神經軸突導向因子在制備促進角膜損傷修復制品中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種神經軸突導向因子在制備促進角膜損傷修復制品中的應用，即利用神經軸突導向因子來制備抑制角膜上皮損傷后炎癥反應及促進角膜上皮修復的藥物或制備，本發明發現Netrin1不僅能促進角膜緣干細胞增殖和遷移能力，還能抑制正常小鼠和糖尿病小鼠角膜上皮損傷后的炎癥反應，促進正常小鼠和糖尿病小鼠的角膜上皮的損傷修復，可用于眼表角膜和結膜上皮干細胞的培養、糖尿病角膜病變的治療、神經性角膜炎的治療。
【專利說明】神經軸突導向因子在制備促進角膜損傷修復制品中的應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于眼科疾病治療藥品制備【技術領域】，具體涉及一種神經軸突導向因子在制備促進角膜損傷修復制品中的應用，即神經軸突導向因子在治療糖尿病角膜病變、神經營養性角膜炎等影響角膜修復疾病中的應用。

【背景技術】
[0002]角膜的透明及功能的完整取決于角膜各層組織的結構和代謝的正常，而位于最外層的角膜上皮組織無疑對此起著相當重要的作用。角膜上皮是防御外界致病因子侵犯的物理屏障，其完整性維持依賴于上皮細胞的細胞間，細胞與基底膜之間的緊密連接和錨定連接以及上皮細胞的不斷自我更新。
[0003]角膜上皮層受損可影響細胞間的連接，引起細胞膜的通透性和選擇性發生變化，從而影響其屏障功能，導致角膜易受外界致病因子的侵害引起炎癥導致角膜混濁，甚至引起失明。角膜損傷后的再上皮化是損傷修復的一個最基本的過程，上皮化可以迅速重建上皮屏障，這對于保持角膜的結構完整及正常功能非常重要。各種物理損傷、化學損傷、機械損傷、病原微生物、內分泌及免疫性因素均可導致角膜上皮損傷。如糖尿病性角膜病變，有研究表明:47%-64%的糖尿病患者可能會出現原發性角膜病變，其臨床特征主要表現為角膜敏感度下降、上皮愈合延遲、神經營養性角膜潰瘍等癥狀。糖尿病患者在進行白內障或視網膜手術后可能出現角膜上皮再生延遲，甚至出現反復剝脫現象。
[0004]角膜上皮損傷后的愈合過程非常復雜，有許多因素參與調節:①源于基底細胞及角膜緣干細胞的不斷增殖、分化的上皮細胞的自我更新對上皮細胞損傷后的迅速再上皮化、重建上皮屏障，從而保持角膜的結構完整及正常功能非常重要；②在角膜上皮愈合過程中，由細胞表達的不同的細胞外基質分子及細胞表面受體，對由細胞骨架介導的細胞粘附和運動方面起關鍵性作用；③許多生長因子如EGF、KGF、HGF、TGF、PDGF等)通過自分泌或/和旁分泌途徑參與調節角膜上皮細胞的增殖及遷移，維持角膜結構和功能的正常位于細胞表面的細胞粘附分子(如整合素)以受體-配體的形式發揮作用，在角膜創傷愈合中起重要作用；⑤另外，其他一些因素如神經性因素等也參與調節角膜上皮細胞的屏障功能及創傷愈合。
[0005]不論何種原因引起的角膜上皮缺損，能否迅速完整地修復，是恢復角膜上皮細胞的屏障功能、促進創傷愈合、保持良好視力的關鍵。因此全面了解角膜上皮細胞屏障功能及創傷愈合的調節因素，對臨床上治療角膜上皮細胞屏障功能障礙及促進創傷愈合來講是非常重要的。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種神經軸突導向因子在制備促進角膜損傷修復制品中的應用，即利用神經軸突導向因子來制備抑制角膜上皮損傷后炎癥反應及促進角膜上皮修復的藥物或制備，從而彌補現有技術的不足。
[0007]發明人發現，在小鼠角膜上皮細胞系TKE2的培養基KSFM中添加一定劑量的神經軸突導向因子Netrinl (例如10_20ng/ml)能夠有效地促進角膜緣干細胞增殖。在TKE2細胞高糖誘導模型中，培養基中添加一定劑量的Netrinl (例如10-100ng/ml)能夠有效地促進角膜緣干細胞遷移。同時，在正常C57小鼠和STZ誘導的糖尿病小鼠中，建立角膜上皮刮除損傷模型后，結膜下注射一定劑量的Netrinl (例如50ng)，能夠有效地促進角膜上皮損傷修復，抑制炎癥反應；從而促成了本發明。
[0008]本發明首先提供Netrinl的一種新的用途，即在制備用于促進角膜上皮損傷修復制品或抑制角I吳炎癥反應制品中的應用。
[0009]所述的制品為滴眼液，其中包含有藥理有效濃度的神經軸突導向因子；
[0010]所述的制品還可以是注射液；
[0011]其中藥理有效濃度，為10-100ng/ml,優選50ng/ml ；
[0012]所述的神經軸突導向因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1;
[0013]為了提高神經軸突導向因子在治療角膜上皮損傷后炎癥和促進角膜上皮損傷修復中的效果，發明人對神經軸突因子的氨基酸序列進行了改造，改造后的氨基酸序列為SEQID NO:2;
[0014]本發明發現Netrinl不僅能促進角膜緣干細胞增殖和遷移能力，還能抑制正常小鼠和糖尿病小鼠角膜上皮損傷后的炎癥反應，促進正常小鼠和糖尿病小鼠的角膜上皮的損傷修復，可用于眼表角膜和結膜上皮干細胞的培養、糖尿病角膜病變的治療、神經性角膜炎的治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:在TKE2的培養基中添加不同濃度的Netrinl對細胞克隆增殖能力的影響，培養液中添加10ng/ml的Netrinl即能有效促進TKE2細胞克隆的增殖。
[0016]圖2:在TKE2高糖環境下損傷模型的培養基中添加不同濃度的Netrinl對細胞遷移能力的影響，培養液中添加50ng/ml或100ng/ml的Netrinl能有效促進TKE2細胞的遷移能力。
[0017]圖3:Netrinl對正常小鼠角膜上皮損傷修復的影響，結膜下注射50ngNetrinl能有效促進角膜上皮的損傷修復。
[0018]圖4 =Netrinl對STZ誘導的糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復的影響，結膜下注射50ng Netrinl能有效促進糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復。
[0019]圖5 =Netrinl對正常小鼠和STZ誘導糖尿病小鼠角膜損傷炎癥反應的影響，結膜下注射50ng Netrinl能有效減少小鼠損傷的角膜上皮中炎癥細胞的浸潤。

【具體實施方式】
[0020]神經軸突導向因子(Netrinl)屬于Netrin家族成員，是最早發現的可溶性神經突起導向因子。Netrinl是對突變線蟲缺陷UNC-6基因進行基因分析而被發現，并命名為軸突導向因子，現稱神經軸突導向因子。Netrinl是一種高度保守的細胞分泌型可溶性蛋白，分子量約70~80kD，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。目前Netrinl只是用于急性腎損傷模型中能調控腎小管上皮炎癥和細胞凋亡；細胞遷移、腫瘤細胞生存能力、胚胎細胞的發育中得到了應用。
[0021]下面結合實施例對本發明進行詳細的描述:
[0022]實施例1:添加不同濃度Netrinl對TKE2細胞增殖和遷移能力的影響
[0023]1.應用 KSFM (Keratinocyte-SFM 加 BPE(50yg/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)培養液常規培養TKE2細胞，將4X 14個細胞接種至60mm培養皿中，分別向各皿中添加不同濃度的Netrinl (0、5、10和20ng/ml)，然后于5%C02和37°C的條件下培養，每3天更換新培養基，同時添加上述濃度的Netrinl因子，培養6天后利用細胞計數器進行細胞計數，細胞數量統計見圖1。如圖1所示，未添加Netrinl培養的TKE2細胞數量為2.7X 105，而添加10和20ng/ml Netrinl培養液培養的TKE2細胞數分別為4.4X 105、
4.7 X 105，較空白對照培養的TKE2細胞數量增加了 1.5_2倍(*P〈0.01)。由此，證明了添加10-20ng/ml的Netrinl能有效促進TKE2細胞的增殖。
[0024]2.應用 KSFM (Keratinocyte-SFM 加 BPE(50yg/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)培養液常規培養TKE2細胞，將I X 15個細胞接種至六孔板中，選擇一孔作為對照，一孔加入lmol/L的甘露醇25 μ 1/ml,其余4個孔分別加入lmol/L的葡萄糖25μ 1/ml，然后于5%C02和37°C的條件下培養，2天后在六孔板內行細胞劃痕試驗，顯微鏡1x照相后向添加葡萄糖的孔內加入Netrinl (O, 10, 50, 100ng/ml), 24h后顯微鏡照相,觀察劃痕部位TKE2細胞向中央遷移的情況見圖2。如圖2所示，對照組TKE2細胞劃痕24h后細胞遷移面積約占劃痕缺損面積60%，而添加lmol/L葡萄糖組的細胞遷移面積約占20%，可見高糖環境能有效抑制TKE2細胞的遷移；而分別添加10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml Netrinl培養的TKE2細胞遷移面積分別約為50%、70%和60%，由此可見Netrinl能有效逆轉高濃度葡萄糖對細胞遷移的抑制作用，促進TKE2細胞遷移。
[0025]實施例2:外源性添加Netrinl對角膜上皮損傷修復的影響
[0026]1.Netrinl對正常小鼠角膜上皮損傷修復的影響。
[0027]將12只C57BL/6小鼠(6_8周齡)隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射7μ I PBS，實驗組小鼠右眼結膜下注射50ng Netrinl (溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，代表性裂隙燈觀察照片見圖3。如圖3所示，結膜下注射PBS的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.83,0.65和0.32 ;結膜下注射50ng Netrinl的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.83,0.54和0.16。由此可見，Netrinl能有效促進小鼠角膜上皮的損傷修復。
[0028]2.Netrinl對STZ誘導的糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復的影響
[0029] 將12只STZ誘導的C57BL/6糖尿病小鼠隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射7 μ I PBS,實驗組小鼠右眼結膜下注射50ngNetrinl (溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，代表性裂隙燈觀察照片見圖4。如圖4所示，結膜下注射PBS的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.83,0.70和0.46 ;結膜下注射50ng Netrinl的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.74,0.33和0.07。由此可見，Netrinl能有效促進糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復。
[0030]3.Netrinl對正常及STZ誘導的糖尿病小鼠角膜上皮損傷后炎癥反應的影響
[0031]取正常與STZ誘導的C57BL/6糖尿病小鼠經上述處理后48h與72h的小鼠眼球，置于OCT中制作冰凍樣本。用冰凍切片機制作8 μ m厚度冰凍切片，通過免疫熒光方法檢測Netrinl對中性粒細胞標記(Ly6G)的影響。如圖5所示,Netrinl能明顯減少正常及STZ誘導的C57BL/6糖尿病小鼠角膜上皮損傷部位中性粒細胞的浸潤，抑制角膜上皮損傷后的炎癥反應。
[0032]實施例3 =Netrinl的性狀改造
[0033]為了提高神經軸突導向因子在治療角膜上皮損傷后炎癥和促進角膜上皮損傷修復中的效果，對神經軸突導向因子Netrinl的氨基酸序列進行了改造，即對Netrinl第O~21位氨基酸進行剪切，保留自22~604位氨基酸。獲得Netrinl的改造體HumanNetrinl (Val22Ala604)，其氨基酸序列為 SEQ IDN0:2。
[0034]具體改造步驟如下:
[0035]以人NetrinlcDNA為模板，通過PCR擴增Netrinl全長蛋白序列中第22-604位(Netrinl-截短)共583個氨基酸的編碼序列，Netrinl-截短引物序列為AGACACGAATTCGTGCGCGGCGGGCCCGGGCTCA、AGACTCGAGGGCCTTCTTGCACTTGCC,在引物序列的兩端分別為人工引入的EcoR I和Xho I酶切位點。用EcoRI和XhoI分別雙酶切空載體pGEX_4T_l和PCR擴增產物，將Netrinl-截短以正確讀框與pGEX_4T_l載體連接，獲得GST與Netrinl-截短融合蛋白表達質粒PGEX-Netrinl-截短。獲得的重組表達載體分別應用酶切和測序的方法進行鑒定，結果顯示酶切片段的大小正確，并且測序結果顯示與參考序列完全相符，根據測序結果和讀碼框位置可知，翻譯后的氨基酸序列為SEQ ID NO:2;
[0036]將構建的GST融合蛋白表達質粒轉化到大腸桿菌BL-21中，挑取單克隆菌株接種到3ml LB培養液中，37°C、250rpm振蕩過夜；再按3%。接種量轉接，37°C培養至菌液A值達到0.6~0.8后，加入IPTG至終濃度為500 mol/L，繼續振蕩培養2h ;然后4°C、3000rpm離心30min收集菌體，按40: I的比例加入細菌裂解液重懸菌體，超聲破碎細菌，離心收集上清液；應用Glutath1ne Sepharose4B純化柱(購自AmershamB1sciences公司)純化GST-Netrinl-截短融合蛋白；將GST-Netrinl-截短融合蛋白用Thrombin凝血酶切掉之后，再過一次純化柱，收集穿透液了，然后通過透析和凍干，得到Netrinl-截短蛋白，然后使用PBS緩沖液重新溶解為100ng/ul的儲液，凍存于_80°C備用。并驗證改造后的Netrinl(Netrinl-截短蛋白)在治療角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復中的效果。
[0037]一、Netrinl-截短蛋白對TKE2細胞的影響
[0038]1.應用 TKE2 細胞的培養液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常規培養TKE2細胞，將4X 14個細胞接種至60mm培養皿中，分別向兩皿中添加Netrinl (10ng/ml)和Netrinl-截短(10ng/ml)，然后于5%C02和37°C的條件下培養，每3天更換新培養基，同時添加上述濃度的Netrinl和Netrinl-截短因子，培養6天后利用細胞計數器進行細胞計數，細胞數量統計顯示，添加10和20ng/ml Netrinl培養液培養的TKE2細胞數分別為4.5X105、4.7X105，而添加10和20ng/mlNetrinl_截短培養液培養的TKE2細胞數分別為5.6X 105、6.8X 105，較空白對照培養的TKE2細胞數量增加了1-1.5倍(*P〈0.05)。由此可見，與添加Netrinl因子相比，添加Netrinl-截短因子能更有效地促進TKE2細胞的增殖。
[0039]2.應用 KSFM (Keratinocyte-SFM 加 BPE(50yg/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBCO, 10724-011)培養液常規培養TKE2細胞，將I X 15個細胞接種至六孔板中，每個孔都加入lmol/L的葡萄糖25μ 1/ml，然后于5%C02和37°C的條件下培養，2天后行細胞劃痕試驗，顯微鏡1x照相后向孔內分別加入Netrinl (10, 50, 100ng/ml)和Netrinl-截短因子(10，50，100ng/ml),24h后顯微鏡照相，觀察劃痕部位TKE2細胞向中央遷移的情況。添加Netrinl的TKE2細胞劃痕24h后細胞遷移面積分別約占劃痕缺損面積50%、70%和60%，而添加Netrinl-截短因子的TKE2細胞劃痕24h后細胞遷移面積分別約占劃痕缺損面積60%、85%和60%。由此可見Netrinl-截短因子促進TKE2細胞遷移的作用更明顯。
[0040]二:外源性添加NETRIN1對角膜上皮損傷修復的影響
[0041]1.Netrinl對正常小鼠角膜上皮損傷修復的影響
[0042]將12只C57BL/6小鼠(6_8周齡)隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射50ngNetrinl (溶解于7ul PBS),實驗組小鼠右眼結膜下注射50ng Netrinl-截短(溶解于7ulPBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，結膜下注射50ng Netrinl的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.83,0.53和0.17 ;結膜下注射50ng Netrinl-截短因子的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.76,0.33和0.08。結果表明結膜下注射50ngNetrinl_截短因子能更有效的促進角膜上皮的損傷修復。
[0043]2.Netrinl對STZ誘導的糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復的影響
[0044]將12只STZ誘導的C57BL/6糖尿病小鼠隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射50ng Netrinl (溶解于7ul PBS),實驗組小鼠右眼結膜下注射50ng Netrinl-截短(溶解于7ul PBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，結膜下注射50ng Netrinl的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.75,0.32和0.07 ;結膜下注射50ng Netrinl-截短因子的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺損率分別為0.68,0.26和0.04。結果表明結膜下注射50ng Netrinl-截短因子能更有效的促進糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復。
【權利要求】
1.一種神經軸突導向因子的用途，其特征在于，是在制備用于促進角膜上皮損傷修復制品或抑制角I吳炎癥反應制品中的應用。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的神經軸突導向因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的神經軸突導向因子的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的制品為包含有藥理有效濃度的神經軸突導向因子的滴眼液或注射液。
5.如權利要求4所述的用途，其特征在于所述的藥理有效濃度為10-100ng/ml。
6.如權利要求4所述的用途，其特征在于所述的藥理有效濃度為50ng/ml。
7.一種用于促進角膜上皮損傷修復的制品，其特征在于，所述的制品為包含有藥理有效濃度的神經軸突導向 因子的藥物。
【文檔編號】A61K38/19GK104043109SQ201410086629
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年3月5日 優先權日:2014年3月5日
【發明者】周慶軍, 張陽陽, 謝立信, 陳鵬, 高華 申請人:山東省眼科研究所