一類set蛋白小分子抑制劑及其用途
【專利摘要】本發明公開了一類SET蛋白小分子抑制劑及其在治療SET蛋白表達異常相關疾病中的應用。SET蛋白又名模板活化因子-1(emplate?activating?factor,TAF-1)、蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(inhibitor?of?protein?phosphatase2A-2,I2PP2A)]，其所治療的疾病為所有涉及到SET蛋白表達異常的炎癥、神經退化性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病等。
【專利說明】一類SET蛋白小分子抑制劑及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一類SET蛋白小分子抑制劑及其在治療SET蛋白表達異常相關疾病中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著人類生活水平的提高及醫療條件的改善，全球人均壽命有了很大的提高。但由于環境污染，不良生活、飲食習慣的盛行以及人口老齡化等因素的影響，癌癥、老年癡呆癥等疾病的發病率呈逐年攀升的趨勢。世界衛生組織報告顯示，2008年全世界約有1270萬新增癌癥患者，760萬死于癌癥(約占所有死亡人數的13%)。據推測到2020年前，全球每年將新增1500萬癌癥患者，到2030年癌癥的死亡人數可能會增至1310萬。癌癥己成為僅次于心血管疾病的第二大死因。目前治療癌癥的化學治療藥物主要是烷化劑，順鉬，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，吉西他濱，奧沙利鉬等細胞毒性藥物，這些抗腫瘤藥物都是非特異性的抑制細胞生長并引起細胞死亡，在殺死腫瘤細胞的同時，對人體正常細胞，骨髓、消化道、肝、腎等正常組織也帶來損害，副作用明顯，治療效果有限。近幾年來，隨著分子腫瘤學、分子藥理學等交叉學科的發展，使人類對腫瘤的認識逐漸深入。抗腫瘤藥物的研究已從傳統的細胞毒性藥物，轉向針對不同腫瘤以及同一腫瘤的不同亞型的發生發展過程中的某一重要靶標(往往是某種蛋白激酶)的分子靶向抗腫瘤藥物。腫瘤治療已經進入了靶向治療及個體化治療新階段。腫瘤分子靶向治療已憑其特異性、針對性強，患者耐受性較好，效果明顯，毒副反應相對較低等優點，在腫瘤治療領域取得了巨大成功，逐步成為國內外腫瘤治療領域的新趨勢。目前已上市的分子靶向抗腫瘤藥物主要包括小分子蛋白激酶抑制劑和單克隆抗體兩類。并且都取得了驕人戰績，為研發企業創造了巨大經濟利益，其中伊馬替尼，利妥昔單抗，貝伐單抗，曲妥珠單抗等已成為全球年銷售額大于10億美元的“重磅炸彈”。蛋白激酶是目前腫瘤靶向治療中一類重要的作用靶點。從它們磷酸化的位點來區分，它們可以分為酪氨酸，絲、蘇氨酸蛋白激酶兩類，它們分別能使蛋白質中的酪氨酸，絲、蘇氨酸上的羥基磷酸化。蛋白激酶在細胞的生長過程中扮演著非常重要的作用，特別是參與細胞信號的傳遞。很多疾病中蛋白激酶的活性異常升高。與蛋白激酶相對應的是蛋白磷酸酶。蛋白磷酸酶也分為酪氨酸，絲、蘇氨酸蛋白磷酸酶。它們能使相應底物(蛋白激酶)的酪氨酸，絲、蘇氨酸位點脫磷酸化而失活?？梢哉f蛋白激酶/蛋白磷酸酶活性的平衡對保持細胞功能的正常至關重要。很多疾病包括癌癥，炎癥，神經退化性疾病，蛋白激酶活性異常升高或者蛋白磷酸酶活性異常偏低。蛋白激酶/蛋白磷酸酶可以作為疾病治療的重要靶點。目前已上市的靶向治療藥物主要的靶點就是蛋白激酶。雖然針對蛋白激酶的藥物容易因為蛋白激酶的突變而耐藥，但目前仍是治療各種惡性疾病的一線靶向藥物。中國發明專利(專利號01138070.5)公開了一類2-苯氧基嘧啶衍生物，該類化合物就是一類蛋白激酶的抑制劑，可以通過抑制蛋白激酶特別是酪氨酸蛋白激酶治療相關的各類疾病。該專利公開了十七種化合物對Abl蛋白激酶的抑制效果，半數抑制濃度(IC50)在0.025-2.0 μ M0雖然上述發明中的化合物對酪氨酸蛋白激酶有著明顯的抑制作用，但在該專利文獻中，這些化合物抑制腫瘤細胞的增殖活性尚未驗證，實際用途未知。本專利申請發明人在此后進行的測試腫瘤細胞增殖活性實驗中發現它們并沒有顯示出較強的抑制效果。為改進上述發明，本專利申請發明人對2-苯氧基嘧啶衍生物進行了結構改造，獲得了一種苯氧基嘧啶衍生物并申請了中國發明專利(申請號200810244308.5)。發現該類化合物對不同的腫瘤細胞有較強的抑制作用，活性明顯優于專利號為01138070.5的中國專利所公開的2-苯氧基嘧啶衍生物。進一步的體外激酶實驗發現苯氧基嘧啶衍生物對64種不同的蛋白激酶的抑制作用很弱，反而不如2-苯氧基嘧啶衍生物。說明其抑制腫瘤細胞的作用靶點可能不是蛋白激酶而是其它靶點。為了闡明苯氧基嘧啶類化合物治療相關疾病的作用機制，需要找到它作用的直接靶標。目前尋找藥物作用靶標的方法很多，包括計算機虛擬篩選，基因芯片，蛋白質芯片，蛋白質二維電泳，噬菌體展示技術，酵母雙雜交，定量蛋白組學和化學蛋白組學(親和色譜等)等。其中親和色譜是一種低成本且有效的方法。目前已成功運用于FK506，環孢菌素，腺華素，秋水仙堿等藥物靶標的識別。常見的親和色譜法有固相洗脫法和藥物競爭法。固相洗脫法容易受到“親和柱-靶蛋白”復合體解離速度的影響，而且還須制備無活性結構類似物的對照柱。藥物競爭法存在對藥物溶解性要求高等缺點。系列親和色譜法是新發明的一種能克服以上兩種親和色譜法缺點的親和色譜法，具有實用性強，結果可靠等優點。基于以上認識，本發明決定采用系列親和色譜法識別苯氧基嘧啶類化合物直接作用的靶標并進行靶標確證。尋找新的藥物作用靶標，為相關疾病的治療提供新的治療方案。

【發明內容】
[0004]本發明基于苯氧基嘧啶衍生物作用靶標的發現，有針對性的提供一種高效低毒的治療方案。為達到上述目的，通過給予患有SET蛋白表達異常疾病的患者施用含有苯氧基嘧啶母核結構的SET蛋白小分子抑制劑，以達到靶向治療疾病的目的。
[0005]本發明具體技術方案如下:
苯氧基嘧啶類化合物作為SET蛋白抑制劑在制備與SET蛋白表達異常相關疾病藥物中的應用。通過苯氧基嘧啶類化合物抑制SET蛋白與PP2A之間的相互作用，提高細胞中PP2A的活性，降低與PP2A相互作用的蛋白激酶的磷酸化水平，促進細胞凋亡，改變細胞周期而發揮相應的生物學作用。
[0006]上述方案中所述的苯氧基嘧啶衍生物作用靶標為SET蛋白，又名模板活化因子-1 (emplate activating factor, TAF-1)、蛋白憐酸酶 2A 抑制劑-2 (inhibitor ofprotein phosphatase2A-2，I2PP2A)、組織相容性白細胞抗原II相關蛋白(PHAP II)、粒酶A 激活的 DNA 酶活化抑制劑(inhibitor of GzmA Activated Dnase, IGAAD)等，是由 SET基因編碼的蛋白，包括兩種主要剪切體:TAF-α和SET/TAF-β。SET/TAF-β亞型發揮著SET蛋白的主要生物學作用。SET蛋白是一種多功能蛋白，其功能涉及到DNA復制、核小體裝配、染色體解聚、細胞凋亡、抑制細胞蛋白磷酸酶2A活性等多個生物學過程，是細胞生理活動的重要調節因子。在一些消化系統和血液系統腫瘤、生殖系統、神經系統的疾病中伴有SET表達或亞細胞定位異常。比如在子宮、胃、結腸、直腸腫瘤組織中SET/TAF-β表達是相應正常組織的2倍或更高。在慢性髓性細胞白血病、急性髓性細胞白血病、B細胞非霍奇金淋巴瘤等白血病中都存在SET復合體蛋白表達量異常升高的現象。并且其表達量與腫瘤的惡性程度高度相關。在正常神經元細胞中SET蛋白主要亞定位于細胞核，而在阿爾茨海默癥病人大腦，SET蛋白在細胞漿增多，使細胞中蛋白磷酸酶2A活性偏低導致tau蛋白的過度磷酸化，造成淀粉樣蛋白(APP)在腦部的沉積。SET蛋白表達異常造成腫瘤的一個重要原因與它抑制細胞中蛋白磷酸酶2A (PP2A)的活性密切相關。PP2A是細胞中一個重要的絲、蘇氨酸磷酸酶，可以通過調節底物蛋白激酶的活性來調節細胞多種生物學進程，包括細胞增殖、分化、凋亡和遷移。目前普遍認為PP2A是一個重要的抑癌因子。PP2A與相應蛋白激酶活性的平衡對維持細胞內環境的穩定至關重要。PP2A活性的喪失或者抑制會造成相應蛋白激酶的活性異常升高而導致腫瘤的發生。PP2A是一個異質三聯體，包括兩個常見組分，一個催化亞基(PP2A-C)和一個支架亞基(PP2A-A)組成催化中心二聚體，同時連接著一個由四種不同家族基因編碼的調節B亞基。SET蛋白能夠和PP2A-C結合，從而抑制PP2A磷酸酶活力。許多腫瘤細胞中SET蛋白往往過量表達，造成PP2A活性偏低，致使癌癥相關的蛋白激酶處于持續激活狀態從而引起細胞癌變。在本專利的技術背景中已經提到，蛋白激酶抑制劑雖然具有治療效果好，毒副作用低的優點，但也存在因蛋白激酶突變而耐藥的缺點。比如慢性粒細胞白血病(CML)是一種由費城染色體bcr-abl融合基因表達的大小為210KD的蛋白激酶BCR-ABLl導致的惡性腫瘤。BCR-ABLl蛋白能自磷酸化為P-BCR-ABL1，進而激活信號通路下游的蛋白激酶，導致白細胞數量大量增加，從而造成慢性粒細胞白血病。由于BCR-ABLl是造成CML的“元兇”，為了治療CML，各國科學家為研發出針對BCR-ABLl的蛋白激酶抑制劑進了不懈努力，2001年世界上第一個BCR-ABLl蛋白激酶抑制劑Imatinib (伊馬替尼)正式上市，Imatinib為CML的治療做出了重要貢獻。但在其臨床使用過程中，耐藥、停藥后復發等諸多問題也逐漸顯現。BCR-ABLl激酶點突變是導致Imatinib耐藥最常見的原因，這些激酶氨基酸點突變導致BCR-ABLl蛋白激酶域內的氨基酸替換，破壞Imatinib和BCR-ABLl蛋白的結合，直接或間接的造成Imatinib耐藥。為克服Imatinib耐藥，Dasatinib, Nilotinib等第二代BCR-ABLl蛋白激酶抑制劑相繼上市，它們能治療除T315I突變以外的幾乎所有激酶突變導致的耐藥CML。2012年，唯一能治療T315I突變耐藥CML的抑制劑Ponatinb也終于上市，但是，對于一些混合突變比如E255V/T315I雙突變，Ponatinb仍無能為力。有文獻報道包括CML在內的很多腫瘤細 胞中蛋白磷酸酶2A (PP2A)的活性較正常細胞明顯偏低，而且其活性偏低與其內源性抑制劑SET(I2PP2A)蛋白表達量異常增高有關。抑制PP2A磷酸酶活力。CML細胞中SET蛋白往往過量表達，造成PP2A活性偏低，BCR-ABLl等蛋白激酶處于持續激活狀態。采用PP2A激活劑(例如，Forskolin, FTY720, Ceramide)可以通過提高PP2A活性來使p-BCR-ABLl去磷酸化來治療包括耐藥CML在內的各種腫瘤疾病。說明影響SET/PP2A通路可以作為一個有效的克服因蛋白激酶突變導致耐藥的疾病的靶點。目前已有的PP2A激活劑的作用機制都是通過直接與PP2A相互作用進而提高細胞中PP2A的活性。而針對SET的小分子抑制劑尚未見報道。本發明為了找到苯氧基嘧啶衍生物作用的靶標，構建了苯氧基嘧啶衍生物-TGI1002(N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)_2_嘧啶氧基]-苯基]-3-(4-甲基哌嗪甲基)_苯酰胺)的小分子探針，并采用系列親和色譜法從慢性粒細胞白血病K562細胞裂解液中“垂釣”出了與TGI1002具有親和作用的蛋白質。通過SDS-PAGE分離、切膠酶解、MALD1-T0F-肽指紋質譜鑒定為SET蛋白。并通過PP2A活性測定，免疫共沉淀，免疫熒光，RNAi等方法確證了苯氧基嘧啶衍生物-TGI1002是通過干擾SET/PP2A之間的相互作用，提高細胞中PP2A的活性，改變細胞周期，促進細胞凋亡來治療與SET蛋白表達異常特別是因蛋白激酶突變導致的耐藥的相關疾病。[0007]方案中所述的SET蛋白表達異常相關的疾病主要包括但不限于:炎癥，神經退化性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病等。所述的炎癥包括但不限于中樞神經系統(CNS)炎癥，腸炎，關節炎等；神經退化疾病包括但不限于老年癡呆，阿爾茲海默癥和其他大腦神經紊亂性疾病；惡性腫瘤包括但不限于白血病，肝癌，結腸癌，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，骨肉瘤，絨毛膜癌，腎母細胞瘤等；自身免疫性疾病包括但不限于系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、硬皮病、自身免疫性溶血性貧血、慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合征、原發性膽汁性肝硬變、多發性腦脊髓硬化癥、急性特發性多神經炎等。
[0008]上述SET蛋白表達異常相關的疾病優選慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴細胞性白血病急性髓細胞性白血病(CLL)，急性淋巴細胞性白血病(ALL)或者B細胞非霍奇金性淋巴瘤。
[0009]上述慢性髓性白血病病包括但不限BCR-ABL陽性慢性髓性白血病。
[0010]上述BCR-ABL陽性慢性髓性白血病包括但不限于伊馬替尼耐藥慢性髓性白血病。
[0011]上述伊馬替尼耐藥慢性髓性白血病包括但不限于由BCR-ABL激酶域T315I突變導致的伊馬替尼耐藥慢性髓性白血病。
[0012]根據以上
【發明內容】
，只要具有如下通式苯氧基嘧啶母核的化合物均能通過本發明所述機制(即:結合SET蛋白，解離其與PP2A的相互作用，提高PP2A活性)發揮各種生物學功能，
【權利要求】
1.一類SET蛋白小分子抑制劑及其在治療SET蛋白表達異常相關疾病中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述應用為SET蛋白小分子抑制劑可通過抑制SET蛋白與PP2A之間的相互作用，提高細胞中PP2A的活性，降低與PP2A相互作用的蛋白激酶的磷酸化水平，促進細胞凋亡，改變細胞周期而發揮相應的生物學作用。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述SET蛋白小分子抑制劑具有如下結構通式:
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述SET蛋白小分子抑制劑為N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶氧基]-苯基]-3-(4-甲基哌嗪甲基)_苯酰胺。
5.根據權利要求1所述的應用，其中所述的SET蛋白小分子抑制劑為其藥用型鹽和/或與給藥載體組成的復合物并通過不同途徑對人體給藥。
6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述SET蛋白表達異常的疾病包括但不限于炎癥、神經退化性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病等。
7.根據權利要求書6所述的應用，其中所述的炎癥包括但不限于中樞神經系統(CNS)炎癥、腸炎、關節炎等。
8.根據權利要求書6所述的應用，其中所述的神經退化疾病包括但不限于老年癡呆、阿爾茲海默癥和其他大腦神經紊亂性疾病。
9.根據權利要求書6所述的應用，其中所述的惡性腫瘤包括但不限于白血病、肝癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、絨毛膜癌和腎母細胞瘤等。
10.根據權利要求書6所述的應用，其中所述的自身免疫性疾病包括但不限于系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、硬皮病、自身免疫性溶血性貧血、慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合征、原發性膽汁性肝硬變、多發性腦脊髓硬化癥、急性特發性多神經炎等。
【文檔編號】A61P1/16GK103893182SQ201410119076
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】陳依軍, 謝偉全, 彭志剛, 王淑珍 申請人:中國藥科大學