金黃色葡萄球菌以及將其滅活得到的奶牛乳房炎疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明公開了金黃色葡萄球菌以及將其滅活得到的奶牛乳房炎疫苗。本發明保護一種奶牛乳房炎疫苗，其活性成分為滅活后的菌株SACP5-9、滅活后的菌株SACP8-6和滅活后的菌株SACP336-3。本發明還保護一種奶牛乳房炎疫苗，其活性成分為滅活后的菌株和莢膜多糖；滅活后的菌株為滅活后的菌株SACP5-9、滅活后的菌株SACP8-6和滅活后的菌株SACP336-3；莢膜多糖為菌株SACP5-9的莢膜多糖、菌株SACP8-6的莢膜多糖和菌株SACP336-3的莢膜多糖。本發明提供的疫苗具有高效、通用、安全、穩定、劑型多樣等優點，本發明為安全、高效、全面有效預防金黃色葡萄球菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保證，將是奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎疫苗發展的新里程碑。
【專利說明】金黃色葡萄球菌以及將其滅活得到的奶牛乳房炎疫苗
【技術領域】
[0001]本發明涉及金黃色葡萄球菌以及將其滅活得到的奶牛乳房炎疫苗。
【背景技術】
[0002]奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧業發展、食品安全的重大傳染病,特別是近年來，隨著環境的改變、抗生素的濫用，產生了多種耐藥菌甚至出現了超級細菌，由細菌感染引發的奶牛乳房炎發病率和死亡率逐年攀升，嚴重危害了畜牧業發展和食品安全，進而危害了人類健康。因奶牛乳房炎造成的經濟損失，美國每年達30億美元、英國4億美元，我國35億元以上。奶牛乳房炎分為臨床型和隱性型。臨床型的癥狀為:乳區發熱、腫痛，泌乳量減少，乳汁性狀發生改變，細菌數增多、體細胞增加，重者并發多器官衰竭甚至死亡。隱性型沒有特異的臨床表現，通過體細胞、產奶量及質量檢測才能檢出，但奶牛罹患率比臨床型高得多，造成病原微生物的進一步播散，在一定條件下會轉化成臨床型，實際損失比臨床型聞得多。
[0003]引發奶牛乳房炎的病原菌均達140余種。據臨床流行病學資料顯示，我國奶牛乳房炎的病原菌以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌為主，占細菌感染的91.4%，其中金黃色葡萄球菌占46%，且以5型金黃色葡萄球菌(又稱金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型5型)、8型金黃色葡萄球菌(又稱金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型8型)和336型金黃色葡萄球菌(又稱金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型336型)為主(三者占金黃色葡萄球菌感染的95%以上)，與當前國際報道感染菌種、血清型及流行趨勢一致。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供金黃色葡萄球菌以及將其滅活得到的奶牛乳房炎疫苗。
[0005]本發明保護菌株SACP5-9、菌株SACP8-6和菌株SACP336-3在制備奶牛乳房炎疫苗中的應用。所述奶牛乳房炎可為金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎。所述金黃色葡萄球菌可為5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌或336型金黃色葡萄球菌。所述金黃色葡萄球菌具體可為菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336_3、5型金黃色葡萄球菌ATCC4952U8型金黃色葡萄球菌ATCC49525、336型金黃色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株。
[0006]本發明還保護一種奶牛乳房炎疫苗，其活性成分為滅活后的菌株SACP5-9、滅活后的菌株SACP8-6和滅活后的菌株SACP336-3。具體來說，所述疫苗中，所述滅活后的菌株SACP5-9、所述滅活后的菌株SACP8-6和所述滅活后的菌株SACP336-3的濃度均為IX 101°個細菌/mL。所述疫苗還可包括佐劑。所述佐劑為SPOl佐劑、鋁佐劑或白花油佐劑。所述疫苗的劑型為乳頭管注射劑型、皮下注射劑型或肌肉注射劑型。所述奶牛乳房炎可為金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎。所述金黃色葡萄球菌可為5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌或336型金黃色葡萄球菌。所述金黃色葡萄球菌具體可為菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、5型金黃色葡萄球菌ATCC49521、8型金黃色葡萄球菌ATCC49525、336型金黃色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株。
[0007]本發明還保護一種奶牛乳房炎疫苗，其活性成分為滅活后的菌株和莢膜多糖；所述滅活后的菌株為滅活后的菌株SACP5-9、滅活后的菌株SACP8-6和滅活后的菌株SACP336-3 ;所述莢膜多糖為所述菌株SACP5-9的莢膜多糖、所述菌株SACP8-6的莢膜多糖和所述菌株SACP336-3的莢膜多糖。具體來說，所述疫苗中，所述滅活后的菌株SACP5-9、所述滅活后的菌株SACP8-6和所述滅活后的菌株SACP336-3的濃度均為I X 101°個細菌/mL，所述菌株SACP5-9的莢膜多糖、所述菌株SACP8-6的莢膜多糖和所述菌株SACP336-3的莢膜多糖的濃度均為40iig/ml。所述疫苗還可包括佐劑。所述佐劑為SPOl佐劑、鋁佐劑或白花油佐劑。所述奶牛乳房炎可為金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎。所述疫苗的劑型為乳頭管注射劑型、皮下注射劑型或肌肉注射劑型。所述金黃色葡萄球菌可為5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌或336型金黃色葡萄球菌。所述金黃色葡萄球菌具體可為菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336_3、5型金黃色葡萄球菌ATCC49521、8型金黃色葡萄球菌ATCC49525、336型金黃色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株。
[0008]所述“滅活后的菌株”可通過將所述菌株進行甲醛滅活得到。所述“滅活后的菌株”具體通過如下方法得到:取菌株，用PBS緩沖液重懸，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛濃度為0.4%(體積比)，37°C、150rpm振蕩孵育36_48h，離心(離心參數具體可為:5000r/min, 20min)收集菌體，用滅菌后的PBS緩沖液洗滌菌體，然后用滅菌后的PBS緩沖液懸浮菌體，得到“滅活后的菌株”(含I X IOltl個細菌/mL)。
[0009]所述莢膜多糖的制備方法具體如下:
[0010](I)取菌株，接種于BHI培養基，37°C、150rpm振蕩培養18h。
[0011](2)取步驟(1)得到的菌液`，接種至BHI培養基，在發酵罐中37°C發酵(發酵初始時刻，菌株的菌濃度為2X IO8個/m`l，發酵罐溫度為37°C，發酵罐的初始轉速為198r/min，罐壓保持在0.05MPa,用8%Na0H水溶液或5%鹽酸水溶液調節發酵體系的pH為7.0-7.2，通過增加發酵罐轉速和/或增加通氣量維持發酵體系的溶氧量為25-35%，發酵體系的溶氧量高于35%時停止發酵)；
[0012](3)取步驟(2)得到的發酵體系，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛濃度為0.4% (體積比)，25°C、150rpm振蕩孵育24h，然后4°C、3000rpm離心15min，收集上清液；
[0013](4)取步驟(3)得到的上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨并使其濃度為lg/100ml，室溫、120rpm振蕩孵育I小時，然后4°C靜置16小時，然后1000Orpm離心30min，
收集沉淀(復合多糖)；
[0014](5)取步驟(4)得到的沉淀，溶于2M氯化鈣水溶液(沉淀與氯化鈣水溶液的配比為
0.2-0.5g:ml),研磨,然后加入與2M氯化|丐水溶液等體積的水,室溫、120rpm振蕩孵育Ih,然后加入乙醇并使其濃度為25%(體積比)，41:靜置3h，然后4°C、5000rpm離心30min，收集
上清液；
[0015](6)取步驟(5)得到的上清液，加入乙醇并使其濃度為80%(體積比)，4°C靜置3h，然后4°C、1000Orpm離心15min，收集沉淀，依次用乙醇和丙酮洗滌，干燥，得到干物質(粗糖)；
[0016](7)取步驟(6)得到的干物質，溶于10g/100mL乙酸鈉水溶液(干物質與乙酸鈉水溶液的配比為10-20mg:ml)，加入2倍于乙酸鈉水溶液體積的酚溶液(100g結晶酚溶于 40mlIOg/IOOmL 乙酸鈉水溶液)，4 °C、120rpm 振蕩 20_30min，然后 4 °C、lOOOOrpm、離心20min,取最上層液相；
[0017](8)取步驟(7)得到的液相，加入2倍體積的酚溶液(100g結晶酚溶于40mll0g/100mL 乙酸鈉水溶液)，4 °C、120rpm 振蕩 20_30min,然后 4 °C、lOOOOrpm、離心20min,取最上層液相；
[0018](9)取步驟(8)得到的液相，在0.1M氯化鈣水溶液中透析；
[0019](10)取步驟(9)得到的溶液，加入乙醇并使其濃度為75% (體積比)，4°C靜置3h，然后4°C、lOOOOrpm離心20min，收集沉淀，依次用乙醇和丙酮洗滌，干燥，得到干物質(莢膜
多糖)。
[0020]所述SPOl佐劑具體如下:溶劑為水,含2g/100mL角g烯、0.lg/100mL聚氧乙烯蓖麻油和0.1g/1OOmL聚醚多元醇。
[0021 ] 所述鋁佐劑具體可為氫氧化鋁。
[0022]所述疫苗具體可為實施例3中制備的疫苗-1、疫苗-11、疫苗-1I1、疫苗-1V、疫苗-V、疫苗-V1、疫 苗vn、疫苗珊、疫苗IX、疫苗X、疫苗Xi或疫苗xn。
[0023]以上任一所述奶牛具體可為中國荷斯坦奶牛。
[0024]本發明還保護菌株SACP5-9和/或菌株SACP8-6和/或菌株SACP336-3。當以上三種菌株之間為“和”的關系時，三個菌株的數量比具體可為1:1:1。
[0025]本發明提供的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) SACP5-9,簡稱菌株SACP5-9，已于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8529。
[0026]本發明提供的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) SACP8-6,簡稱菌株SACP8-6，已于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8530。
[0027]本發明提供的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) SACP336-3,簡稱菌株SACP336-3，已于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8531。
[0028]對于奶牛乳房炎來說，最理想的防控手段為通過接種疫苗，其目的就是增強機體免疫應答反應，特別是乳腺組織的免疫應答反應來阻止、中和、殺滅外界進入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特點給有效免疫力的產生帶來了了一系列特殊的挑戰。第一，乳腺中的牛奶會稀釋抗感染的嗜中性粒細胞的濃度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中性粒細胞的殺菌能力。第二，奶牛飼養有大量可引起乳房炎的微生物的環境中，而且奶汁本身給病原菌生長提供了溫床。因此，使奶牛乳腺產生有效的免疫力，降低乳房炎的發生率，需要攻克的難題較多，給奶牛乳房炎疫苗研發提出比其它傳染病疫苗更高的要求。
[0029]疫苗是通過增強機體免疫系統的功能從而使機體獲得天然的抗病能力，并且疫苗具有安全、穩定、有效等特點，因此研制安全、有效的奶牛乳房炎疫苗成為防控乳房炎的必由選擇。研發適宜本國流行代表菌株和環境的疫苗勢在必行。
[0030]本發明提供的疫苗具有高效、通用、安全、穩定、劑型多樣等優點，本發明為安全、高效、全面有效預防金黃色葡萄球菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保證，將是奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎疫苗發展的新里程碑。
【具體實施方式】
[0031]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例中的PBS緩沖液，如無特殊說明均為pH7.2,0.01M的無熱源PBS緩沖液。
[0032]5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株、336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優勢株均記載于如下文獻:奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法(專利申請號:201010543949.8 ;申請
【發明者】李敏, 王林葉, 孫治華, 王歡, 楊鵬輝, 段躍強, 孫科, 孫藝萍 申請人:內蒙古華希生物科技有限公司