一種豬乙型腦炎病毒純化方法
【專利摘要】本發明提供了一種豬乙型腦炎病毒（JEV）純化方法，該方法綜合采用了微濾澄清純化法，超濾濃縮純化法，重復洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了JEV的回收效率，降低了純化成本。以本發明制備的豬乙型腦炎病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發明制備的豬乙型腦炎病毒濃縮液成品制備的疫苗相對于現有技術的豬乙型腦炎病毒疫苗而言，具有純凈度高，安全性高，均一性好、免疫效果好等優點。同時，本發明工藝簡便、成本較低，具有突出的規模化應用前景。
【專利說明】一種豬乙型腦炎病毒純化方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種病毒純化方法，尤其涉及一種豬乙型腦炎病毒純化方法。
【背景技術】
[0002]流行性乙型腦炎是由黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的一種人獸共患的疾病。豬被認為是本病最重要的自然增殖動物，能引起懷孕母豬發生流產、死胎、木乃伊胎，公豬發生睪丸炎；臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。豬乙型腦炎流行不僅給養豬業造成嚴重危害，而且還嚴重威脅人類健康。
[0003]疫苗是預防該病的主要方法之一。目前，我國商品化的豬乙型腦炎疫苗主要是鼠腦滅活疫苗和弱毒疫苗。其中以弱毒疫苗為主，其安全性和有效性主要受病毒滴度和抗原純凈性等因素的影響。商品化疫苗如果直接以細胞繁殖的病毒液進行成品苗的生產，會受到細胞破碎產物，培養基成分，細胞代謝產物等雜質的影響，致使疫苗免疫動物后易發生過敏反應，發熱反應等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原純凈性是提升疫苗質量基本途徑。
[0004]中空纖維膜過濾技術屬于切向流過濾技術(Tangential Flow Filtration, TFF)的范疇，又稱錯流過濾(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循環，小于膜孔徑的物質可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質會被膜截留，從而實現目標物質的濃縮以及不同物質的分級分離。
[0005]和傳統的平板膜包相比，中空纖維柱具有纖維管狀的開放式流道結構，無篩網的管狀流道結構避免了料液的無規則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，有利于保護病毒的完整性，防止病毒顆粒聚集的同時有助于雜蛋白的透過和去除。
[0006]目前，對于豬乙型腦炎病毒的中空纖維澄清純化及濃縮工藝尚無報道。

【發明內容】

[0007]本發明旨在解決現有豬乙型腦炎病毒疫苗均一性差、免疫效果差等技術問題，提供一種使用微濾澄清純化系統和超濾濃縮純化系統實現的豬乙型腦炎病毒純化方法。
[0008]為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案:
[0009]一種豬乙型腦炎病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統和超濾濃縮純化系統來實現，過程如下:
[0010]I系統的組裝
[0011]無菌條件下，將微濾澄清純化系統和超濾濃縮純化系統按照組裝要求進行組裝。在微濾澄清純化系統中可安裝無菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整無損的中空纖維微濾膜,在超濾濃縮純化系統中可安裝無菌100KD或300KD、完整無損的中空纖維超濾膜。
[0012]2系統完整性檢測
[0013] 壓力保持法檢測系統的完整性。[0014]3系統的處理
[0015]3.1清洗及滅菌
[0016]將0.5M NaOH溶液注滿系統的進料罐，浸泡處理20min，開啟循環泵300rpm，進行系統的清洗及滅菌處理30min。
[0017]3.2水洗及通量檢測
[0018]滅囷結束后，排盡系統內的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統的進料--!，開啟循環泵，300rpm循環30min，棄盡系統內的液體，如此反復水洗，直至系統內PH為7.0左右。
[0019]3.3PBS 處理
[0020]水洗結束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進料罐，開啟循環泵300rpm循環沖洗20min。
[0021]上述所述技術方案中，步驟3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、滅菌作用，也可選用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽滅菌的方式進行系統滅菌。[0022]一種豬乙型腦炎病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統和超濾濃縮純化系統來實現，該方法包括以下步驟:[0023]I)將無菌吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬乙型腦炎病毒液中，振蕩處理；
[0024]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統的進料罐中，開啟循環泵，循環一定時間后經0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；
[0025]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0026]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0027]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用；
[0028]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0029]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統的進料罐，開啟循環泵循環一定時間，經100KD或300KD中空纖維超濾柱進行過濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液；
[0030]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液；
[0031]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵，循環一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液；
[0032]10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵，循環一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
[0033]將上述制備的病毒濃縮液成品保存于_20°C。
[0034]上述豬乙型腦炎病毒純化方法，采用的是二步純化法，第一步通過較大孔徑的澄清純化濾膜過濾病毒液，除去毒液中的細胞碎片；第二步通過較小孔徑的澄清純化濾膜洗濾第一步的濾過液，達到除去病毒液中的吐溫20、小分子蛋白，細胞代謝產物的小分子物質等雜質及實現濃縮病毒等目的。[0035]上述豬乙型腦炎病毒純化方法，步驟I)所述的振蕩處理時間優選為IOmin ;步驟I)所述的比例優選為5% ;步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑優選為0.65 μ m ;步驟7)所述的超濾濾膜孔徑優選為300KD ;步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環泵循環一定時間的操作條件均優選為400rpm循環30min ;利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗；上述所述病毒澄清純化及濃縮方法，步驟2)中透過液的體積可以根據需要進行調整，優選為透過液體積達到原液的90% ;步驟7)中的濃縮倍數可以根據實際需要進行調整，優選為濃縮10倍以上。
[0036]上述技術方案中，步驟I)所述的豬乙型腦炎病毒液是指制備得到的病毒原液，未經稀釋處理；步驟I)加入吐溫20起到乳化作用，能夠有效避免病毒粒子聚集成團，從而提升后續過濾效率。
[0037]所述微濾澄清純化系統是指GE公司制造的FlexStand中空纖維澄清純化系統；所述微濾膜可以選自GE公司制造的、型號為CFP-6-D-9A，CFP-4-E-9A的Xample微濾柱膜；所述超濾膜可以選自GE公司制造的、型號為UFP-300-C-9A，UFP-100-C-9A的Xample超濾柱膜。
[0038]上述制備的病毒濃縮液成品的檢測方法如下:
[0039]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進行病毒滴度及蛋白濃度進行檢測，以分析濃縮工藝的有效性。其中病毒滴度的檢測方法為:
[0040]以觀察細胞病變測定TCID5tl的方法對各樣品的病毒滴度進行檢測，純化有效的判定標準為:濃縮純化及重復洗濾的洗濾液檢測不出存活病毒；濃縮液的病毒回收率在80%以上。
[0041]蛋白含量的測定方法為:
[0042]以蛋白濃度測定試劑盒對濃縮病毒液的蛋白殘存量進行測定，可溶性蛋白的殘存量應低于原液可溶性蛋白的10%,表明工藝有效。
[0043]以上對本發明的
【發明內容】
進行了詳細說明。本發明的純化方法綜合采用了微濾澄清純化法，超濾濃縮純化法，重復洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了 JEV的回收效率，降低了純化成本。以本發明制備的豬乙型腦炎病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發明制備的豬乙型腦炎病毒濃縮液成品制備的疫苗相對于現有技術的豬乙型腦炎病毒疫苗，具有純凈度高，安全性高，均一性好、免疫效果好等優點，同時,本發明工藝簡便、成本較低，具有突出的規模化應用前景。
【具體實施方式】
[0044]實施例中所用儀器型號如下:
[0045]FlexStand中空纖維澄清純化系統；
[0046]Xample 微濾柱:CFP-6-D_9A (0.65 μ m)，CFP-4-E-9A (0.45 μ m)；
[0047]Xample 超濾柱:UFP-300-C_9A (300KD)，UFP-100-C-9A (100KD)；
[0048]上述儀器均購自GE公司。
[0049] 實施例中所用試劑如下:
[0050]100L豬乙型腦炎病毒液，108-5TCID50/ml,由本公司生產；
[0051]BCA蛋白定量試劑盒，購自康為世紀。[0052]JEV抗體診斷試劑盒，北京生物制品研究所生產。
[0053]0.5M NaOHlOOL ；
[0054]無菌0.1M PBS100L ；
[0055]無菌高純水100L ；
[0056]吐溫20，分析純；
[0057]蔗糖明膠保護劑。
[0058]實施例1
[0059]I操作流程
[0060]1.1前處理
[0061]1.1.1系統的組裝
[0062]無菌條件下，將澄清純化系統和濃縮系統按照組裝要求進行組裝。在澄清系統中可安裝無菌0.65 μ m、完整 無損的中空纖維微濾膜，在濃縮系統中安裝孔徑為300KD的無菌中空纖維超濾膜。
[0063]1.1.2系統完整性檢測
[0064]壓力保持法檢測純化系統的完整性。
[0065]1.1.3系統的處理
[0066]清洗及滅菌:
[0067]將0.5M NaOH溶液注滿純化系統的進料罐，浸泡處理20min，開啟循環泵300rpm，進行系統的清洗及滅菌處理30min。
[0068]水洗及通量檢測:
[0069]滅囷結束后，排盡系統內的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統的進料--!，開啟循環泵，300rpm循環30min，棄盡系統內的液體，如此反復水洗，直至系統內PH為7.0左右。
[0070]PBS 處理:
[0071]水洗結束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進料罐，開啟循環泵300rpm循環沖洗20min。
[0072]1.2病毒的澄清純化
[0073]1.2.1病毒液的處理
[0074]將5L無菌的吐溫20加入100L豬乙型腦炎病毒(JEV)病毒液中，振蕩處理lOmin。
[0075]1.2.2病毒液的澄清
[0076]澄清系統處理完畢后，棄盡系統內的PBS溶液，將振蕩處理后的病毒液，注入澄清純化系統的進料罐中，開啟循環泵，400rpm循環30min,經0.65 μ m中空纖維微濾柱進行純化處理，收集透過液90L，進料罐內存留截留液10L。
[0077]1.2.3截留液的洗濾
[0078]第一次洗濾:
[0079]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵400rpm循環30min，收集透過液10L，記為洗濾液I。
[0080]第二次洗濾:
[0081]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵400rpm循環30min,收集透過液10L，記為洗濾液2。[0082]第三次洗濾:
[0083]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵400rpm循環30min,收集透過液10L，記為洗濾液3。
[0084]1.2.4病毒液的收集
[0085]將上述澄清純化過程所收集的透過液及三次洗濾液混合均勻，得到混合液120L。
[0086]1.2.5初級濃縮
[0087]濃縮系統處理完畢后，將混合液注入濃縮系統的進料罐，開啟循環泵，400rpm循環30min,經300KD中空纖維超濾柱進行純化處理,棄去透過液,進料罐中剩余截留液10L,記為初級濃縮病毒液。
[0088]1.2.6濃縮液的洗濾
[0089]第一次洗濾:
[0090]將10L0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮液中，重懸，開啟循環泵，400rpm循環30min，棄去透過液10L，進料罐中剩余截留液10L，記為二級濃縮病毒液。
[0091]第二次洗濾:
[0092]將10L0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮液，重懸，開啟循環泵，400rpm循環30min，棄去洗濾液10L，進料罐中剩余截留液10L，記為三級濃縮病毒液。
[0093]第三次洗濾:
[0094]將10L0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮液，重懸，開啟循環泵，400rpm循環30min，棄去洗濾液10L，進料罐中剩余截留液10L，即為病毒濃縮液成品。
[0095]2.2.7病毒液的收集
[0096]將經過上述處理后的得到的病毒濃縮液成品進行收集，保存于-20°C。
[0097]2有效性檢測
[0098]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進行病毒滴度及蛋白濃度進行檢測，以分析濃縮工藝的有效性。
[0099]2.1病毒滴度的檢測
[0100]以觀察細胞病變測定TCID5tl的方法對各樣品的病毒滴度進行檢測，具體步驟如下:
[0101]2.1.1細胞的鋪板及培養
[0102] 以0.05%的EDTA-胰酶將生長良好的檢測用幼倉鼠腎傳代細胞(BHK-21)進行消化，以細胞生長液重懸為I X IO5Ail并接種于96孔細胞培養板，100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細胞培養箱中培養24h。
[0103]2.1.2病毒的梯度稀釋
[0104]將各收集的毒液樣品取樣，以0.1M PBS進行10倍倍比稀釋10個梯度(10—1~10_10)。
[0105]2.1.3病毒的接種及培養
[0106]將稀釋后各梯度病毒液接種于步驟(1)所述的檢測用細胞，100 μ I/孔，每個梯度6個重復，同時設置不接病毒液的細胞對照，37°C，5%C02細胞培養箱中維持培養5~7天。
[0107]2.1.4統計并計算病毒滴度
[0108]統計出現細胞病變的孔數，以Reed-Muench法對豬乙型腦炎病毒的滴度(TCID5tl)進行計算，結果證實，濃縮后的病毒液的滴度明顯高于濃縮前的病毒液，濃縮階段的洗濾液及細胞對照組均無細胞病變，濃縮后病毒滴度達到109_°TCID5(l/ml，濃縮階段的洗濾液無效價，病毒回收率接近100%。
[0109]2.2可溶性蛋白的檢測
[0110]取各樣品以BCA蛋白濃度試劑盒進行測定，經計算可溶性蛋白殘存率為9.5%。
[0111]3疫苗制備
[0112]以上述工藝制備的病毒濃縮液作為原料，進一步制備疫苗，其工藝步驟如下:
[0113]3.1稀釋配苗
[0114]將純化濃縮后的JEV毒液以無菌的0.1M PBS進行稀釋，使其病毒滴度達到108_5TCID5ciAil，將純化前的 JEV病毒液(IO8 5TCID5cZml)與純化后的 JEV病毒液(IO8-5TCID50/ml)分別加入適宜的蔗糖明膠保護劑，進行配苗；將純化前的JEV病毒液和純化后的JEV病毒液制備的疫苗分別記為JEV滅活疫苗I和JEV滅活疫苗2。
[0115]3.2 凍干
[0116]將兩份配苗液，分別混合均勻，并分裝至西林瓶中，每瓶分裝2.3ml。使用相同的凍干程序(制品于_30°C以下預凍3h ;程序控溫:_18°C 30min ；-8°C 30min ；-8°C 15h ；0°C 30min ；0°C 5h ；10°C 2h ；25°C 30min ；25°C 4h)進行疫苗的凍干。
[0117]4疫苗安全檢驗
[0118]以上述工藝制備的JEV活疫苗I (純化前)，JEV活疫苗2 (純化后)，無菌0.1M PBS溶液作為實驗材料；以4~8日齡健康易感乳豬(JEV HI抗體陰性)12頭和10~12g SPF小鼠30只作為實驗動物。具體操作步驟如下:
[0119]4.1動物分組
[0120]將12頭仔豬隨機分為3組，每組4頭。
[0121]4.2疫苗免疫
[0122]4.2.1乳豬安全性檢驗分別肌肉注射兩種疫苗2ml (含10頭份)于實驗用乳豬，對照組注射2ml PBS,每組各注射4頭。觀察21日。
[0123]4.2.1小鼠安全性檢驗分別皮下注射兩種疫苗0.1ml(含0.5頭份)于實驗用小鼠，對照組注射0.1ml PBS,同時右側腦內空刺，每組各4頭，觀察14日。
[0124]4.3實驗結果
[0125]免疫后21日，各組乳豬均無因接種疫苗而出現的局部或全身不良反應；免疫后14日，各組小鼠均全部健活。
[0126]5疫苗效力檢驗
[0127]5.1凍干后疫苗病毒滴度的檢測
[0128] 將凍干后的JEV活疫苗I和JEV活疫苗2分別用Iml PBS溶解并進行病毒滴度的檢測，方法同“3.1”。結果凍干后JEV活疫苗I的滴度為107_67TCID5cZml，JEV活疫苗2為108 0TCID50/mL.即凍干后JEV活疫苗2 (純化后)的凍干損失率小于JEV活疫苗I (純化前)。
[0129]5.2后備母豬免疫試驗
[0130]以JEV活疫苗1，JEV活疫苗2，無菌0.1M PBS溶液作為實驗試劑，利用JEV抗體診斷試劑盒測定JEV HI抗體；取將70~80kg健康易感后備母豬(JEVHI抗體陰性)12頭作為實驗動物。具體實驗步驟如下:
[0131]5.2.1試驗動物分組
[0132]將12頭母豬隨機分為3組，每組4頭。
[0133]5.2.2疫苗免疫
[0134]分別頸部肌肉注射兩種疫苗及PBS2ml于試驗用后備母豬，每組各注射4頭。
[0135]5.2.3采血及抗體檢測
[0136]免疫之前及免疫后每周采血一次，共6次，分離血清，使用JEV抗體診斷試劑盒進行檢測。
[0137]5.2.4實驗結果
[0138]實驗結果表明，由JEV活疫苗2 (純化后)免疫的第二組母豬的抗體水平產生較早并高于JEV活疫苗I (純化前)。
[0139]綜上所述，利用本發明純化得到的豬乙型腦炎病毒濃縮純化液成品適用于制備豬乙型腦炎病毒疫苗，其安全性良好、免疫效力顯著。
[0140]實施例2
[0141]I)將無菌吐溫20按10%(v/v)的比例加入豬乙型腦炎病毒(JEV)病毒液中，振蕩處理IOmin ；
[0142]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統的進料罐中，開啟循環泵，循環一定時間后經0.45 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；
[0143]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液；
[0144]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0145]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用。
[0146]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0147]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統的進料罐，開啟循環泵循環一定時間，經100KD中空纖維超濾柱進行過濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液；
[0148]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液；
[0149]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵，循環一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液；
[0150]10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵，循環一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
[0151]實施例3
[0152]I)將無菌吐溫20按0.5%(v/v)的比例加入豬乙型腦炎病毒(JEV)病毒液中，振蕩處理IOmin ；
[0153] 2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統的進料罐中，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min,而后經0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾,收集透過液待用；[0154]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0155]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min，收集透過液，得到第二洗濾液待用存；
[0156]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min，收集透過液，得到第三洗濾液待用。
[0157]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0158]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮系統的進料罐，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min,經300KD中空纖維超濾柱進行超濾處理,棄去透過液,收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液；
[0159]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min,棄去透過液,收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮
病毒液；
[0160]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min,棄去洗濾液,收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮
病毒液；
[0161]10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵以400rpm的條件循環30min，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
[0162] 以上對本發明實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種豬乙型腦炎病毒純化方法，其特征在于使用微濾澄清純化系統和超濾濃縮純化系統實現病毒液的純化，并包括以下步驟: 1)將無菌吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬乙型腦炎病毒液中，振蕩處理； 2)將步驟1)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統的進料罐中，開啟循環泵，循環一定時間后經0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾,收集透過液待用； 3)以l:l(v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液待用； 4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用； 5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用； 6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液； 7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統的進料罐，開啟循環泵循環一定時間，經100KD或300KD中空纖維超濾柱進行過濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液； 8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵循環一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液； 9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵，循環一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液； 10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環泵，循環一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
2.根據根據權利要求1所述的一種豬乙型腦炎病毒純化方法，其特征在于步驟I)所述的振蕩處理時間為IOmin。
3.根據權利要求1所述的一種豬乙型腦炎病毒純化方法，其特征在于步驟I)所述的比例為5% ο
4.根據權利要求1所述的一種豬乙型腦炎病毒純化方法，其特征在于步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑為0.45或0.65 μ m,較優的為0.65 μ m。
5.根據權利要求1所述的一種豬乙型腦炎病毒純化方法，其特征在于步驟7)所述的超濾濾膜孔徑為300KD。
6.根據權利要求1所述的一種豬乙型腦炎病毒純化方法，其特征在于步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環泵循環一定時間的操作條件均為400rpm循環30min。
7.根據權利要求1~6所述的一種豬乙型腦炎病毒純化方法，其特征在于利用該方法制備的病毒濃縮液用于制備疫苗。
【文檔編號】A61K39/12GK103937757SQ201410145610
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優先權日:2014年4月11日
【發明者】丁旭娜, 吳全忠, 米娜, 李倬, 呂茂杰, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司