一種具有混合軸向配體的Pt（IV）類抗癌藥物及制備方法
【專利摘要】本發明公開一種具有混合軸向配體的Pt(IV)類抗癌藥物及制備方法；所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，具有八面體配位結構，即由兩對平面配體和一對混合軸向配體與Pt4+鍵合構成，所述的軸向配體一個為與Pt4+鍵合作用相對較強的配體，另一個為與Pt4+鍵合作用相對較弱的配體。采用這種強弱搭配的設計，使其與現有Pt(IV)藥物賽特鉑相比，相對較容易被還原為Pt(II)物種，具有相對較高的藥理活性。本發明實施例證明其與賽特鉑相比，在抗壞血酸、還原型谷胱甘肽以及DNA模式物種5’-dGMP共存的避光反應體系中，更容易生成Pt與鳥嘌呤N7位鍵合的產物，對于實現高效低毒的抗癌目標具有廣泛的應用前景。
【專利說明】—種具有混合軸向配體的Pt (IV)類抗癌藥物及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于化學合成新藥領域，涉及具有混合軸向配體的Pt(IV)類抗癌藥物及其制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥對人類健康的威脅極大，抗癌藥物研究一直受到廣泛關注。鉬基抗癌藥的靶分子是細胞內的脫氧核糖核酸(DNA)。鉬基藥物中的Pt與DNA中鳥嘌呤的N7原子鍵合后，可抑制DNA復制以及誘導細胞凋亡，從而達到抗癌效果。鉬基抗癌藥不僅對許多快速增殖的癌細胞比對正常細胞更敏感，對快速分裂的正常細胞(骨髓細胞、毛囊和上皮細胞)殺傷也較大，會導致不同程度的毒副作用。
[0003]鉬基抗癌藥物設計通常遵循如下原則:配位結構中必須包含Pt-N鍵，而且N原子應至少連接一個H。此H原子可與DNA中鳥嘌呤的06原子形成H鍵，是促使Pt與鳥嘌呤中的N7原子發生鍵合的必要條件。
[0004]根據配位中心的價態，鉬基抗癌藥可大體分為Pt(II)和Pt(IV)兩種類型。具有單核配位結構的Pt(II)抗癌藥的構型多為平面四方形，進入臨床階段的包括順鉬(Cisplatin)、卡鉬(Carboplatin)、草酸鉬(Oxaliplatin)、萘達鉬(Nedaplatin)、舒鉬(Sunpla)、洛鉬(Lobaplatin)、甲唳鉬(Picoplatin),雙環鉬(Dicycloplatin)等。除此之外，具有雙核結構的以及三核結構的Pt(II)藥物也受到關注；其中，具有3個正電荷的三核Pt (II)配位離子BBR3464已進入II期臨床實驗。Pt(II)藥物的藥理活性通常與水解動力學密切相關。以順鉬為例，具有正電荷的水解產物[Pt(NH3)2(H2O)Cl]+以及[Pt (NH3) 2 (H2O) 2]2+與DNA的反應活性遠高于未水解的順鉬Pt (NH3) 2C12。
`[0005]Pt(IV)抗癌藥的配位構型為八面體，分子結構中包括6個配位基團，使得藥物設計具有較大的靈活性，被認為是應用前景廣闊的新型抗癌藥。如圖1所示，進入臨床實驗的Pt(IV)抗癌藥包括1.異丙鉬(Iproplatin)、2.奧馬鉬(0rmaplatin)、3.賽特鉬(Satraplatin)以及4.LA-12。這些藥物的分子結構中均包含兩個相鄰的Pt-N配位鍵。Pt-N鍵的鍵能較強，通常將包含兩個Pt-N鍵的平面作為水平面，此水平面上下兩側的配體稱為軸向配體。
[0006]Pt (IV)抗癌藥直接與DNA發生取代反應的活性通常較低，需在生理環境中與抗壞血酸等還原性物種反應,失去兩個軸向配體,生成Pt (II)物種，再通過水解發揮抗癌活性。其中，軸向配體與Pt4+的鍵合強度顯著影響Pt(IV)抗癌藥還原為Pt(II)物種的反應活性。
[0007]奧馬鉬和異丙鉬的軸向配體分別為兩個與Pt4+鍵合較弱的Cr和0H-，這兩種藥物分別在臨床實驗的I期和III期階段被淘汰。賽特鉬與LA-12的結構相似，兩個軸向配體均為與Pt4+鍵合較強的0Ac_ ;處于水平面的配體中均包含兩個順式的Cl—和一個NH3,區別在于另一個配體分別為環己胺和金剛胺(三環癸胺XLA-12進入臨床實驗較晚，相關數據較為有限。賽特鉬是進入臨床治療的首例口服Pt (IV)抗癌藥，無神經毒性和腎毒性?？箟难?Vc )是生理環境中重要的還原性物種，但生理環境中廣泛存在的還原型谷胱甘肽(GSH)會抑制賽特鉬與抗壞血酸之間氧化還原反應。這可歸因于抗壞血酸與賽特鉬之間的氧化還原反應涉及到生成抗壞血酸自由基的步驟，而GSH具有清除自由基的功能，可導致抗壞血酸自由基濃度降低。另一方面，GSH自身還原賽特鉬的活性也不高。因此，與順鉬相比，賽特鉬的藥理活性尚有較大差距。
[0008]可以看出，不論是已被淘汰的奧馬鉬和異丙鉬，還是正處于臨床階段的賽特鉬和LA-12，Pt(IV)配位結構的兩個軸向配體分別由相同類型的基團組成。采用這種設計的一個不足之處是對Pt (IV)配合物氧化還原活性的可調控性相對有限。當兩個軸向配體均為與Pt4+鍵合較弱的基團時(比如，Cl_)，Pt(IV)配合物在生理環境中還原為Pt(II)物種的速率相對過快，容易導致較強的毒副作用；已在臨床實驗中被淘汰的奧馬鉬即屬于此種情況。另一方面，當兩個軸向配體均為與Pt4+鍵合較強的基團時(比如，0Ac_)，在生理環境中被還原為Pt(II)物種的速率相對較慢，導致藥理活性不高；這正是賽特鉬在臨床使用所面臨的問題。
[0009]綜上所述，采用相同類型軸向配體的Pt(IV)抗癌藥設計容易導致毒副作用過強或者藥理活性不高的問題。毋庸置疑，軸向配體設計是調控Pt (IV)藥物抗癌活性的一個關鍵環節。臨床研究表明，Pt(IV)抗癌藥賽特鉬具有毒副作用較低的優點，但藥理活性不高的問題亟待解決。
[0010]本發明利用Pt (IV)抗癌藥設計較為靈活的特點，將與Pt4+鍵合強度不同的配體進行組合，調控Pt (IV)配合物的藥理活性，設計并制備具有混合類型軸向配體的新型Pt (IV)類抗癌藥。與賽特鉬相比，具有混合類型軸向配體的新型Pt(IV)藥物在抗壞血酸、還原型谷胱甘肽以及DNA模式物種5’-dGMP共存的避光反應體系中，相對更容易生成Pt與鳥嘌呤N7位鍵合的產物，對于解決現有Pt(IV)抗癌藥賽特鉬藥理活性較低問題具有重要意義。

【發明內容】

[0011]本發明的目的是針對現有Pt(IV)臨床抗癌藥物賽特鉬藥理活性較低的問題，提出一種具有混合軸向配體的新型Pt(IV)類抗癌藥物結構設計及制備方法。與賽特鉬相比，本發明所設計和制備的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物在抗壞血酸、還原型谷胱甘肽以及5’-dGMP共存的避光反應體系中，生成Pt與鳥嘌呤N7位鍵合產物的活性明顯增強，對于實現高效低毒的抗癌目標具有重要意義和廣泛的應用前景。
[0012]本發明所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，具有八面體配位結構，即由兩對平面配體和一對混合軸向配體與Pt4+鍵合構成，其具有高效低毒的特點，是通過以下技術方案實現的:即所述的一對混合軸向配體分別為配體I和配體II，且配體與Pt4+的鍵合強度順序為:氨>配體I >配體II。
[0013]所述的Pt(IV)類抗癌藥物的軸向配體一個為與Pt4+鍵合作用相對較強的配體，另一個為與Pt4+鍵合作用相對較弱的配體，采用這種強弱搭配的設計，使其與賽特鉬相比，在還原反應過程中失去兩個軸向配體的活化能有所降低，相對較容易被還原為Pt(II)物種。
[0014]對于上文所述 的技術方案中所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，優選的情況下，所述的配體I為0Ac_，配體II為Η20、0Η_或Cr。即:0Ac_為與Pt4+鍵合作用相對較強的配體，H2O, or或cr為與Pt4+鍵合作用相對較弱的配體。
[0015]對于上文所述的技術方案中所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，優選的情況下，所述的兩對平面配體中，其中一對為鄰位的氨/胺基；另外一對配體中，其一為H2O, Cl—或0H_，另一配體為Cl—或0H_。當這兩個平面配體包括電中性的H2O時，Pt (IV)配位結構的正電荷相對較強，與抗壞血酸根陰離子的反應活性也相對較高。
[0016]對于上文所述的技術方案中所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，優選的情況下，所述的氨/胺基分別為鄰位的NH3和環己胺。這種平面配體中的氨/胺基沿用賽特鉬中相鄰的NH3和環己胺設計，以使Pt (IV)配位結構具有較好的脂溶性以及細胞膜穿透性。
[0017]本發明附圖2給出了軸向配體由OAcIP H2O組成的Pt(IV)類藥物的四種同分異構體5，6，7，8的示意圖。其中，平面配體中氨/胺基由鄰位的NH3和環己胺組成，其余兩個平面配體由一個H2O和一個CF組成。配位結構的整體電荷為2+。在GSH共存條件下，這種具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物與抗壞血酸發生氧化還原反應，失去兩個軸向配體的活性明顯高于賽特鉬。在其它配體保持不變，軸向配體中的H2O被替換為Cl—(或0H_)時，所得到的具有混合軸向配體的Pt(IV)配合物與抗壞血酸發生氧化還原反應的速率也明顯高于賽特鉬，但低于圖2中的5，6，7，8。
[0018]本發明的另一方面在于:公開上文所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物的制備方法，其包括以下操作步驟:在避光及室溫條件下配制賽特鉬水溶液，其濃度范圍介于10 μ M至飽和濃度；并采用波長390~450nm的光對其進行輻照；當檢測參與配位的0Ac_與已解離的OAc—之間的比例介于1.3~1.0時，停止輻照，將溶液避光保存。
[0019]得到包含本發明所述的軸向配體由0Ac_和H2O組成的具有混合軸向配體的Pt (IV)類藥物的溶液。輻照時間過短會導致賽特鉬的轉化率較低，輻照時間過長會導致OAc—與H2O的配體交換程度過大 。
[0020]對于上文所述的技術方案中所述的方法，檢測參與配位的OAcT與已解離的OAcT之間的濃度比例可以通過1H核磁共振波譜、離子色譜、毛細管電泳、高效液相色譜等方法。其中，使用1H核磁共振波譜法，可直接通過0Ac_e纟以及0AC_WiS所對應的譜峰積分面積比求算二者的濃度比；采用離子色譜、毛細管電泳、高效液相色譜檢測時，可根據0Ac_的標準曲線以及0Ac_lw的譜峰面積測出溶液中0Ac_lw濃度，然后在已知0Ac_總量(賽特鉬溶液原始濃度的2倍)條件下,通過OAcT鍵合/0Α0-Μ;? = (0Α0-總量-OAcT解；jjVOAcT解貞的關系式求算。
[0021]對于上文所述的技術方案中所述的方法，優選的情況下，所述的賽特鉬水溶液濃度為100 μ M至飽和濃度。最優選的情況下，賽特鉬水溶液濃度為飽和濃度。
[0022]對于上文所述的技術方案中所述的方法，優選的情況下，所述的賽特鉬水溶液進行輻照的波長范圍為415~450nm。
[0023]對于上文所述的技術方案中所述的方法，優選的情況下，所述的當檢測參與配位的OAcT與已解離的OAcT之間的比例介于1.1~1.0時，停止輻照。
[0024]上文所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物的藥理活性表征結果為:
[0025]在GSH、抗壞血酸以及DNA模式物種5’-dGMP共存的避光條件下，將包含本發明所述的混合軸向配體由0Ac_和H2O組成的Pt (IV)類藥物的溶液與總鉬濃度相同的賽特鉬溶液進行反應活性對比。1H核磁共振波譜顯示，與添加賽特鉬的對照體系相比，添加具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物的反應體系中，Pt與5’ -dGMP中鳥嘌呤N7位的鍵合作用顯著增強，確證具有混合軸向配體的Pt(IV)類配合物的藥理活性明顯強于賽特鉬，對于提高Pt (IV)藥物的抗癌效果以及豐富治療方案具有重要意義。
[0026]本發明的有益效果是:
[0027]本發明利用Pt(IV)配合物的結構調變性較為豐富的優勢，采取強弱配體搭配方案，將與Pt4+鍵合強度不同的配體進行組合，調控Pt (IV)配合物的藥理活性，設計并制備具有混合類型軸向配體的Pt(IV)類抗癌藥。與Pt4+鍵合能力較弱的軸向配體(比如H2O或0H_、C1_等)的引入，可避免賽特鉬所面臨的還原過程易受抑制所導致的藥理活性較低問題；與Pt4+鍵合能力較強的軸向配體0Ac_的引入，可避免Pt (IV)配位結構在生理環境中還原較快所導致的毒副作用較強的問題。在Pt(IV)配位結構的平面配體中引入一個H2O,可增強配位結構的正電性，提高其與抗壞血酸根離子的反應活性。在含N配位基團中，沿用賽特鉬中NH3和環己胺的混胺設計，保留脂溶性較好等特點。
[0028]在GSH、抗壞血酸、DNA模式物種5’ -dGMP共存的避光反應體系中，將包含本發明所述的混合軸向配體由OAcIP H2O組成的Pt(IV)類藥物的溶液與總鉬濃度相同的賽特鉬進行活性對比實驗。與添加賽特鉬的對照體系相比，添加本發明所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物反應體系中，Pt與5’ -dGMP中鳥嘌呤N7位的鍵合作用顯著增強，確證具有混合軸向配體的Pt(IV)類配合物的藥理活性明顯強于賽特鉬，對于提高Pt (IV)藥物的抗癌效果以及豐富治療方案具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1:進入臨床實驗的四種Pt (IV)抗癌藥結構示意圖。
[0030]圖2:具有混合軸向配體的Pt(IV)抗癌藥的四種同分異構體結構圖。
[0031]圖3:臨床實驗中賽特鉬的四種主要代謝產物的結構圖。
[0032]圖4:激發d-d躍遷導致八面體配位`結構的配位鍵活化示意圖。
[0033]圖5:賽特鉬的紫外可見吸收光譜。
[0034]圖6:不同波長輻照光的PL譜。
[0035]圖7:HPLC譜圖對比。(a)新配制，(b)避光加熱，(c)輻照后的賽特鉬溶液。
[0036]圖8:賽特鉬轉化率隨輻照時間的變化。
[0037]圖9:0Ac_配位/0Ac_解離隨輻照時間的變化。
[0038]圖10 =1H核磁共振波譜。(a)未經輻照的賽特鉬溶液，(b)制備的包含具有混合軸向配體的Pt(IV)類抗癌藥溶液，OAc-配位/OAc-解離=1.3:1.00
[0039]圖11 =1H核磁共振波譜。賽特鉬在5’_dGMP、抗壞血酸及GSH混合體系中的避光反應活性。(a) 2天后，與Pt鍵合的5’ -dGMP為3% ; (b) I周后，與Pt鍵合的5’ -dGMP為6% ；(c) 2天后，OAcT配位/OAcT解離為24:1 ; (d) I周后，OAcT配位/OAcT解離為10:1。
[0040]圖12:?核磁共振波譜。具有混合軸向配體的Pt (IV)類抗癌藥在5’ -dGMP、抗壞血酸及GSH混合體系中的避光反應活性。(a) 2天后，與Pt鍵合的5’ -dGMP為20% ; (b) I周后，與Pt鍵合的5’ -dGMP為51% ； (c) 2天后，OAcT配位/OAcT解離為1:1 ； (d) I周后，OAcWOAc解離為2:3。
【具體實施方式】
[0041 ] 下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0042]本發明所述具有混合軸向配體的Pt(IV)類抗癌藥物設計，是基于以下原理進行的:
[0043](一)賽特鉬在生理環境中的還原反應易受抑制的原因分析
[0044]Pt(IV)抗癌藥物在生理環境中與抗壞血酸等還原性物種反應，失去兩個軸向配體，生成Pt(II)物種的步驟是發揮藥理活性的重要環節。賽特鉬的軸向配體為兩個乙酸根(0Ac_)。0Ac_具有π型空軌道，不僅0Ac_的孤對電子可占據Pt4+的空軌道生成σ配位鍵，Pt4+的d軌道也可與0Ac_配體中未占據的π *反鍵軌道重疊，生成反配位Ji鍵。這種σ配位鍵和反配位η鍵合稱σ-π配鍵，使得軸向配體OAc—與 Pt4+的鍵合作用相對較強；此外，0Ac_可與平面配體中的NH3以及C6H11-NH2形成分子內氫鍵，使得Pt4+與0Ac_的鍵合作用進一步增強。
[0045]另一方面，Pt (IV)抗癌藥物在生理環境與抗壞血酸發生氧化還原反應的過程涉及到生成抗壞血酸自由基的步驟；由于生理環境中廣泛存在的GSH具有清除自由基的功能，對Pt (IV)抗癌藥物與抗壞血酸之間的氧化還原反應產生一定抑制作用。賽特鉬的兩個軸向配體均為與Pt4+鍵合較強的0Ac_，因此在生理環境中失去兩個軸向配體，生成Pt (II)物種的速率相對較慢，導致其藥理活性與順鉬相比，尚有較大差距。
[0046]如圖3所示，在賽特鉬的臨床實驗中，可檢測到的代謝產物主要包括:失去兩個軸向配體的還原產物9.JMl 18，兩個Cl—配體全部被0H_取代的10.JM383以及只有一個Cl_配體被0H_取代的同分異構體11.JM518和12.JM559。這些結果表明，賽特鉬的還原反應主要涉及兩個軸向配體的離去過程，同時也印證了軸向配體0Ac_與Pt4+之間具有較強的鍵合作用。
[0047]綜上所述，合理調控鉬基藥物的構效關系，設計新型的Pt (IV)配位結構，適度增強其與抗壞血酸發生氧化還原反應的活性，對于實現高效低毒的抗癌目標具有重要意義。
[0048](二)具有混合軸向配體的Pt (IV)類配位結構設計
[0049]Pt(IV)配位結構中的Pt4+具有較強的正電荷。在配位原子相同條件下，Pt4+對電中性配體(比如，H20)的吸引力明顯弱于對陰離子型配體(比如，0Ac_)的吸引力；尤其地,H2O不能與Pt4+生成鍵合強度較高的σ-π配鍵。因此，對于Pt(IV)配位結構的還原反應，軸向配體為H2O時，其脫離Pt4+所需克服的活化能會顯著低于軸向0Ac_配體。另一方面，抗壞血酸在生理pH條件下主要以一元酸根離子形式存在。在Pt(IV)配位結構中引入電中性的H2O,可增強配位結構的正電性，有利于其與抗壞血酸根陰離子的相互作用。
[0050]本發明所設計的Pt (IV)類藥物，其所述的軸向配體由與Pt4+鍵合強度不同的配體
I和配體II組成，且配體與Pt4+的鍵合強度順序為:氨>配體I >配體II ;優選的情況下，所述的配體I為0Ac_，配體II為h2o、or或Cr。即:0Ac_為與Pt4+鍵合作用相對較強的配體，Η20、0Η_或Cr為與Pt4+鍵合作用相對較弱的配體。與兩個軸向配體均為0Ac_的賽特鉬相比，這種具有混合類型軸向配體的Pt(IV)類藥物與抗壞血酸發生氧化還原反應的活性相對較強，其藥理活性明顯強于賽特鉬；另一方面，由于在軸向配體中包含一個與Pt4+配位能力較強的0Ac_，可避免在生理環境中還原速率過快所導致的毒副作用問題。
[0051]本發明所設計的Pt(IV)類藥物，其所述的兩對平面配體中，一對為氨/胺基；優選的情況下，所述的一對氨/胺基配體為鄰位的NH3和環己胺，使得本發明所設計的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥具有與賽特鉬類似的脂溶性和細胞穿透性。另外一對平面配體中，其一為H20、CF或0H_，另一配體為Cr或0H_。
[0052]當混合軸向配體為0Ac_和H2O, —對平面配體為鄰位的NH3和環己胺，其它兩個平面配體分別為Cl—和H2O時，得到如圖2所示四種同分異構體。
[0053](三)本發明所述的軸向配體由0Ac_和H2O組成的Pt(IV)類藥物的制備，是基于以下原理進行的:
[0054]采用賽特鉬作為制備原料，在水溶液體系中使用特定波長的輻照光激發其d-d躍遷，通過控制輻照強度和時間，得到如圖2所示的軸向配體包含一個OAc-和一個H2O的Pt(IV)類抗癌藥。相關原理如下:
[0055]Pt (IV)抗癌藥配位中心的Pt4+通過d2sp3軌道雜化與配體形成八面體配位結構，最高占據軌道(HOMO)和最低未占據軌道(LUMO)分別為2t2g(xy，xz, yz)和2eg(z2，x2-y2)。在處于基態時，Pt4+的5d6低自旋電子占據2t2g(xy, xz, yz)軌道，電子云伸展方向與6個配位鍵的恰好錯開，能量較低。
[0056]如圖4所示，具有eg特征的dz2和dx2-y2的軌道伸展方向與配位鍵重疊。發生d_d躍遷時，2t2g(xy, xz, yz)軌道的電子被激發至2eg(z2，x2_y2)軌道,與配位鍵電子產生相互排斥作用，導致配位鍵的能量升高(被活化)。其中，占據2eg(x2-y2)軌道的激發電子所導致的能量升高效應被xy平面的四個配位鍵所分散；占據2eg(z2)軌道的激發電子所導致的能量升高效應被土z方向上的兩個軸向配位鍵所分散。因此，對賽特鉬而言，d-d躍遷對軸向配位鍵的活化相對更顯著，更有利于促進軸向配體OAc-與溶液中H2O的配體交換。
[0057]賽特鉬的配位平面中，Pt-Cl鍵強度明顯弱于Pt-N鍵。在避光的水溶液體系中，賽特鉬可發生緩慢的C1_/H20配體交換。發生d-d躍遷時，被激發至2eg(x2-y2)軌道的電子對Pt-Cl鍵的活化作用，`導致C1_/H20配體交換速率增大。由于Pt-N鍵的穩定性顯著高于Pt-Cl鍵，占據2eg(x2-y2)軌道的激發電子對賽特鉬中Pt-N鍵的活化作用較弱。
[0058]通過調控激發d-d躍遷的輻照條件，使得賽特鉬分子中一個軸向0Ac_與水發生配體交換，同時保留一個0Ac_與Pt4+鍵合，可制備得到本發明所述的具有混合軸向配體的鉬基抗癌藥。
[0059]實施例一
[0060]本發明所述具有混合軸向配體的鉬基抗癌藥物的制備條件控制，是基于以下方式進行的:
[0061]( I)在避光及室溫條件下配制賽特鉬飽和水溶液，并測定其紫外可見吸收光譜。測試儀器為JASC0550紫外可見吸收光譜儀。如圖5所示，當波長小于450nm時，開始檢測到對入射光的吸收，隨著入射光波長的減小，吸光強度逐漸增大；入射光波長大于450nm時，賽特鉬水溶液對入射光無明顯吸收，表明激發賽特鉬d-d躍遷的輻照光的波長上限為450nm。
[0062](2 )分別采用紫光(415nm，半峰寬12nm)、藍光(477nm，半峰寬22nm)、綠光(528nm，半峰寬32nm)以及黃光(610nm，半峰寬32nm)輻照所配制的賽特鉬水溶液。輻照光的PL譜由圖6給出，測試儀器為北京漢光500光譜儀。采用藍光、綠光以及黃光輻照時，賽特鉬溶液的紫外可見吸收光譜均未發生變化。采用紫光輻照時，觀測到賽特鉬溶液的紫外可見吸收譜強度減弱以及峰位藍移；停止輻照后吸收譜不再發生變化，表明吸收譜變化與紫光輻照密切相關，確證波長為415nm的紫光作為激發賽特鉬的d_d躍遷的輻照光。選取390_450nm作為適合激發賽特鉬d-d躍遷的輻照光波長范圍。根據d-d躍遷對賽特鉬中配位鍵的活化機制，在d-d躍遷可被激發的前提下，采用波長相對較長(能量相對較低)的激發光有利于保護Pt(IV)配位結構中的Pt-N鍵。因此，波長范圍為415-450nm的輻照光更為優選。當波長小于390nm時，也可激發賽特鉬的d_d躍遷，但是對Pt-N的活化效應相對較強。
[0063](3)測定不同輻照時間后賽特鉬溶液中游離的NH3, OAc以及Cl_的濃度。結果顯示，輻照過程中游離0Ac_，Cl—以及NH3的摩爾濃度增加速率比約為11:10:2，表明d_d躍遷顯著促進了賽特鉬的軸向配體OAc-與水的配體交換；與此同時，C17H20配體交換也較顯著。作為對照，在避光及60°C條件下，對賽特鉬水溶液加熱24h后，溶液中游離Cl—濃度明顯增加，表明避光加熱可促進C1_/H20配體交換，未檢測到游離0Ac_和NH3,確證賽特鉬中的Pt-N鍵和Pt-O鍵在避光加熱條件下較穩定。測試儀器為配備電導檢測器的DIONEX ICS90離子色譜儀。采用1nPac AS23柱測定Cr和OAcT，流動相為4.5mM Na2COjP0.8mM NaHCO3,流速為lml/min ;采用Cs_12柱測定游離的NH3，流動相為20mM甲基磺酸，流速為lml/min。
[0064](4)采用高效液相色譜儀，分別測定避光加熱以及紫光輻照后的賽特鉬溶液；如圖7所示，避光加熱后的賽特鉬溶液中檢測到只發生C17H20配體交換的產物(保留時間
2.78min)以及尚未反應的賽特鉬(保留時間4.89min);在ClVH2O以及0Ac_/H20配體交換均較顯著的紫光輻照后的溶液中，未檢測出賽特鉬只發生C17H20配體交換的產物，表明賽特鉬在紫光輻照過程中同時發生C1_/H20和0AC_/H20配體交換的過程較顯著。測試儀器為Waters600高效液相色譜儀。采用SunFire? C18反相柱，柱溫30°C;2489紫外檢測器，檢測波長220nm ;流動相為甲醇(500 μ 1.mirT1),高純水(150 μ 1-min^1)以及0.05%三氟乙酸水溶液(350 μ I.mirT1)。
[0065](5)根據高效液相色譜的積分面積得出賽特鉬轉化率與輻照時間的對應關系，結果由圖8給出，觀測到賽特伯轉化率隨輻照時間延長逐漸增加，未出現明顯拐點。
[0066](6)賽特鉬中Pt-OAc配位鍵解離程度隨輻照時間的變化。相關原理如下:與Pt4+配位的0Ac_中013對應于化學位移2.1lppm處的單強峰。當Pt_0Ac_配位鍵解離后,2.1lppm處的單強峰減弱；與此同時，解離的OAc—導致相鄰的高場區域出現一個新的單強峰。由于OAc中甲基信號的積分面積與含量成正比,通過OAc 以及OAc @冑所對應的單強峰積分面積比，可測定二者的濃度比。測試儀器為Jeol JNM-ECA600M核磁共振波譜儀。
[0067]如圖9所示，參與配位的0Ac_與已解離的0Ac_之間的濃度比隨輻照時間增加而下降。當二者濃度比值降至1.1后，繼續延長輻照時間，進一步的比值變化不顯著，表明紫光輻照所導致的賽特鉬中兩個軸向OAc-配體的解離為依次進行。當第一個OAc-軸向配體發生解離后，Pt (IV)配位結構整體正電荷增加，對負電性陰離子配體的吸引作用相應增大，導致第二個0Ac_軸向配體脫離Pt (IV)配位結構的活化能明顯高于第一個軸向0Ac_配體。當參與配位的0Ac_與已解離的0Ac_之間的濃度比值降至1.1-1.0范圍時，停止輻照并將溶液避光保存，可得到本發明所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物的溶液。當參與配位的0Ac_與已解離的0Ac_之間的比例為1.3時，也可得到具有混合軸向配體的Pt (IV)類藥物，但賽特鉬的轉化率稍低。
[0068](7)采用1H核磁共振波譜對比具有混合軸向配體的Pt (IV)配合物以及賽特鉬的藥理活性:選取5’ -脫氧鳥苷酸(5’ -dGMP)作為含有鳥嘌呤的DNA模式物種，在抗壞血酸(1.0OmM)和還原型谷胱甘肽(0.25mM)共存條件下，將5’ -脫氧鳥苷酸(1.0OmM)分別與賽特鉬飽和溶液以及總鉬濃度相同的具有混合軸向配體的Pt(IV)配合物進行避光反應，對比兩種反應體系中Pt與5’ -dGMP中鳥嘌呤N7位鍵合的活性。
[0069]相關藥理活性表征原理為:在1H-NMR譜中，未與Pt鍵合的鳥嘌呤的H8原子對應于化學位移為8.14ppm處的單峰；當Pt與5’ -dGMP中鳥嘌呤的N7原子發生鍵合后，8.14ppm處的HS信號減弱；同時，與Pt鍵合的鳥嘌呤導致在相鄰的低場區域出現新的HS信號。因此，通過HS信號的變化，可對比Pt與鳥嘌呤中N7位發生鍵合的百分數。
[0070]賽特鉬飽和溶液的1H核磁共振波譜如圖10(a)所示，可觀測到0AC_sft對應的單強峰，未檢測到0AC_WiS信號。使用紫光對上述賽特鉬飽和溶液輻照后，0AC_sft的譜峰減弱；與此同時，相鄰的高場區域出現0Ac_解離的單強峰信號；如圖10(b)所示，當0Ac_s位與OAcTw離之間濃度比降至1.3:1.0時，停止輻照，得到包含具有混合軸向配體的Pt(IV)配合物的溶液。
[0071]如圖11 (a)及(b)中的H8譜峰信號所示，賽特鉬飽和溶液與5’-dGMP(1.0OmM)，抗壞血酸(1.0OmM),GSH (0.25mM)避光反應2天以及一周后，與Pt鍵合的5’-dGMP的比例分別約為3%和6% ;如圖11中譜圖(c)及(d)中0Ac_譜峰信號所示，避光反應2天以及一周后，OAcT配位:OAcT解離分別為24:1及10:1。
[0072]如圖12(a)及(b)中的H8譜峰信號所示，包含具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物的溶液(OAcT配位:OAc^w=L 3:1.0)與 5’_dGMP(l.0OmM)，抗壞血酸(1.0OmM),GSH (0.25mM)避光反應2天以及一周后，與Pt鍵合的5’-dGMP的比例分別達到20%和51% ;如圖12中譜圖(c)及(d)中0Ac_譜峰信號所示,避光反應2天以及一周后，0Ac_Kft:0Ac_lw分別為1:1及 2:3。
[0073]圖11及12的對比結果表明，與賽特鉬相比，所制備的具有混合軸向配體的Pt (IV)類藥物在抗壞血酸、還原型谷胱甘肽以及5’ dGMP共存的避光反應體系中，較易發生軸向0Ac_配體的解離，還原為`Pt(II)物種，藥理活性也明顯強于賽特鉬。
[0074]測試儀器為Jeol JNM-ECA600M核磁共振波譜儀。在藥理活性對比研究中，為提高1H核磁共振波譜檢測的信噪比，以及避免反應體系中GSH中活潑H可能對鳥嘌呤HS信號測定產生的干擾，使用重水為溶劑，進行賽特鉬、5’ -dGMP、抗壞血酸以及GSH溶液的配制，相關d-d躍遷對重水溶液中賽特鉬配體交換的影響機制與使用水作為溶劑時相同。
[0075]上述實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。
【權利要求】
1.一種具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，由兩對平面配體和一對混合軸向配體與Pt4+鍵合構成，其特征在于，所述的一對混合軸向配體分別為配體I和配體II，且與Pt4+的鍵合強度順序為:氨>配體I >配體II。
2.根據權利要求1所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，其特征在于，所述的配體 I 為 OAc_,配體 II 為 H2O、 0H_-或 Cl-。
3.根據權利要求1所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，其特征在于，所述的兩對平面配體中，其中一對為鄰位的氨/胺基；另外一對配體中，其一為h2o、C1-或oh-，另一配體為C1-或0H_。
4.根據權利要求3所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物，其特征在于，所述的氨/胺基分別為鄰位的NH3和環己胺。
5.如權利要求1所述的具有混合軸向配體的Pt(IV)類藥物的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟:在避光及室溫條件下配制賽特鉬水溶液，其濃度范圍介于10 μ M至飽和濃度；并采用波長390~450nm的光對其進行輻照；當檢測參與配位的0Ac_與已解離的0Ac-間的比例介于1.3~1.0時，停止輻照，將溶液避光保存。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的賽特鉬水溶液濃度為100μ M至飽和濃度。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的賽特鉬水溶液進行輻照的波長范圍為415~450nm。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，當所述的檢測參與配位的0Ac-與已解離的OAc-之間的比例介于1.1~1.0時，停止輻照。
【文檔編號】A61P35/00GK103860539SQ201410148904
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】于迎濤 申請人:于迎濤