一種合成肽疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種口蹄疫合成肽疫苗。具體涉及用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法，所述多肽具有SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列。本發明通過大量動物試驗對這些候選多肽抗原進行篩選，根據篩選結果對口蹄疫病毒抗原位點進行了優化，并有效組合了T細胞表位和B細胞表位，增強了多肽抗原的免疫效果。該O型口蹄疫合成肽疫苗可以有效應對口蹄疫病毒的抗原變異，生物安全性好，易于大規模合成，具有良好的應用前景。
【專利說明】一種合成肽疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法，具體涉及一種用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。
【背景技術】
[0002]口蹄疫(foot and mouth disease,簡稱FMD)是一種發生于偶蹄動物的急性、高度接觸性、發熱性傳染病，在世界范圍內廣泛分布。由于其傳染性高，傳播迅速，感染豬、牛、羊等牲畜導致幼畜死亡，成年動物生產能力急劇下降，嚴重危害畜牧業的發展和肉食及其畜產品的生產和供應。同時會使動物及動物產品的市場流通和國際貿易受到極大的封鎖和限制，給流行國家和地區畜牧業生產造成巨大的經濟損失。口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的，口蹄疫病毒屬細小核糖核酸病毒，具有多型性、易變性等特點。目前，已知全世界有7種血清型的口蹄疫病毒:A、O、C、Satl (南非I型)、Sat2 (南非II型)、Sat3 (南非III型)和Asia I (亞洲I型)。而每種主型又分若干亞型，目前發現的亞型已有70多種。血清型A、O、C和Asia I型最為常見，其中血清型A病毒的變種最多，具有超過30種亞型。研究結果表明:口蹄疫病毒的衣殼蛋白是由四種結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成的，每種各60個。VP1-VP3組成衣殼蛋白亞單位，位于衣殼蛋白的外側，而VP4位于病毒顆粒的內部。VPl是主要的保護性抗原，現已發現O型口蹄疫有3個主要的抗原位點位于VPl上，其中133-160和200-213位構成了 VPl上最重要且最容易變異的保護性抗原位點。
[0003]當前在我國主要流行的口蹄疫是O型和Asia I型口蹄疫。口蹄疫病毒各型之間的抗原性不同，彼此之間不能交互免疫。而且，在同一種血清型中抗原差異的程度也很大，以至于能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可能針對同一血清型中的另一種亞型沒有保護性。此外，口蹄疫毒株的抗原性還在不斷發生變化，隨著時間的推移，原有疫苗的效力減弱甚至消失，因此給口蹄疫`的防治工作帶來了很大的困難。
[0004]目前，我國對口蹄疫實行強制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。而我國現行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒滅活疫苗，其存在著生物安全性差、副反應大、產品質量不穩定等問題。目前世界上很多國家已經停止使用滅活疫苗，也禁止從使用滅活疫苗的國家進口畜產品。在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亞單位疫苗、口蹄疫病毒載體疫苗、口蹄疫基因工程修飾疫苗的研究報道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在著諸多問題，影響了這些新型疫苗的使用。此外，這些疫苗對于當前已經發生變異的流行毒株往往效果較差，不能有效地保護動物。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗，特別是用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗。[0006]本發明的另一個目的是提供一種上述多肽以及上述疫苗的制備方法。
[0007]為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案:
[0008]一種用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID N0.USEQ IDN0.2或SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列。
[0009]上述氨基酸序列中一個或者兩個以上纈氨酸可以被正纈氨酸替代；和/或一個或者兩個以上亮氨酸可以被正亮氨酸替代。優選地，上述氨基酸序列中全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。
[0010]上述氨基酸序列中的任意兩個半胱氨酸的巰基可以經氧化連接在一起形成二硫鍵。
[0011]上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間可以反應形成共價連接。具體來說，上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應形成共價連接。
[0012]一種口蹄疫合成肽疫苗，其中包括一種或兩種以上的上述多肽或其多肽聚合物。例如:具有SEQ ID N0.USEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的多肽或其多肽聚合物，或者他們的任意兩種或者兩種以上的組合。上述疫苗還可以包含佐劑。
[0013]本發明還提供了上述多肽的制備方法，其中包括以下步驟:
[0014](I)以氨基樹脂為起始原料，以9-芴甲氧羰基保護的氨基酸為單體，按照所述氨基酸序列依次縮合接上氨基酸，每步縮合反應后用乙酰咪唑封閉未反應的氨基端；
[0015](2)合成完畢后加入裂解試劑裂解多肽；
[0016](3)使用乙醚收集、沉淀多肽；
[0017](4)超濾純化多肽后進行無菌處理。
[0018]在上述制備方法中，所述裂解試劑的組分體積比為三氟乙酸(TFA):三異丙基硅烷(TIS):苯酚:H20=85:8:6:1 ;所述裂解時間為1-4小時。
[0019]在上述的制備方法中，所述步驟(1)具體包括以下步驟:
[0020](a)脫保護反應:將氨基樹脂置于體積百分比為15-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20-28°C條件下反應25-40分鐘脫除氨基樹脂上的9-芴甲氧羰基保護基團；
[0021](b)洗滌:氮氣吹干，N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；
[0022](C)縮合反應:加入1-羥基苯丙三唑(Η0ΒΤ)、二環己基碳二亞胺(DCC)與9-芴甲氧羰基保護的氨基酸在20-28°C條件下反應0.5-2.5小時；
[0023](d)洗滌:氮氣吹干，N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；
[0024]Ce)封閉反應:加入重量體積百分比為1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20-28°C條件下反應20-40分鐘。
[0025]在上述制備方法中，所述步驟(4)具體包括以下步驟:
[0026](a)使用切向過濾膜包在20_28°C條件下超濾制得的多肽，除去小分子雜質；
[0027](b)使用0.2微米在線濾器除菌保存。
[0028]本發明還提供了上述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟:
[0029](1)用注射用水將上述多肽或其多肽聚合物稀釋到50μ g/ml制得抗原水相；
[0030](2)將佐劑經121°C、30分鐘滅菌備用；
[0031](3)在20-28°C條件下，按照抗原水相與佐劑1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內，90-150轉/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘，緩慢加入水相，加完后攪拌20-30分鐘，再高速8000-10000轉/分鐘攪拌15-30分鐘，靜置5分鐘，分裝后即得。
[0032]本發明進一步提供了上述多肽或其多肽聚合物、疫苗在制備治療和/或預防O型口蹄疫的藥物中的用途。其中，所述O型口蹄疫優選為豬O型口蹄疫。
[0033]本發明通過對國內口蹄疫新近流行毒株的序列測定并結合口蹄疫疫苗毒株MYA/98和0ZK/93序列，研究口蹄疫主要抗原位點的變異情況，針對主要變異的氨基酸位點統計其變異的頻率，同時結合計算機輔助進行口蹄疫抗原位點的分析預測，對可能的抗原位點肽段進行化學合成，即針對易變異位點根據統計的變異頻率，在這些位點使用不同的氨基酸，得到涵蓋當前所有可能變異位點的多種候選多肽抗原。進而通過大量的動物試驗對這些候選多肽抗原進行篩選，得到能夠引起動物的免疫反應，而且免疫反應水平高，能夠很好的保護動物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。本發明根據篩選實驗結果對口蹄疫病毒抗原位點進行了優化，并有效組合了 T細胞表位和B細胞表位，增強了多肽抗原的免疫效果。該口蹄疫O型合成肽疫苗可以有效應對目前口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易于大規模合成，具有良好的應用前景。
【具體實施方式】
[0034]下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0035]下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
[0036]實施例1、實施例1 口蹄疫合成肽抗原的固相合成
[0037]本發明通過對國內口蹄疫新近流行毒株的序列測定并結合口蹄疫疫苗毒株MYA/98和0ZK/93序列，研究口蹄疫主要抗原位點的變異情況，針對主要變異的氨基酸位點統計其變異的頻率，同時結合計算機輔助進行口蹄疫抗原位點的分析預測，對可能的抗原位點肽段進行化學合成，即針`對易變異位點根據統計的變異頻率，在這些位點使用不同的氨基酸，得到涵蓋當前所有可能變異位點的多種候選多肽抗原。進而通過大量的動物試驗對這些候選多肽抗原進行篩選，得到能夠引起動物的免疫反應，而且免疫反應水平高，能夠很好的保護動物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。
[0038]本發明的多肽抗原可以使用全自動多肽合成儀,利用Merrifield固相合成法制備，其中采用了 9-荷甲氧羰基(Fmoc)修飾的氨基酸，固相載體為Rink Amide MBHA樹脂。生產過程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。
[0039]1、多肽抗原的固相合成
[0040]I)合成原料準備
[0041]合成多肽抗原的序列分別如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
[0042]依據抗原的序列以及合成規模為1mmol準備合適的Fmoc修飾的氨基酸，加入相應的氨基酸小瓶中。同樣按要求稱量Rink Amide MBHA樹脂，放入反應腔中，將上下蓋子擰緊，貼標簽，記錄所合成肽的名稱、批號、反應腔的皮重及所稱樹脂的重量。將反應腔裝入合成儀。配制合成試劑，包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酰咪唑(AM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相對應的試劑瓶中。
[0043]2)合成儀狀態檢測
[0044]檢查多肽合成儀是否正常運行。開機后，運行Run Self Test程序，儀器自檢各項指標是否正常。另外檢查N2是否充足，系統表壓是否正常。合成前應對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進行測定。發送Flow Ratel-18到合成儀，選擇MainMenu—Module Test一按 Prer 或 next 找 Module A、ModuleD、Module1、Module1、ModuleA—按Start—按more進行測量或觀察，若流量不合適，則調節下閥門壓力，直至達到要求。
[0045]3)多肽抗原的合成開始
[0046]在合成儀的程序中將合成需要的方法Std Fmocl.0Sol DIC90發送到合成儀上。File-New-Sequence-編輯合成妝的序列，保存。File-New-Run,檢查 Chemistry ；Sequence是否為所存名字；設定Cycles ;保存。最后發送到合成儀上。
[0047]Main Menu—Cycle Monitor—begin,開始運行。
[0048]4)多肽抗原的合成
[0049]如上述的多肽序列，合成的時候是從C端開始至N端，依照給定的順序，依次不斷地重復如下合成步驟:
[0050](I)脫保護反應:將上述氨基樹脂置于體積百分比為15%_30%的六氫吡啶的NMP溶液中，在20-28°C條件下反應25-40分鐘脫除氨基樹脂上的Fmoc保護基團；
[0051](2)洗滌:氮氣吹干，NMP洗滌氨基樹脂；
[0052](3 )縮合反應:加入HOBT、DCC與Fmoc保護的氨基酸在20_28 °C條件下反應
0.5-2.5 小時；
[0053](4 )洗滌:氮氣吹干，NMP洗滌氨基樹脂；
[0054](5)封閉反應:加入重量體積百分比為1.5%_4%的乙酰咪唑的NMP溶液，在20-28 °C條件下反應20-40分鐘。
[0055]5)多肽抗原合成結束
[0056]抗原合成結束后合成儀將自動停止。然后從多肽合成儀上取下反應器，再用100%甲醇洗滌多肽樹脂3次，然后在通風櫥內吹干，將多肽樹脂轉移至棕色瓶內，放入-20°C冰箱內，封口膜密封備用。
[0057]2、多肽抗原的裂解及鑒定
[0058]I)多肽抗原的裂解
[0059]按照體積比例(TFA/TIS/苯酚/H20=85/8/6/l)配制裂解液，然后從冰箱內取出合成的多肽樹脂，放入圓底燒瓶內，在通風櫥內向燒瓶內加入配制好的裂解液和磁攪拌子，然后穩定地放置在磁力攪拌器上，室溫下持續攪拌I小時直至反應完全。反應結束后，使用帶冷阱的旋轉蒸發儀持續蒸發30至120分鐘除去粗產品中的TFA。接著使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后將混合在一起的樹脂用砂芯漏斗過濾出來，即得到多肽抗原。
[0060]2)合成抗原的鑒定
[0061]多肽抗原合成完畢后用基質輔助激光解吸飛行時間質譜法(MALDL-T0F)和反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進行定性定量分析。
[0062]3)多肽抗原的構象形成
[0063]用15% DMSO將多肽抗原配制成濃度為2mg/ml的多肽溶液，然后用0.1N NaOH或
0.1N HCl調整初步分離多肽溶液的pH值=8.5，在25°C的環境下在轉速為IlOrpm的搖床上放置48小時，使形成二硫鍵。[0064]進而進行首尾環化，首尾的“-COOH”與“-NH2”環化方法見Mengfen等P印tideProtein Reserchl996.48:229-239;首尾的“-C00H”與“-OH”進行反應而形成環狀結構見Mmenhofer等Chem.Socl970.92:3771_3777。即可得到能夠模擬病毒粒子天然構象的多肽環化結構。
[0065]4)多肽抗原的純化除菌
[0066]多肽抗原使用循環式切向過濾膜包在20_28°C條件下進行超濾(Tangential FlowDevice循環式切向過濾膜包以及與其配套的蠕動泵)，多肽抗原是大分子不能通過一定孔徑的濾膜，而前期合成過程以及后期環化反應形成或引進的小分子雜質則可以通過濾膜。然后再通過孔徑為0.2μπι在線過濾器除菌，將最后得到的溶液分裝到無菌塑料瓶內，貼上標簽。標簽上注明多肽的名稱、編號、生產批號、濃度、生產日期、保存期限及保存條件，分裝后，儲存于-20 V或-40 V備用。
[0067]為了便于運輸和長期保存的需要，將多肽抗原進行冷凍干燥以得到固體狀態的多肽。將預先凍好的多肽抗原取出，在Labconco冷凍干燥機上進行干燥，得到固體狀態的多肽抗原。同時貼上標簽。標簽上注明多肽的名稱、編號、生產批號、濃度、生產日期、保存期限及保存條件。
[0068]實施例2、合成肽疫苗的配制
[0069]1、抗原水相的配制
[0070]首先，分別稱取依照上述實施例1合成的三種多肽抗原；然后，用滅菌注射用水將合成肽抗原濃度稀釋至50 μ g/ml ;將抗原溶液經孔徑為0.2 μ m的過濾器過濾，除菌。
[0071]2、油相佐劑制備
[0072]將油相佐劑ISA50`V經121°C、30分鐘滅菌，備用。
[0073]3、合成肽疫苗的乳化
[0074]用滅菌的蒸餾水2000ml清洗IKA乳化設備(購自IKA公司，貨號200603) 3次，然后在20-28°C條件下按油相佐劑和抗原水相為1:1的體積比，先將油相加入乳化罐內，開動電機以90~150r/m慢速轉動攪拌2分鐘后，同時緩慢加入水相抗原，加完后攪拌30分鐘，再以10000r/m高速攪拌20分鐘，靜置5分鐘，使疫苗乳化成油包水的單相疫苗。
[0075]實施例3、合成肽疫苗的效力試驗
[0076]一、材料與方法
[0077]1、合成肽疫苗
[0078]按照上述實施例1合成具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3序列的多肽抗原，這些多肽兩個半胱氨酸的巰基經氧化連接在一起形成二硫鍵，并且首尾氨基酸羧基與羥基之間反應形成共價連接。這些然后按照實施例2的方法分別配制與之對應的批號為:ZM433A01、ZM433A02、ZM433A03的口蹄疫O型合成肽疫苗。
[0079]此外，將SEQ ID NO:1中氨基酸序列中全部纈氨酸用正纈氨酸替代；全部亮氨酸用正亮氨酸替代，依據上述實施例提供的方法進行抗原合成，該抗原中同樣兩個半胱氨酸的巰基經氧化連接在一起形成二硫鍵，并且首尾氨基酸羧基與羥基之間反應形成共價連接，將按照實施例2的方法配制疫苗批號為:ZM433A04。
[0080]依據SEQ ID NO:1序列使用實施例1所述的常規合成肽技術合成該序列的二聚體抗原，其中，組成二聚體中每條多肽兩個半胱氨酸的巰基經氧化連接在一起形成二硫鍵，并且首尾氨基酸羧基與羥基之間反應形成共價連接，按照實施例2的方法配制疫苗，得到批號為:ZM433A05的合成肽疫苗。
[0081]2、試驗動物
[0082]挑選品種相同，4月齡、體重40Kg左右，口蹄疫中和抗體呈陰性的健康架子豬27頭(二元雜交，蘭州白銀豬場)。
[0083]3、毒種 0R/80MF8
[0084]將0R/80MF8 (蘭州生物藥廠提供)經乳鼠測毒合格后置于_20°C冷凍保存，備用。
[0085]4、試驗方法
[0086]針對每組疫苗采用體重40kg左右的健康易感架子豬(經乳鼠中和試驗測定無口蹄疫中和抗體)5頭。將待檢的各批次合成肽疫苗分別于耳根后肌肉注射2ml。接種28日后，連同條件相同的對照豬2頭，每頭豬耳根后肌肉注射1000個ID5tl的口蹄疫O型病毒強毒0R/80MF8，連續觀察10日。對照豬均至少一蹄出現水泡病變。免疫豬出現任何口蹄疫癥狀即判為不保護。
[0087]5、結果判定
[0088]豬一蹄以上或口鼻部出現口蹄疫典型水泡，則判為發病。而豬任何部位無口蹄疫典型水泡出現則判為保護。
[0089]二、試驗結果與討論
[0090]1、試驗結果
[0091]免疫28天后，用1000個ID5tl/頭份的0R/80強毒攻擊10天后，結果詳見表1。
[0092]表1 口蹄疫合成肽疫苗效力試驗
[0093]
【權利要求】
1.一種用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID N0.K SEQ IDN0.2或SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于:所述多肽的氨基酸序列中一個或者多個纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或一個或者多個亮氨酸被正亮氨酸替代。
3.根據權利要求2所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列中全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列中的任意兩個半胱氨酸的巰基經氧化連接在一起形成二硫鍵。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應形成共價連接。
6.根據權利要求5所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應形成共價連接。
7.—種口蹄疫合成肽疫苗,其中包括一種或兩種以上選自權利要求1至6中任一項所述的多肽或其多肽聚合物。
8.根據權利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐劑。
9.一種根據權利要求1至6中任一項所述的多肽的制備方法，其中包括以下步驟: (O以氨基樹脂為起始原料，以9-芴甲氧羰基保護的氨基酸為單體，按照所述氨基酸序列依次縮合接上氨基酸，每步縮合反應后用乙酰咪唑封閉未反應的氨基端；· (2)合成完畢后加入裂解試劑裂解多肽； (3)使用乙醚收集、沉淀多肽； (4)超濾純化多肽后進行無菌處理。
10.權利要求1至6中任一項所述的多肽或其多肽聚合物、權利要求7或8所述的疫苗在制備治療和/或預防O型口蹄疫的藥物中的用途；所述O型口蹄疫優選為豬O型口蹄疫。
【文檔編號】A61P31/14GK103848902SQ201410081709
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】巴利民, 肖進, 齊鵬, 宋芳, 王楠, 栗利芳, 趙洪濤, 張蕾, 周強, 鄭應華 申請人:中牧實業股份有限公司