一種增強成骨活性的復合人工骨及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種增強成骨活性的復合人工骨及其制備方法。人體骨植入材料需要在植入部位提供一定的抗壓支持，維持并提供細胞增長攀爬的空間結構，另外，還需提供與天然骨相類似的微環境，利于細胞的粘附、增殖與分化，引導血管的長入，最終介導新生骨的生成。本發明配制膠原蛋白水溶液，添加納米羥基磷灰石充分混勻移至模具，4℃中預凍、-20℃預凍、-80℃預凍后真空冷凍干燥，置于多酚溶液中孵育，再次4℃中預凍、-20℃預凍、-80℃預凍后真空冷凍干燥。本發明利用橄欖橄欖多酚進行交聯，一方面利用鍵合作用提高了支架材料的力學性能，另一方面，利用橄欖橄欖多酚較高的抗氧化活性及促進成骨性能，大大的提高了人工骨支架材料的成骨活性。
【專利說明】一種增強成骨活性的復合人工骨及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物醫學材料，具體涉及一種增強成骨活性的復合人工骨及其制備方法。
【背景技術】
[0002]由于骨關節壞死、股骨頭壞死、創傷、感染、腫瘤切除等造成的骨缺損，以及在整形外科、頜面修復等手術中，對骨支架材料的需求不斷增大。常用的自體骨、異體骨移植均存在不同程度上的不足，例如，自體骨移植雖然沒有免疫排斥反應且具有較好的骨誘導性，但自體骨移植來源受限，且會給病患帶來二次創傷的痛苦；異體骨移植免疫排斥反應大，引起病毒傳播感染，存在安全隱患。研究合成具有優良生物相容性、能夠促進骨細胞粘附、增殖、分化、生長及介導新骨組織形成的人工骨支架材料成為了一種趨勢。
[0003]膠原蛋白是天然骨成分之一，具有良好的生物相容性、低免疫原性，能夠很好的促進細胞的粘附與增殖，其作為一種生物高分子物質，具有一般蛋白質的化學性質，可以發生氨基反應、羧基反應、羥基反應、顯色反應及交聯反應等。類人膠原蛋白是利用基因工程方法制備得到的一種人源性蛋白，它是將人體膠原蛋白的mRNA逆轉錄成cDNA經酶切后重組于E.coli (大腸桿菌)體內，再經高密度發酵、分離、復性、純化等工藝獲得的一種生物高分子蛋白。它具有膠原蛋白的一般性質，具有良好的生物相容性，促細胞粘附、生長的特性。 [0004]羥基磷灰石天然骨主要組分中的另一種重要組成物質，其不僅具有良好的生物相容性及生物活性，而且具有良好的骨誘導和骨傳導性能，能與骨組織較好的結合，有利于支架材料才與機體的應答過程。
[0005]多酚已經被作為一種交聯劑用在蛋白的交聯上，以提高蛋白之間的強度、降解性等。尤其的，橄欖多酚，屬于裂環烯醚萜類，對于骨骼的發育較好的功能，它能促進人體對鈣質等礦物質的吸收來保持骨密度和預防骨質疏松的發生。另外，橄欖多酚具有較高的抗氧化活性，而具有較高的抗氧化活性的物質能夠降低某一類活性因子的釋放來促進骨的重建過程。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種增強成骨活性的復合人工骨及其制備方法，改善細胞與植入支架材料的應答過程，提高植入物的生物活性及生物相容性，更好的引導新骨的構建。
[0007]本發明所采用的技術方案是:
一種增強成骨活性的復合人工骨的制備方法，其特征在于:
由以下步驟實現:
步驟一:用去離子水配制質量分數為10%_25%的膠原蛋白水溶液；
步驟二:將納米羥基磷灰石粉末分批加入膠原蛋白水溶液中，膠原蛋白與羥基磷灰石的質量比是1: (2-4)，室溫下于漩渦震蕩儀上充分混勻；
步驟三:將步驟三得到的混合物迅速轉移至模具中；步驟四:將模具于4°C中預凍20-60min，依次移至_20°C預凍l_2h，轉移至_80°C預凍3_6h，之后于真空冷凍干燥機中干燥12-48h ；
步驟五:用乙醇溶液配制質量分數為2%-5%橄欖多酚溶液，調節pH至6-8之間；步驟六:將步驟四所得凍干品于步驟五的多酚溶液中于37°C -60°C孵育12-24h ；步驟七:將步驟六得到的樣品用pH為7.3的PBS沖洗7-20遍，除去乙醇，重復步驟三和四。
[0008]步驟一中，膠原蛋白為動物源性的全長膠原蛋白、膠原多肽、明膠，或者基因工程法制得的重組膠原蛋白或類人膠原蛋白。
[0009]步驟五中，乙醇溶液是質量分數為75%_95%的乙醇水溶液；
PH值調節劑選自氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、碳酸鈉溶液，或選自鹽酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩爾體積濃度為0.l-lmol/L0
[0010]所述的一種增強成骨活性的復合人工骨的制備方法制得的增強成骨活性的復合人工骨。
[0011]本發明具有以下優點:
(I)本發明提供的增強生物相容性的復合人工骨的制備工藝簡單，且整個制備過程使用的原料、試劑及溶液等均無毒無害。
[0012](2)本發明提供的增強成骨活性的復合人工骨以天然骨的主要成分膠原蛋白與羥基磷灰石為主要原料，大大提高了支架材料的生物活性及生物相容性。
[0013](3)本發明的提供的增強成骨活性的復合人工骨以天然物質橄欖多酚作為交聯劑，無毒無害，不僅大大的提高了人工骨支架材料的生物相同性，而且，利用各組分之間的鍵合作用提高了支架材料的力學性能，另外，利用橄欖多酚天然的抗氧化性及促進出成骨活性，來制備了具有較好的促進成骨活性的人工骨支架材料。
[0014](4)本發明提供的膠原蛋白基納米羥基磷灰石復合人工骨抗壓強度均在2_3Mpa，能在植入部分提供一定的強度支持，引導新骨的形成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為骨修復材料的抗壓強度試驗結果。
[0016]圖2為骨修復材料浸提液體外細胞毒性試驗結果，圖中，MEM為細胞培養液，Scaffold為材料浸提液，縱軸為細胞成活率，橫軸為時間。
[0017]圖3為成骨細胞在支架材料上的增殖及分化研究:不同培養時間下細胞增殖(cell)及堿性磷酸酶活性的研究(ALP)。
【具體實施方式】
[0018]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細的說明。
[0019]本發明所涉及的一種增強成骨活性的復合人工骨的制備方法，模仿天然骨的基本成分，以膠原蛋白和羥基磷灰石為主要原料，采用慢凍及真空干燥技術制得初次支架材料，再輔助以天然多酚類化合物溶液處理，制得的支架材料表面即具有一定的疏水特性又具有一定的親水特性，加上其粗糙的形貌特征非常有利于細胞的粘附與增值，大大的提高了表面生物活性及支架材料的生物相容性。具體制備方法是:步驟一:用去離子水配制質量分數為10%-25%的膠原蛋白水溶液。
[0020]膠原蛋白為動物源性的全長膠原蛋白、膠原多肽、明膠，或者基因工程法制得的重組膠原蛋白或類人膠原蛋白。
[0021]步驟二:將納米羥基磷灰石粉末分批加入膠原蛋白水溶液中，膠原蛋白與羥基磷灰石的質量比是1: (2-4)，室溫下于漩渦震蕩儀上充分混勻。
[0022]步驟三:將步驟三得到的混合物迅速轉移至模具中。
[0023]步驟四:將模具于4°C中預凍20_60min，依次移至_20°C預凍l_2h，轉移至_80°C預凍3-6h，之后于真空冷凍干燥機中干燥12-48h。
[0024]步驟五:用乙醇溶液配制質量分數為2%_5%橄欖多酚溶液，調節pH至6-8之間。
[0025]乙醇溶液是質量分數為75%_95%的乙醇水溶液；pH值調節劑選自氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、碳酸鈉溶液，或選自鹽酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩爾體積濃度為
0.1-lmol/Lo
[0026]步驟六:將步驟四所得凍干品于步驟五的多酚溶液中于37°C -60°C孵育12_24h。
[0027]步驟七:將步驟六得到的樣品用pH為7.3的PBS沖洗7_20遍，除去乙醇，重復步驟三和四。
[0028]實施例1:
步驟一:用去離子水配制質量分數為10%的膠原蛋白水溶液。
[0029]膠原蛋白為動物源性的全長膠原蛋白、膠原多肽、明膠。
[0030]步驟二:將納米羥基磷灰石粉末分批加入膠原蛋白水溶液中，膠原蛋白與羥基磷灰石的質量比是1:2，室溫下于漩渦震蕩儀上充分混勻。
[0031]步驟三:將步驟三得到的混合物迅速轉移至模具中。
[0032]步驟四:將模具于4°C中預凍20min，依次移至_20°C預凍lh，轉移至_80°C預凍3h，之后于真空冷凍干燥機中干燥12h。
[0033]步驟五:用乙醇溶液配制質量分數為2%橄欖多酚溶液，調節pH至6。
[0034]乙醇溶液是質量分數為75%的乙醇水溶液；pH值調節劑選自氫氧化鈉溶液，或鹽酸溶液，摩爾體積濃度均為0.lmol/L。
[0035]步驟六:將步驟四所得凍干品于步驟五的多酚溶液中于37°C孵育12h。
[0036]步驟七:將步驟六得到的樣品用pH為7.3的PBS沖洗7_10遍，除去乙醇，重復步驟三和四。
[0037]實施例2:
步驟一:用去離子水配制質量分數為15%的膠原蛋白水溶液。
[0038]膠原蛋白為基因工程法制得的重組膠原蛋白或類人膠原蛋白。
[0039]步驟二:將納米羥基磷灰石粉末分批加入膠原蛋白水溶液中，膠原蛋白與羥基磷灰石的質量比是1:3，室溫下于漩渦震蕩儀上充分混勻。
[0040]步驟三:將步驟三得到的混合物迅速轉移至模具中。
[0041]步驟四:將模具于4°C中預凍40min，依次移至_20°C預凍1.5h，轉移至_80°C預凍
4.5h，之后于真空冷凍干燥機中干燥30h。
[0042]步驟五:用乙醇溶液配制質量分數為3%橄欖多酚溶液，調節pH至7。
[0043]乙醇溶液是質量分數為85%的乙醇水溶液；pH值調節劑選取氫氧化鉀溶液和硫酸溶液，摩爾體積濃度均為0.5mol/L。
[0044]步驟六:將步驟四所得凍干品于步驟五的多酚溶液中于48°C孵育18h。
[0045]步驟七:將步驟六得到的樣品用pH為7.3的PBS沖洗10-15遍，除去乙醇，重復步驟三和四。
[0046]實施例3:
步驟一:用去離子水配制質量分數為25%的膠原蛋白水溶液。
[0047]膠原蛋白為基因工程法制得的重組膠原蛋白或類人膠原蛋白。
[0048]步驟二:將納米羥基磷灰石粉末分批加入膠原蛋白水溶液中，膠原蛋白與羥基磷灰石的質量比是1:4，室溫下于漩渦震蕩儀上充分混勻。
[0049]步驟三:將步驟三得到的混合物迅速轉移至模具中。
[0050]步驟四:將模具于4°C中預凍60min，依次移至_20°C預凍2h，轉移至_80°C預凍6h，之后于真空冷凍干燥機中干燥48h。[0051]步驟五:用乙醇溶液配制質量分數為5%橄欖多酚溶液，調節pH至8。
[0052]乙醇溶液是質量分數為95%的乙醇水溶液；pH值調節劑選取碳酸鈉溶液或磷酸溶液，摩爾體積濃度為lmol/L。
[0053]步驟六:將步驟四所得凍干品于步驟五的多酚溶液中于60°C孵育24h。
[0054]步驟七:將步驟六得到的樣品用pH為7.3的PBS沖洗15-20遍，除去乙醇，重復步驟三和四。
[0055]參見圖1的骨修復材料的抗壓強度試驗結果，骨修復材料的抗壓強度達到
2.6Mpa0
[0056]參見圖2的骨修復材料浸提液體外細胞毒性試驗結果，圖中，MEM為細胞培養液，ScaffoId為材料浸提液，縱軸為細胞成活率，橫軸為時間。細胞在純培養液及骨修復用支架材料的浸提液中表現出了相當的生存活力，表明材料沒有細胞毒性，可支持細胞的生長增殖；
參見圖3的成骨細胞在骨修復用材料上的增殖及分化研究:不同培養時間下細胞增殖(cell)及堿性磷酸酶活性的研究(ALP)。從中可以觀察到，隨著培養時間的延長，細胞數量在逐漸增多，細胞在材料上不斷生長增殖，堿性磷酸酶是細胞分化的前期標志，堿性磷酸酶的活性先是增加后是減小，說明在14d后成骨細胞進入分化的后期階段，材料可支持細胞的增殖分化。
[0057]本發明利用純天然物質——橄欖多酚(該交聯劑常用于皮革處理領悟，業界從未將其用于膠原蛋白/骨組織的復合體系中)對制備的有機物/無機物復合人工骨支架材料進行交聯，一方面利用鍵合作用提高了支架材料的力學性能，另一方面，利用橄欖橄欖多酚較高的抗氧化活性及促進成骨性能，而大大的提高了人工骨支架材料的成骨活性。
[0058]本發明的內容不限于實施例所列舉，本領域普通技術人員通過閱讀本發明說明書而對本發明技術方案采取的任何等效的變換，均為本發明的權利要求所涵蓋。
【權利要求】
1.一種增強成骨活性的復合人工骨的制備方法，其特征在于: 由以下步驟實現: 步驟一:用去離子水配制質量分數為10%-25%的膠原蛋白水溶液； 步驟二:將納米羥基磷灰石粉末分批加入膠原蛋白水溶液中，膠原蛋白與羥基磷灰石的質量比是1: (2-4)，室溫下于漩渦震蕩儀上充分混勻； 步驟三:將步驟三得到的混合物迅速轉移至模具中； 步驟四:將模具于4°C中預凍20-60min，依次移至_20°C預凍l_2h，轉移至_80°C預凍3_6h，之后于真空冷凍干燥機中干燥12-48h ； 步驟五:用乙醇溶液配制質量分數為2%-5%橄欖多酚溶液，調節pH至6-8之間；步驟六:將步驟四所得凍干品于步驟五的多酚溶液中于37°C -60°C孵育12-24h ；步驟七:將步驟六得到的樣品用pH為7.3的PBS沖洗7-20遍，除去乙醇，重復步驟三和四。
2.根據權利要求1所述的一種增強成骨活性的復合人工骨的制備方法，其特征在于: 步驟一中，膠原蛋白為動物源性的全長膠原蛋白、膠原多肽、明膠，或者基因工程法制得的重組膠原蛋白或類人膠原蛋白。
3.根據權利要求2所述的一種增強成骨活性的復合人工骨骨的制備方法，其特征在于: 步驟五中，乙醇溶液是質量分數為75%-95%的乙醇水溶液； PH值調節劑選自氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、碳酸鈉溶液，或選自鹽酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩爾體積濃度為0.l-lmol/L0
4.根據權利要求3所述的一種增強成骨活性的復合人工骨的制備方法制得的增強成骨活性的復合人工骨。
【文檔編號】A61L27/42GK103920191SQ201410159805
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】范代娣, 惠俊峰, 馬曉軒, 米鈺, 范慧 申請人:陜西巨子生物技術有限公司