靶向olfm4基因的干擾rna、慢病毒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種靶向OLFM4基因的干擾RNA及慢病毒載體，用于制備預防、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉移的藥物中的用途。本發明利用所述干擾RNA不僅具有抑制胃癌細胞的體外遷移與侵襲能力，還能具有抑制胃癌細胞的肝臟轉移能力；使得減弱OLFM4表達具有潛在治療晚期胃癌惡性進展的有效方式。并進一步明確NF-kB信號為OLFM4表達的上游調控轉錄因子，還具有反饋調控NF-kB信號功能。
【專利說明】靶向0LFM4基因的干擾RNA、慢病毒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，主要涉及利用RNAi沉默0LFM4基因用于制備預防、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉移的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]胃癌是我國第二大常見惡性腫瘤，亦是癌癥致死的第二大原因。盡管目前胃癌綜合治療措施不斷發展完善，使得當前的治療仍不能獲得滿意效果，由于多數胃癌患者在首診時已屬中晚期，進展期胃癌占住院病例90 %以上，術后5年生存率長期徘徊在30-50 %。目前研究發現多數惡性腫瘤治療效果不佳的主要原因在于轉移與復發。胃癌晚期，惡性癌細胞經侵襲發生血行播散經門靜脈轉移至其他器官如肝臟，導致多種臟器功能衰竭，因此胃癌侵襲與肝轉移是晚期胃癌患者死亡的最主要原因之一。由此，對于胃癌的抗轉移治療現狀，尋找一個治療性靶點抑制胃癌的浸潤和肝轉移，將有助于改善胃癌治療，在提高晚期胃癌患者生存率具有重要意義。
[0003]從醫學角度而言，腫瘤細胞無限制增殖是良性與惡性腫瘤的共同特征；而腫瘤的惡性侵襲與轉移則是區分良性腫瘤與惡性腫瘤的主要特征之一。惡性腫瘤最重要的生物學特點在于惡性腫瘤不僅可在原發部位浸潤生長、累及組織；而且還可通過多種途徑擴散轉移到身體其他部位。盡管侵襲和轉移均為惡性腫瘤的生長特性，但二者是不同病理過程，浸潤是轉移的前奏，但并不等于一定發生轉移，然而轉移必定包含侵襲的過程，它們共同構成惡性腫瘤的播散。許多治療靶點對腫瘤細胞的增殖能力調控并不等同與其同時具有調控惡性侵襲與轉移能力。 目前發現，多種惡性腫瘤高表達蛋白如Cyclin D1，具有調控細胞周期與細胞增殖功能，但并不具有控制惡性侵襲與轉移功能。
[0004]0LFM4，又名GW112、hGC_l、h01fD，是2002年新發現的一種由粒細胞集落刺激因子GM-CSF刺激產生的具有嗅覺介導素結構域(olfactomedin domain)蛋白家族成員分子。它最初被克隆于人的原始粒細胞，位于人類13號染色體13ql4.3，編碼510個氨基酸，其蛋白產物為olfactomedin4的前體,屬于嗅覺介導素olfactomedin相關蛋白家族。此類蛋白多表達于神經系統，涉及神經系統的發育。
[0005]0LFM4蛋白是一種分泌性糖蛋白，包括N-連接的碳水化合鏈和二硫化物多聚體，它與細胞表面的多種凝集素結合，如普通的凝集素1、刀豆蛋白凝集素A、麥胚凝集素。GWl 12蛋白的保守半胱氨酸對蛋白寡聚化或分泌非常重要，其中半胱氨酸83，85，246和437是蛋白二聚體形成所必需的，半胱氨酸226是多聚體形成的關鍵。0LFM4蛋白和鈣粘蛋白的相互作用，依賴于0LFM4蛋白C端的嗅覺介導素區域。0LFM4蛋白可粘附在細胞表面，增強NIH3T3和293T/17細胞的擴散和粘附作用。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種靶向0LFM4基因的干擾RNA在用于制備預防、診斷、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉移的藥物中的用途。[0007]本發明的目的是通過以下措施實現的:
[0008]一種靶向0LFM4基因的干擾RNA，其核苷酸序列如下
[0009]正義鏈:
[0010]5' -CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTC [CTCGAG^GAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3'；
[0011]反義鏈:
[0012]5, -AATTCAAAA AAACGCTTGGAATTCACAGCTC:jCTCGAG[ GAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3'。
[0013]體外合成所述述可轉錄出特異靶向0LFM4基因干擾性RNA(RNAi)的DNA序列，0LFM4 基因 RNAi 靶點 DNA 序列為:AACGCTTGGAATTCACAGCTC。干擾 RNA，下劃線部分[CTCGAG ,
所示為0LFM4基因RNAi靶點DNA序列，構成轉錄后RNA的“Stem(莖)”結構部分；框中所示部分為6個堿基的loop環結構，具有連接轉錄后RNA的“莖”結構功能。
[0014]本發明進一步提供了包含上述干擾性RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒載體的結構如圖1所示。上述RNA干擾序列經退火體外合成為雙鏈DNA，并通過兩段酶切位點連接入RNAi干擾載體，轉染或包裝入病毒并感染細胞后，在細胞內能轉錄出特異抑制0LFM4基因信使RNA (mRNA)轉錄的RNAi片段，有效的降低0LFM4基因mRNA轉錄水平進而對0LFM4蛋白表達進行抑制。
[0015]上述靶向0LFM4基因的RNAi慢病毒載體，制備方法包括以下步驟:
[0016](I)體外合成上述DNA序列；
[0017](2)退火配對產生DNA雙鏈，通過兩端所含的酶切位點AgeI與EcoRI連入酶切后的GVl 15載體；
[0018](3)將連接產物轉入制備好的細菌感受態細胞，抽提DNA重組質粒；DNA測序驗證陽性重組克隆；
[0019](4) Lentivirus 病毒包裝:
[0020]①轉染前24h，用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，以含10%血清的培養基調整細胞密度為1.2X IO7細胞/20ml，重新接種于15cm細胞培養皿，37°C、5% CO2培養箱內培養。24h待細胞密度達70%~80%時即可用于轉染。細胞狀態對于病毒包裝至關重要，因此需要保證良好的細胞狀態和較少的傳代次數。
[0021]②轉染前2h將細胞培養基更換為無血清培養基。
[0022]③向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV載體20 μ g，pHelperl.0載體15 μ g，pHelper2.0載體10 μ g)，與相應體積的Opt1-MEM培養基混合均勻，調整總體積為2.5ml,在室溫下溫育5分鐘。
[0023]④將Lipofectamine2000 試劑輕柔搖勻，吸取 100 μ I Lipofectamine2000 試劑在另一管中與2.4ml Opt1-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘。
[0024]⑤把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內混合。
[0025]⑥混合后,在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉染復合物。
[0026]⑦將DNA與Lipofectamine2000混合液轉移至293T細胞的培養液中，混勻，于37°C,5% C02細胞培養箱中培養。[0027]⑧培養8h后倒去含有轉染混和物的培養基，每瓶細胞加入20ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養瓶以洗滌殘余的轉染混和物，然后倒去。
[0028]⑨每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養基25ml，于37°C、5% CO2培養箱內繼續培養48小時。
[0029](5)病毒的收獲及濃縮
[0030]①收集轉染后48小時(轉染即可為O小時計起)的293T細胞上清液。
[0031]②于4°C，4000g離心10min，除去細胞碎片。
[0032]③以0.45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中。
[0033]④把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中(最多19ml)，蓋上蓋子。將過濾杯插到濾過液收集管中。
[0034]⑤組合好后，做好平衡，放在轉頭上。
[0035]⑥在4000Xg離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時間為10-15分鐘。
[0036]⑦離心結束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。
[0037]⑧將過濾杯倒扣在樣品收集杯上。
[0038]⑨離心力不超過 lOOOg，時間為2分鐘。過高轉速會導致樣品損失。把過濾杯從樣品收集杯上移開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。
[0039]⑩將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，_80°C長期保存。取其中一支進行病毒生物學滴度測定。
[0040](6) Lentivirus 滴度測定
[0041]①測定前一天，為測定滴度所需的細胞(293T細胞:貼壁生長)鋪板，96孔板，每個孔加4X IO4個細胞，體積為IOOyL ；
[0042]②根據病毒的預期滴度，準備7-10個無菌的Ep管，每管加入90 μ I的無血清培養基。
[0043]③取待測定的病毒原液10 μ I加入到第一個管中，混勻后，取10 μ I加入到第二個
管中。繼續相同的操作直到最后一管。
[0044]④選取所需的細胞孔，吸去90 μ I培養基，丟棄；加入90 μ I稀釋好的病毒溶液。放入培養箱培養。
[0045]⑤24小時后，加入完全培養基100 μ I。小心操作，不要吹起細胞。
[0046]⑥4天后，觀察熒光表達情冴觀察熒光表達情況。熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而減少。
[0047]⑦滴度計算:根據熒光圖片中GFP表達情況。
[0048]上述干擾性RNA或慢病毒在制備用于預防、診斷、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉移的藥物中的用途。
[0049]上述干擾性RNA或慢病毒在制備用于抑制NF-KB信號途徑傳導的藥物中的用途。
[0050]有益效果
[0051]1.本發明提供了 0LFM4基因新的用途，其利用RNAi沉默0LFM4表達抑制了胃癌細胞向肝臟和腹腔的轉移，確立了轉移防治靶點，是一種有效的干預策略提高胃癌的療效。
[0052]2.本發明設計并構建了特異性靶向0LFM4基因的干擾RNA及其載體，能穩定轉染胃癌細胞株，從而抑制0LFM4蛋白表達，為抑制胃癌的轉移從而為胃癌轉移治療的干預提供有效靶點。
[0053] 3.本發明證明利用慢病毒介導的0LFM4_siRNA不僅具有抑制胃癌細胞的體外遷移與侵襲能力，還能具有抑制胃癌細胞的肝臟轉移能力；使得減弱0LFM4表達具有潛在治療晚期胃癌惡性進展的有效方式。并進一步明確NF-kB信號為0LFM4表達的上游調控轉錄因子，還具有反饋調控NF-kB信號功能。本發明在慢病毒介導的0LFM4-siRNA在胃癌抗轉移治療的關鍵問題上，具有如下創新
[0054](1)采用慢病毒介導的0LFM4-siRNA方式，可作為體內外siRNA傳遞有效方式；而其表達的siRNA能特異性抑制0LFM4基因表達，達到穩定抑制胃癌細胞內0LFM4基因表達的效果。
[0055](2)慢病毒介導0LFM4-siRNA對0LFM4表達的穩定抑制，具有減低胃癌細胞體外遷移與侵襲能力；尤其顯著抑制了體內胃癌細胞的肝臟轉移能力。
[0056](3) 0LFM4基因的表達下調能夠反饋抑制NF-KB信號途徑，利用抑制0LFM4通過反饋抑制NF-KB信號，抑制胃癌細胞的肝臟轉移能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1靶向0LFM4基因的RNAi慢病毒載體結構圖
[0058]圖2實施例1中構建的干擾RNA慢病毒的滴度測定熒光照片(樣品說明:第一個Ep管中加入IOul病毒原液,記為1E+1 μ I ;第二個Ep管中進行了第一次十倍稀釋，所得病毒原液為第一個Ep中的1/10,記為1Ε+0μ I ;第三個Ep管中進行了第二次十倍稀釋,所得病毒原液為第二個Ep中的1/10,記為IE-1 μ I)
[0059]圖3實施例1中0LFM4_siRNA序列測序圖譜
[0060]圖4實施例1中NC-siRNA陰性對照(NC-GFP-LV)序列測序圖譜[0061 ] 圖5實施例1中MKN-45細胞感染慢病毒48h后熒光效果
[0062]圖6實施例1中經流式細胞儀分選后測得GFP+熒光率
[0063]圖7實施例1中經Real-time PCR檢測細胞中0LFM4mRNA表達
[0064]圖8實施例1中0LFM4敲減后Western blot檢測0LFM4蛋白表達
[0065]圖9實施例2中Transwell法測定遷移能力，左圖為三次實驗中典型圖片(200X)，右圖為顯微鏡下10個隨機視野的平均遷移細胞數
[0066]圖10實施例2中Transwell法測定MKN-45細胞侵襲能力，左圖為三次實驗中典型圖片(200X)，右圖為顯微鏡下10個隨機視野的平均侵襲細胞數
[0067]圖11實施例2中經尾靜脈注射和腹腔注射MKN-45后肝臟表面和腸系膜轉移腫瘤結節數量比較，上圖為肉眼下轉移腫瘤典型圖片，下圖為肝臟表面及腸系膜轉移腫瘤結節平均數
[0068]圖12實施例2中HE染色檢測轉移腫瘤組織
[0069]圖13實施例3中比較0LFM4敲減后總蛋白中NF- κ B相關蛋白表達水平
[0070]圖14實施例3中比較0LFM4敲減后胞漿蛋白中0LFM4的表達及胞漿胞核蛋白中NF- κ B通路相關蛋白表達水平
[0071 ] 圖15實施例3中0LFM4敲低后胞核蛋白與NF- κ B DNA的結合活性明顯被抑制
[0072]圖16實施例3中人腫瘤轉移Real-time PCR芯片基因檢測的擴增曲線㈧和部分融解曲線(B)
【具體實施方式】
[0073]下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。
[0074]實施例1慢病毒載體的構建及穩定感染細胞株的建立
[0075]I 材料
[0076]1.1細胞株
[0077]人胃癌細胞株MKN-45購自生科院上海細胞所。
[0078]1.2慢病毒構建RNA序列
[0079]0LFM4-RNAi 干擾靶點序列:AACGCTTGGAATTCACAGCTC
[0080]NC-RNA 序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT
[0081]1.3引物設計
[0082]0LFM4擴增弓丨物序列: [0083]0LFM4-F:5/ -ACAGAGTGGAACGCTTGGAA-3'
[0084]0LFM4-R: 5' -CCTTCTCCATGATGTCAATTCG-3'
[0085]內參β -actin擴增引物序列:
[0086]β -actin-F:5/ -CCAACCGCGAGAAGATGA-3'
[0087]β -actin-R:5/ -CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3'
[0088]1.4主要試劑及耗材
[0089]
【權利要求】
1.一種祀向0LFM4基因的干擾RNA,其核苷酸序列如下: 正義鏈:5,
-CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3 '，即 SEQ IDN0.1 ； 反義鏈辦’
-AATTCAAAAAAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3'，即 SEQ IDN0.2。
2.包含權利要求1所述的靶向0LFM4基因的干擾RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒載體的結構如圖1所示。
3.如權利要求2所述的Lentivirus慢病毒,制備方法包括以下步驟: (1)體外合成上述DNA序列； (2)退火配對產生DNA雙鏈，通過兩端所含的酶切位點AgeI與EcoRI連入酶切后的GVl 15載體； (3)將連接產物轉 入制備好的細菌感受態細胞，抽提DNA重組質粒；DNA測序驗證陽性重組克隆； (4)Lentivirus 病毒包裝: ①轉染前24h，用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，以含10%血清的培養基調整細胞密度為1.2X IO7細胞/20 ml，重新接種于15cm細胞培養皿，37°C、5% CO2培養箱內培養，24 h后待細胞密度達70%~80%用于轉染； ②轉染前2h將細胞培養基更換為無血清培養基； ③向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV載體20μ g , pHelper 1.0載體15 μ g，pHelper 2.0載體10 μ g)，與相應體積的Opt1-MEM培養基混合均勻，調整總體積為2.5 ml,在室溫下溫育5分鐘； ④將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻，吸取100μ I Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4ml Opt1-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘； ⑤把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進行混合,輕輕地顛倒混勻，在5分鐘之內混合； ⑥混合后，在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉染復合物； ⑦將DNA與Lipofectamine2000混合液轉移至293T細胞的培養液中，混勻，于37°C，5%C02細胞培養箱中培養； ⑧培養8h后倒去含有轉染混和物的培養基，每瓶細胞加入20 ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養瓶以洗滌殘余的轉染混和物，然后倒去； ⑨每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養基251111，于371:、5%0)2培養箱內繼續培養48小時； (5)病毒的收獲及濃縮 ①收集轉染后48小時的293T細胞上清液； ②4°C，4000g離心10min，除去細胞碎片； ③以0.45 μ m濾器過濾上清液于40 ml超速離心管中；④把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中(最多19ml)，蓋上蓋子；將過濾杯插到濾過液收集管中； ⑤組合好后，做好平衡，放在轉頭上； ⑥在4000Xg離心10-15分鐘，至需要的病毒濃縮體積； ⑦離心結束后，芰出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開； ⑧將過濾杯倒扣在樣品收集杯上； ⑨離心力不超過1000g,時間為2分鐘；把過濾杯從樣品收集杯上移開；樣品收集杯中的即為病毒濃縮液； ⑩將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，_80°C長期保存；取其中一支進行病毒生物學滴度測定； (6) Lentivirus 滴度測定 ①測定前一天，293T細胞鋪96孔板，貼壁生長，每個孔加4XIO4個細胞，體積為100μ L ；②根據病毒的預期滴度，準備疒10個無菌的Ep管，每管加入90μ I的無血清培養基； ③取待測定的病毒原液10μ I加入到第一個管中，混勻后,取10 μ I加入到第二個管中，繼續相同的操作直到最后一管； ④選取所需的細胞孔，吸去90μ I培養基，丟棄；加入90 μ I稀釋好的病毒溶液；放入培養箱培養； ⑤24小時后，加入完全培養基100μl ; ⑥4天后，觀察熒光表達情冴觀察熒光表達情況；熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而減少； ⑦滴度計算:根據熒光圖片中GFP表達情況。
4.如權利要求1所述的干擾性RNA或如權利要求2所述的慢病毒在制備用于預防、診斷、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉移的藥物中的用途。
5.如權利要求1所述的干擾性RNA或如權利要求2所述的慢病毒在制備用于抑制NF-KB信號途徑傳導的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK103981186SQ201410186285
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月5日 優先權日:2014年5月5日
【發明者】黃軼, 宋利華, 李陽, 包黎明 申請人:重慶醫科大學附屬兒童醫院