生 物表示疫苗組合物的保護作用。
[0033] 在廣泛方面，本發明提供能夠誘導針對伯氏疏螺旋體的OspA和OspC蛋白質的抗 體的免疫原性組合物。因此，組合物將包括兩種蛋白質：包含OspA或其片段的第一蛋白質， 和包含OspC蛋白質或其片段的第二蛋白質。在一些實施例中，第二蛋白質是包含不同系統 型的OspC蛋白質的多個片段的嵌合蛋白質。
[0034] 在一些實施例中，第一蛋白質包含OspA蛋白質的片段（SEQ ID N0:2) (MGKQNVSSLD EKNSVSVDLPGEMNVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVF KEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTEIKSDGSGKAKEVLKSYVLEGTLTAETTLVV KEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEG SAVEITKLDEIKNALK)，其緊接病毒蛋白質（例如流感病毒NSl蛋白質的片段，其為SEQ ID N 0:3 (MDPNTVSSFQVDSFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEES DEALKMT))的下游。對第一蛋白質的一個重要要求是其能夠在已接種疫苗的動物中產生抗 OspA抗體。因此，無需OspA片段的全長序列，并且也無需與SEQ ID NO: 2100%-致。
[0035] 如本申請案中其它地方所指出，95%序列一致性可能足以提供合適的抗體產量。 不同氨基酸可以是保守性取代，和/或位于OspA片段的免疫顯性抗原決定基的外部。
[0036] 在其它實施例中，可以使用更短的OspA片段。本領域的普通技術人員將知道如何 確定哪些OspA片段含有能夠產生螺旋體酸抗體的免疫顯性抗原決定基。
[0037] 本發明人意外發現，包含（從N端到C端）流感病毒NS-I蛋白質的片段，接著移 除信號序列的OspA蛋白質的第一蛋白質尤其適用于本發明的免疫原性組合物。
[0038] 現有技術研究未說明OspC的何種系統型在狗中的侵襲性萊姆病中流行。已對人 類樣品進行大部分研究。瓊斯（Jones)等人報導在人類關節炎患者的關節液中發現的最流 行系統型是K和A，且典型地，并且發現系統型八、8、(：、0、!1、1(、1關節炎和風濕病仏1'讓1^18 Rheum) 200960 (7) 2174。伊恩哈特（Earnhart)等人在血液和/或CSF樣品中發現系統型A、 B、I、K、C、D、N。感染免疫學（Infect Immun. )200573(12) :7869。其它研究典型地將系統 型A、B、I和K與人類中萊姆病的侵襲性形式相關聯。
[0039] 但是，意外發現在狗中，最流行的系統型是OspC F，其此前在人類或狗中均不與萊 姆病的侵襲性形式相關。系統型N，其與人類中的侵襲性萊姆病相關，也與狗中的侵襲性萊 姆病相關。另外，本發明人發現系統型T和U，此前不與人類中的侵襲性萊姆病相關，可能引 起狗中的侵襲性萊姆病。
[0040] 根據一些實施例，第二蛋白質含有能夠產生針對不同OspC蛋白質系統型的免疫 反應的免疫顯性抗原決定基。更具體地說，本發明中所要求的免疫原性組合物的第二蛋白 質是嵌合蛋白質，其包含OspC系統型F和N的免疫顯性抗原決定基。免疫顯性抗原決定基 可呈如下文所論述的環和/或螺旋肽形式，或其可存在于目標OspC蛋白質的較大片段內。 這類片段的合適的非限制性實例是SEQ ID N0:32(NNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKITESN AVVLAVKEIETLLSSIDELATKAIGQKIDANGLGVQANQNGSLLAGAYAISTLITQKLSALNSEDLKEKVAKVKKCS EDFTNKLKNGNAQLGLAAATDDNAKAAILKTNGTNDKGAKELKDLSDSVESLVKAAQVMLTNSVKELTSPVVAESPK KP)，其是OspC系統型F蛋白質的片段。
[0041] 早先研究表明，包含OspC蛋白質的保守性區域（即在不同系統型中保守）對于小 鼠和人類而非狗中產生抗疏螺旋體抗體而言是重要的。參見洛夫里奇（Lovrich)等人，臨 床和疫苗免疫學（Clin, and Vaccine Immunol. )2007年5月，第635-637頁。但是，本發明 人意外發現添加一種OspC系統型（例如系統型F)的更長片段對表達水平有利并且因此可 使得更有效地產生第二蛋白質。
[0042] 布克斯（Buckles)等人證明OspC蛋白質的環5的表面曝露并且可以是產生螺旋 體酸抗體的合適目標。臨床疫苗免疫學（Clin Vaccine Immunol. )2006年10月；13(10): 1162-5。還參見W009135118。但是，考慮到已經描述OspC的至少21種系統型（塞諾斯特 (Seinost)等人，感染免疫學（Infect Immun.) 1999 年 7 月；67 (7) :3518-241999)，仍然需 要確定何種組合提供針對萊姆病的合適保護。
[0043] 因此，在一些實施例中，第二蛋白質包含來自不同系統型的OspC蛋白質的環5區 (環肽）和螺旋5區（螺旋5肽）的線性抗原決定基。當前考慮的系統型是T、U、E、A、B、 K、I、H、N、C、M、D和F。因此第二蛋白質可包含來自OspC的2-13個系統型（例如2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13個系統型）的環和螺旋肽。肽的順序并不重要。在一些實施例中， 環肽由螺旋肽間隔，且反之亦然。換句話說，環和螺旋肽是連續排列：在這類實施例中，第二 蛋白質中不應存在兩個環肽之間不存在螺旋肽的情況，并且兩個螺旋肽之間不應不存在環 肽。
[0044] 本領域的普通技術人員將知道如何確定來自不同OspC系統型的環區域和螺旋區 域的免疫顯性抗原決定基。舉例來說，來自受不同系統型的伯氏疏螺旋體感染的受檢者的 血清可以與來自相應系統型的環區域和螺旋區域的特異性肽反應，并且可以對血清中存在 的抗體與環肽和/或螺旋肽的結合進行定量（例如通過ELISA、免疫印跡等），由此提供關 于哪些肽含有來自既定OspC系統型的免疫顯性線性抗原決定基的線索。
[0045] 類似地，抗體的螺旋體酸活性可以通過本領域中眾所周知的方法測定，例如通常 通過將經過培養的伯氏疏螺旋體與來自用如上文所描述的免疫顯性線性抗原決定基攻擊 的受檢者的血清共同培育，并且對活的和死的疏螺旋體進行定量來進行。
[0046] 在一些實施例中，環肽和螺旋肽的序列如下：
[0047] 環肽I與SEQIDN0:4(AKLKGH^TDLGKEGVT)至少95%-致；
[0048] 螺旋肽I與SEQIDN0:5(KGADELEKLFESVKNLSKAAKEMLTNSVKE)至少95%-致 ；
[0049] 環肽H與SEQIDN0:6(SEKFAGKLKNEHASLGKKDAT)至少95%-致；
[0050] 螺旋肽H與SEQIDN0:7(KGAKELKDLSDSVESLVKA)至少95%-致；
[0051] 環肽 N 與 SEQ ID NO: 8 (SDDFTKKLQSSHAQLGVAGGATT)至少 95 % -致；
[0052] 螺旋肽N與SEQIDN0:9(ADELEKLFKSVESLAKAAQDALANSVNELTS)至少95%-致 ；
[0053] 環肽C與SEQIDN0:10(KKLKEKHTDLGKKDAT)至少95%-致；
[0054] 螺旋肽C與SEQIDN0:11(AAELEKLFESVENLAKAAKEMLSNS)至少95%-致 ；
[0055] 環肽M與SEQIDN0:12(NKAFTDKLKSSHAELGIANGAAT)至少95%-致 ；
[0056] 螺旋肽M與SEQIDN0:13(KGAQELEKLFESVKNLSKAAQETLNNSVKE)至少95%-致 ；
[0057] 環肽D與SEQIDN0:14(SESFTKKLSDNQAELGIENAT)至少95%-致；
[0058] 螺旋肽 D 與 SEQ ID NO: 15 (KGAEELVKLSESVAGLLKAAQAILANSVKELTSPVVAESPKKP)至 少95 %-致；
[0059] 環肽F與SEQIDN0:16(SEDFTNKLKNGNAQLGLAAAT)至少95%-致；
[0060] 螺旋肽F與SEQIDN0:17(KGAKELKDLSDSVESLVKAAQVMLTNS)至少95%-致 ；
[0061] 環肽T與SEQIDN0:18(STGFTNKLKSGHAELGPVGGNAT)至少95%-致 ；
[0062] 螺旋肽T與SEQIDN0:19(KGAKELKDLSESVEALAKAAQAMLTNS)至少95%-致 ；
[0063] 環肽U與SEQIDN0:20(SEKFTKKLSESHADIGIQAAT)至少95%-致；
[0064] 螺旋肽U與SEQIDN0:21(KGAEELDKLFKAVENLSK)至少95%-致；
[0065] 環肽E與SEQIDN0:22(STEFTNKLKSEHAVLGLDNLT)至少95%-致；
[0066] 螺旋肽 E 與 SEQ ID N0:23(KGAAELEKLKAVENLSKAAQDTLKNAVKELTSPIVAE SPKKP)至 少95 %-致；
[0067] 環肽A與SEQIDN0:24(SETFTNKLKEKHTDLGKEGVT)至少95%-致；
[0068] 螺旋肽A與SEQIDN0:25(KGAEELGKLFESVEVLSKAAKEMLANSVKELTS)至少95% - 致；
[0069] 環肽B與SEQIDN0:26(SEEFSTKLKDNHAQLGIQGVT)至少95%-致；
[0070] 螺旋肽與SEQIDN0:27(KGVEELEKLSGSLESLS)至少95%-致；
[0071] 環肽K與SEQIDN0:28(SEDFTKKLEGEHAQLGIENVT)至少95%-致；和
[0072] 螺旋肽K與SEQIDN0:29(AAELEKLFKAVENLAKAAKEM)至少95%-致。
[0073] 在一些實施例中，來自相同系統型的環和螺旋肽安置在一起，即彼此相鄰。舉例來 說，來自OspC系統型A的環肽和來自OspC系統型A的螺旋肽不應由來自任何其它OspC系 統型的環或螺旋肽分開。
[0074] 另外，盡管在一些實施例中，來自相同OspC系統型的環和螺旋肽彼此緊鄰，但在 其它實施例中，環肽和螺旋肽可由不影響最終蛋白質結構的連接子序列分開。氨基酸特性 和其對蛋白質結構的作用在本領域中眾所周知并且所屬領域的一般技術人員將能夠識別 何種氨基酸適用于連接子。
[0075] 如實例中說明，本發明人意外發現F和N是與狗中的萊姆病相關的最流行的OspC 系統型。本發明人還發現存在來自系統型I、Η、N、C、M、D和F的環和螺旋肽可以在狗中 提供極良好的針對萊姆病的保護水平。盡管來自不同系統型的環和螺旋肽的順序不重要， 但在一些實施例中，第二蛋白質包含（按N到C定向）I-構建體、H-構建體、N-構建體、 C-構建體、M-構建體、D-構建體，接著是與OspC系統型F蛋白質的片段至少95%-致的 氨基酸序列（例如SEQ ID N0:32)。因此，在一些實施例中，第二蛋白質將包含與SEQ ID 勵:31仏120?)至少95%(例如96%、97%、98%、99%并且優選是100%)-致的氨基酸序 列。
[0076] 在其它實施例中，來自系統型F、T、U、E、A、B、K的環和螺旋肽包括于第二蛋白質 內。在一些實施例中，第二蛋白質因此將包含以下（按N到C定向）：T-構建體、U-構建 體、E-構建體、A-構建體、B-構建體、K-構建體、I-構建體、H-構建體、N-構建體、C-構建 體、M-構建體和D-構建體。第二蛋白質還可以任選地包含F-構建體，其在一些實施例中， 是T-構建體的上游?；蛘呋蛄硗猓诙鞍踪|可含有與OspC系統型F蛋白質的片段至少 95% (例如 96%、97%、98%、99% ) -致的氨基酸序列（SEQ ID NO:32)。
[0077] 第二蛋白質的其它合適實例以及其制造和使用方法提供于申請案PCT/ US2011/056854(2011年10月19日提交，發明人R.馬可尼（R. Marconi)和C.伊恩哈特 (C. Earnhart))中。
[0078] 在某些實施例中，免疫原性組合物將包含SEQ ID NO: 1 ;和SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31中的任一者。
[0079] 本文中所描述的序列可由在本領域中眾所周知的方法制造。多肽可使用固 相技術通過直接肽合成產生（參見例如斯圖爾特（Stewart)等人（1969)固相肽合 成（Solid-Phase Peptide Synthesis),舊金山 WH 弗里曼公司（WH Freeman Co, San Francisco);梅里菲爾德 J. (Merrifield J. )(1963)美國化學會志（J Am Chem Soc)85: 2149-2154)。肽合成可使用手動技術或通過自動化進行。自動合成可（例如）使用應用生 物系統公司 431A膚合成器（Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer)(拍金埃爾 默（Perkin Elmer)，加利福尼亞州福斯特市（Foster City, Calif))根據制造商提供的說明 實現。舉例來說，子序列可以化學方式單獨合成并且使用化學方法組合，從而提供全長多肽 或其片段?；蛘撸@類序列可以從許多專門生產多肽的公司訂購。最通?？梢酝ㄟ^表達編 碼核酸和回收多肽來產生多肽，如下文所描述。
[0080] 舉例來說，在實施例中，當環肽和螺旋肽與目標系統型的OspC蛋白質的片段 100 %-致時，這類環和螺旋肽的核酸序列也已知或易于從公開可用的數據庫（例如 Genbank)獲得。如果所選環/螺旋肽與天然存在的OspC蛋白質的片段略微不同，那么可容 易地使用眾所周知的基因碼來設計編碼核酸序列。
[0081] 多種生物體呈現偏愛使用具體密碼子對生長肽鏈中具體氨基酸的插入進行編碼。 密碼子偏好或密碼子偏愛，在生物體之間的密碼子使用方面不同，在多種生物體中得到充 分證實。密碼子偏愛通常與信使RNA (mRNA)的翻譯效率相關，而又相信翻譯效率尤其取決 于所翻譯的密碼子的特性和具體轉移RNA(tRNA)分子的可用性。細胞中所選tRNA的主導 地位通常反映肽合成中最常使用的密碼子。因此，因為大部分氨基酸是由多個密碼子編碼 (甲硫氨酸例外），所以可以基于密碼子優化針對既定生物體中的最佳基因表達對核酸序 列進行定制。
[0082] 還包括產生重組型多肽的方法。一種這類方法包含將如上文所描述的任何核酸引 入細胞群體中，這些核酸可操作地連接到可有效產生經編碼多肽的調節序列，在培養基中 培養宿主細胞（例如酵母、昆蟲、哺乳動物細胞、植物細胞等）以便表達多肽，以及從細胞或 從培養基分離多肽。通過如本領域中已知的任何傳遞方法將核酸引入這類細胞，包括例如 轉型、轉染、注射、基因槍、被動吸收等。如所屬領域的技術人員將認識到，核酸可以是載體 的一部分，如重組性表達載體，包括DNA質粒載體或所屬領域中已知的任何載體。
[0083] 或者，可以使用基于無細胞原核生物或真核生物的表達系統。
[0084] 在一些實施例中，編碼第一和/或第二蛋白質的核酸序列可更包含編碼多肽的序 列（"融合搭配物"），其與第一和/或第二蛋白質融合，從而促進融合蛋白質的純化。在 本發明的這一方面的某些實施例中，融合搭配物是六組氨酸肽（SEQ ID NO: 47, HHHHHH)，如 PQE載體（凱杰公司（Qiagen, Inc.))中所提供，和杰恩斯（Gentz)等人，美國國家科學院院 刊（Proc Natl Acad Sci USA)86 :821-824(1989)中所描述，或其可為HA標記，其對應于來 源于流感紅血球凝集素蛋白質的抗原決定基（威爾遜，I (Wilson，I)等人，細胞（Cell) 37 : 767,1984)。多核苷酸還可以含有非編碼5'和3'序列，如轉錄、非翻譯序列；剪接和聚腺苷 酸化信號；核糖體結合位點和使mRNA穩定的序列。
[0085] 本文中所描述的免疫原性組合物特別適用于預防狗中的萊姆病或降低其癥狀的 嚴重性。因此，在另一方面，本發明提供一種疫苗，其包含根據上述實施例中任一項的免疫 原性組合物和合適的佐劑。
[0086] 本發明的免疫原性組合物中的第一和第二蛋白質應以免疫有效量（即足以引起 狗中免疫反應的量）存在。在一些實施例中，第一蛋白質的濃度介于1微克/毫升與100微 克/毫升之間（例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90微克/毫升），并且第二蛋白質的濃 度介于1微克/毫升與200微克/毫升之間（例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190微克/毫升）。在一些實施例中，第一蛋白質的量 介于約10微克/毫升與50微克/毫升之間并且第二蛋白質的量介于20微克/毫升與100 微克/暈升之間。
[0087] 適合根據本發明使用的佐劑包括（但不限于）若干佐劑類型，如：礦物質鹽，例 如礬、氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠（例如Rehydragel?)、磷酸鋁和磷酸鈣；表面活性劑和 微米粒子，例如非離子性嵌段聚合物表面活性劑、膽固醇、病毒顆粒、皂苷（例如Quil A、 QS-21和GPI-0100)、蛋白體、免疫刺激復合物、蝸牛狀體、季胺（雙十八烷基二甲基溴化銨 (DDA))、吡啶、維生素 A、維生素 E;細菌產物，如RIBI佐劑系統（瑞碧公司（Ribi Inc.))、 草分枝桿菌（Mycobacterum phlei)的細胞壁骨架（Detox? )、胞壁?；模∕DP)和三 肽（MTP)、單磷酰基脂質A、卡介苗（Bacillus Calmete-Guerin)、熱不穩定的大腸桿菌腸毒 素、霍亂毒素、海藻糖二霉菌酸酯、CpG寡脫氧核苷酸；細胞因子和激素，例如白介素（IL-1、 IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子、脫氫表雄酮、1，25-二 羥基維生素 D3;多聚陰離子，例如葡聚糖；聚丙烯酸（例如，聚甲基丙烯酸甲酯、卡巴浦爾 (Carb〇p 〇l)934P);載體，例如破傷風類毒素、白喉類毒素、霍亂毒素 B亞單位、腸毒性大 腸桿菌的突變型熱不穩定腸毒素（rmLT)、熱休克蛋白；水包油乳液,例如AMPHIGEN? (美國海德尼克斯公司（Hydr〇nics，USA));和油包水乳液，例如弗式完全和不完全佐劑 (Freund's complete and incomplete adjuvant)。在其它實施例中，還可以使用 SP 油。 如本文所用，術語"SP油"表示油乳液，其包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鯊烷、聚 氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯和緩沖鹽溶液。通常，SP油乳液將包含約1%到3% (體積/ 體積）嵌段共聚物、約2%到6% (體積/體積）角鯊燒，更具體地說，約3%到6%角鯊烷 和約0. 1%到0. 5% (體積/體積）聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，其余為緩沖鹽溶液。
[0088] 本文中所描述的疫苗可以是組合疫苗，其包括上述免疫原性組合物，與至少一種 來自其它犬病原體的抗原組合，能夠誘導狗中針對由這類其它病原體引起的疾病的保護性 免疫反應。
[0089] 這類其它病原體包括（但不限于）犬瘟熱（⑶）病毒、犬腺病毒2型（CAV-2)、犬副 流感（CPI)病毒、犬小病毒（CPV)、犬冠狀病毒（CCV)、犬皰疹病毒以及狂犬病病毒。用于本 發明的疫苗組合物的來自這些病原體的抗原可呈經修飾的活病毒制劑、非活性病毒制劑或 亞單元蛋白質制劑形式。在其它實施例中，也可以使用重組型CDV(犬瘟熱病毒）。對這些 病毒的毒性病毒株進行減毒的方法和制備非活性病毒制劑的方法是所屬領域中已知的，并 且描述于例如美國專利第4, 567, 042號和第4, 567, 043號中。
[0090] 其它病原體還包括巴達維亞鉤端螺旋體、雙曲鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺 旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體、波蒙那鉤端螺旋體、哈博維斯鉤端螺旋體、嚇啉單胞菌屬、 擬桿菌屬、利什曼原蟲屬、艾利希體屬、霉楽菌屬、邊蟲屬（Anaplasma spp.)和犬小孢子 菌。使用本領域中眾所周知的方法，用于本發明的疫苗組合物的來自這些病原體的抗原 可呈非活性完全或部分細胞制劑形式。舉例來說，制備非活性完全或部分鉤端螺旋體細 胞制劑的方法是所屬領域中已知的并且描述于例如以下文獻中：顏（Yan)，K-T，"針對博 氏鉤端螺旋體哈爾喬型血清變型的免疫性方面（Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo) "，博士論文，附錄I，1996,農業與食品科學學院 (Faculty of Agriculture and Food Science)，貝爾法斯特女王大學（The Queen's University of Belfast);麥金托什（Mackintosh)等人，"哈爾喬-波蒙那型疫苗在暴露于 用問號狀鉤端螺旋體哈爾喬型血清變型進行的自然攻擊的牛中預防鉤端螺旋體尿的用途 (The use of a hardjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospia interrogans serovarhardjo)，',新西蘭獸醫學 雜志（New Zealand Vet. J. )28 :174-177,1980;博林（Bolin)等人，"五價萊氏疫苗的疫 苗接種對鉤端螺旋體哈爾喬型血清變型懷孕期牛的哈爾喬型牛感染的作用（Effect of vaccination with a pentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle)，'，美國獸醫學石開究 雜志（Am. J. Vet. Res.) 50 :161_165,1989。
[0091] 根據本發明，可向至少6周齡，或至少7周齡，或至少8或9周齡的狗投予疫苗。投 予可通過任何已知途徑進行，包括經口、鼻內、經表面粘膜、經皮和腸胃外（例如靜脈內、腹 膜內、皮內、皮下或肌內）。投予還可以使用無針型遞送裝置實現。投予還可以使用途徑組 合實現，例如首先使用途徑投予，并且接著使用經粘膜途徑投予。在一些實施例中， 投予途徑包括皮下和肌內投予。
[0092] 本說明書中引用的所有公開案（專利公開案和非專利公開案兩者）表示本發明所 屬領域的技術人員的技能水平。所有這些公開案在本文中均以全文引用的方式并入，其程 度如同每一篇個別公開案具體且單獨地說明為以引用方式并入。
[0093] 為了更清楚地理解本發明，下文闡述以下實例。這些實例僅為說明性，并且不理解 為以任何方式限制本發明的范圍或基本原理。實際上，除本文中所顯示和描述的以外，所屬 領域的技術人員將由下文中闡述的實例和前述說明變得顯而易知本發明的各種修改。這類 修改也意欲屬于所附權利要求書的范圍內。
[0094] 實例
[0095] 實例1.確定與狗中的萊姆病相關的伯氏疏螺旋體OspC系統型
[0096] 通過標記在南方羅得島州（Rhode Island)收集成年肩突硬蝶（Ixodes scapularis tick)。使用標準方法和標記的抗伯氏疏螺旋體抗體，通過直接突光顯微法測 定感染伯氏疏螺旋體的蜱蟲百分比。
[0097] 所有程序均按照動物福利法（Animal Welfare Act)的法規進行并且根據農場犬 飼養標準操作程序（Farm Canine Husbandry Standard Operating Procedures)供養狗。 指定兩種性別的15只目的繁殖的狗（7只雄性，8只雌性；9到10周齡；馬歇爾生物資源公 司（Marshall Bioresources))的識別編號并且分成四個研究組，表示為TOl (n = 4)、Τ02 (η =4)、Τ03 (η = 4)和 Τ04 (η = 3)。狗配備有伊麗莎白領（Elizabethan collars)并且在 一個挨著一個的公寓式籠子中圈養。在蜱蟲感染的前一天，從每一只狗收集血清。使用置 放于中胸（midthorax)每一邊的固定的感染室，分別用0、25、50或75只成年肩突硬蜱感 染研究組T01、T02、T03和T04中的狗。將蜱蟲供養到飽滿，移除并且在第49天和第90天 (相對于開始感染）收集血清樣品和皮膚活檢體。通過SNAP 4DX測試（IDEXX)評估血清 轉化。為了培養螺旋菌，將每一份皮膚活檢體的一部分置放于BSK-H培養基（6 %兔血清； 37EC，5% CO2)中。如先前描述，通過次表面涂布從培養物獲得克隆群體。從板切除集落并 且置放于BSK-H培養基中進行培養。
[0098] 使用凱杰DNeasy試劑盒（Qiagen DNeasy Kit)，根據供應商說明從皮膚活檢體提 取DNA。另外，如先前描述，從伯氏疏螺旋體的克隆群體的培養物提取DNA。使用從組織（100 納克）提取的DNA和從沸騰的伯氏疏螺旋體細胞溶解物（I: 1上清液；GoTaq聚合酶）獲得 的DNA對ospC基因進行PCR擴增。所有PCR均使用標準條件進行。通過瓊脂糖凝膠電泳 和溴化乙錠染色來評估每一反應物的一部分。從凝膠（凱杰凝膠提取試劑盒（Qiagen Gel Extraction Kit);凱杰公司（QIAGEN))移除其余的PCR產物并且用pET46Kk/LIC載體（諾 杰公司（Novagen))粘接。質粒在大腸桿菌NovaBlue細胞（諾杰公司）中繁殖。通過PCR 篩檢集落的ospC基因。通過使每一份ospC陽性大腸桿菌集落的一部分沸騰來產生PCR的 模板。也將部分集落接種到LB培養基（2毫升）中，生長過夜，通過離心收集并且使用凱杰 MiniPrep試劑盒（凱杰公司）提取質粒。用于PCR的引物如下（5'到3'）：
[0099] OspC-Fl
[0100] GACGACGACAAGATTGAATACATTAAGTGCAATATTAATGAC(SEQ ID NO:33)
[0101] OspC-Rl
[0102] GAGGAGAAGCCCGGTTTACAAATTAATCTTATAATATTGATCTTAATTAAGG(SEQ ID NO:34)
[0103] 通過Eurofins MWG Operon進行DNA定序。使用ClustalX 2. 0· 10軟件，通過默認 配置和Gonnet矩陣在多序列對準模式下產生相鄰接合樹，并且使用N-J Plot (2. 2版）進 行觀測。
[0104] 結果
[0105] 從羅德島州收集的蜱蟲中伯氏疏螺旋體發病率的分析.使用直接熒光顯微法，測 定約50%的從南方羅德島州現場收集的肩突硬蜱感染伯氏疏螺旋體。這與這一區域中早先 報導的蜱蟲感染率一致。
[0106] 通過蜱蟲感染發生的狗中的伯氏疏螺旋體感染.在這一研究開始時，使用SNAP 4DX分析法（IDEXX)，通過免疫印跡分析和通過使用伯氏疏螺旋體，確認所有狗為血清陰 性。為了用伯氏疏螺旋體通過自然傳播途徑感染狗，在狗身體上供養現場收集的蜱蟲。因 為蜱蟲中的感染率為約50%，將增加數目的蜱蟲（0、25、50或75)置放于狗身體上。在蜱蟲 感染之后第49天收集血清樣品并且評估免疫狀況。在受蜱蟲感染的狗中，11只狗中的10 只對伯氏疏螺旋體呈血清陽性。所有陰性對照狗（未受蜱蟲感染）均為血清陰性。從每只 狗收集的皮膚活檢體提取總DNA并且用ospC和f IaB引物集，通過PCR針對伯氏疏螺旋體 進行測試。所有血清陽性狗產生預計尺寸的ospC和f IaB擴增子。所有血清陰性狗對兩種 基因均呈PCR陰性。
[0107] 受感染的狗組織中發現的菌株中Ospc多樣性的分析.為了測定留存在暴露于蜱 蟲的狗皮膚中的菌株的OspC基因型，由從皮膚活檢體提取的DNA對OspC進行PCR擴增。將 所得擴增子克隆到pET46Ek/LIC中并且在大腸桿菌中繁殖質粒。接著從不少于5個獨立的 大腸桿菌集落分離質粒并且測定ospC序列。序列對準和樹狀圖建構（圖1)表明在10只 狗中的6只中，產生若干不同ospC類型的菌株的持久性（表1)。因為使用多個蜱蟲感染每 只狗，所以這一觀察結果并不出人意料。鑒別OspC類型A、B、F、I和N，其中類型F和N是 最流行的（分別為10只狗中的5只和10只狗中的7只）。
[0108] 為了進一步定義受感染的狗中存在的OspC基因型的范圍，涂布來自皮膚活檢體 的培養物以產生克隆群體。通過這一方法，可以鑒別未由活檢體樣品的PCR檢測到的表達 ospC類型的菌株。接著通過PCR針對ospC測試個別伯氏疏螺旋體集落（圖2)。在6只狗 中的3只中鑒別到其它ospC類型。早先未曾鑒別兩種所鑒別的OspC類型，其均來源于同 一只狗。這些系統型表示為DRI85a和DRI85e。由這一方法鑒別的其它ospC類型包括類型 E、F、H、I、N、U和T (表1)。總起來說，在這些分析中，總共檢測到11種不同的OspC類型。
[0109] 表1.每個組和每只個別狗中來自定序活檢體和克隆分離物的OspC類型.

【權利要求】
1. 一種免疫原性組合物，其包含： A) 第一蛋白質，其包含與SEQIDNO: 1至少95%-致的氨基酸序列；和 B) 第二蛋白質，其包含OspC系統型F和N的免疫顯性抗原決定基。
2. 根據權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述第一蛋白質包含SEQIDNO: 1。
3. 根據權利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中所述第二蛋白質包含： i) 與來自OspC系統型I、H、C、M和D的環5區（環肽）和a螺旋5區（螺旋肽）的 免疫顯性抗原決定基至少95 % -致的多個肽；和 ii) 以下各者中的至少一者： a) 彼此相鄰的OspC系統型F的環肽和OspC系統型F的螺旋肽，或 b) 與SEQIDN0:3295%-致的氨基酸序列。
4. 根據權利要求1和2中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中： 環肽I是SEQIDN0:4 ; 螺旋肽I是SEQIDNO:5 ; 環肽H是SEQIDNO:6 ; 螺旋肽H是SEQIDNO: 7 ; 環肽N是SEQIDNO:8 ; 螺旋肽N是SEQIDNO:9 ; 環肽C是SEQIDNO: 10 ; 螺旋肽C是SEQIDNO: 11 ; 環肽M是SEQIDNO: 12 ; 螺旋肽M是SEQIDNO: 13 ; 環肽D是SEQIDNO: 14 ; 螺旋肽D是SEQIDNO: 15。
5. 根據權利要求1到3中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中所述第二蛋白質 在所述第二蛋白質的羧基端包含與SEQIDN0:3295%-致的氨基酸序列。
6. 根據權利要求1到5中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中按N到C定向，所 述第二蛋白質包含I-構建體、H-構建體、N-構建體、C-構建體、M-構建體、D-構建體。
7. 根據權利要求1到6中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中所述第二蛋白質 更包含與來自OspC系統型T、U、E的環5區（環肽）和a螺旋5區（螺旋肽）的免疫顯性 抗原決定基95% -致的多個肽。
8. 根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中按N到C定向，所述第二蛋白質包含 T-構建體、U-構建體、E-構建體。
9. 根據權利要求7或8所述的免疫原性組合物，其中 環肽T是SEQIDN0:18 ; 螺旋肽T是SEQIDNO: 19 ; 環肽U是SEQIDNO: 20 ; 螺旋肽U是SEQIDNO: 21 ; 環肽E是SEQIDNO: 22 ; 螺旋肽E是SEQIDNO: 23。
10. 根據權利要求1到9中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中所述第二蛋白質 更包含與來自OspC系統型A、B、K的環5區（環肽）和a螺旋5區（螺旋肽）的免疫顯性 抗原決定基95% -致的多個肽。
11. 根據權利要求10所述的免疫原性組合物，其中按N到C定向，所述第二蛋白質包含 A-構建體、B-構建體、K-構建體。
12. 根據權利要求11所述的免疫原性組合物，其中 環肽A是SEQIDN0:24 ; 螺旋肽A是SEQIDN0:25 ; 環肽B是SEQIDNO: 26 ; 螺旋肽B是SEQIDNO: 27 ; 環肽K是SEQIDNO: 28 ; 螺旋肽K是SEQIDNO: 29。
13. 根據權利要求10到12中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中按N到C定 向，所述第二蛋白質包含T-構建體、U-構建體、E-構建體、A-構建體、B-構建體、K-構建 體。
14. 根據權利要求13所述的免疫原性組合物，其中按N到C定向，所述第二蛋白質包含 T-構建體、U-構建體、E-構建體、A-構建體、B-構建體、K-構建體、I-構建體、H-構建體、 N-構建體、C-構建體、M-構建體、D-構建體。
15. 根據權利要求12所述的免疫原性組合物，其中所述F-構建體是所述T-構建體的 上游，并且其中所述與SEQIDNO: 3295%-致的氨基酸序列是所述D-構建體的下游。
16. 根據權利要求15所述的免疫原性組合物，其中 環肽F是SEQIDN0:16 ; 螺旋肽F是SEQIDNO: 17。
17. 根據權利要求1到16中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中來自每一系統 型的所述環肽和所述螺旋肽彼此相鄰。
18. 根據權利要求1到17中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中每一系統型的 所述環肽和所述螺旋肽是連續排列的。
19. 根據權利要求1到18中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中每一系統型的 所述環肽是所述系統型的相應螺旋肽的上游。
20. 根據權利要求1到19中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中 a. 所述第一蛋白質是SEQIDN0:1 ;且 b. 所述第二蛋白質是SEQIDNO:30。
21. 根據權利要求1到19中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其中 a. 所述第一蛋白質是SEQIDN0:1 ;且 b. 所述第二蛋白質是SEQIDN0:31。
22. 根據權利要求1到21中任一權利要求所述的免疫原性組合物，其更包含至少一種 額外抗原，所述至少一種額外抗原可預防或降低可在狗中引起疾病的微生物感染的病理學 作用。
23. 根據權利要求22所述的免疫原性組合物，其中所述微生物選自由以下組成的群 組：犬瘟熱（CD)病毒、犬腺病毒2型（CAV-2)、犬副流感（CPI)病毒、犬小病毒（CPV)、犬冠 狀病毒（CCV)、犬皰疫病毒和狂犬病病毒。
24. -種疫苗組合物，其包含根據權利要求1到23中任一權利要求所述的免疫原性組 合物和佐劑。
25. 根據權利要求24所述的疫苗組合物，其中所述佐劑選自由以下組成的群組：礦物 質鹽、表面活性劑和微米粒子、細菌產物、細胞因子和激素、載劑、水包油乳液和油包水乳 液。
26. -種預防或降低犬中伯氏疏螺旋體（Borreliaburgdorferi)感染的病理學作用 的方法，其包含投予所述對其有需要的犬免疫有效劑量的根據權利要求24和25中任一權 利要求所述的疫苗組合物。
【文檔編號】A61K39/00GK104379164SQ201380030342
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月18日 優先權日:2012年4月18日
【發明者】R.M.洛瑟, P.F.M.繆斯, J.J.米勒希普, Z.許, R.T.馬科尼, C.厄恩哈特 申請人:佐蒂斯有限責任公司, 弗吉尼亞大學