一種miR-27a的應用及其診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術和醫學【技術領域】，提供了一種miR-27a在制備結腸癌發生或轉移診斷試劑盒中的應用，還提供了一種miR-27a在制備抑制結腸癌發生或轉移藥物中的應用，還提供了一種結腸癌發生或轉移診斷試劑盒，試劑盒含有miR-27a的實時熒光定量PCR引物，所述引物分別為：上游引物序列為：5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAA?G-3’；通用下游引物序列為：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。本發明提供的試劑盒通過檢測miR-27a的表達，可以對結腸癌發生進行早期診斷，通過檢測其表達水平與臨床分期以及轉移的關系，對病人預后作出評價。
【專利說明】—種miR-27a的應用及其診斷試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術和醫學【技術領域】，特別涉及一種miR-27a對結腸癌發生或轉移診斷的應用。
【背景技術】
[0002]結腸癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，結腸癌發生發展的原因尚未完全清楚。結腸癌的淋巴轉移和其他臟器遠端轉移是結腸癌病人死亡的主要原因，結腸癌遠端轉移的患者預后極差，因此，對結腸癌的發生和轉移的研究一直是基礎和臨床研究的熱點。結腸癌的常規治療手段主要是手術治療、放化療。近年來迅速發展的免疫治療和基因治療顯示了巨大的應用潛力。近年來研究表明表觀遺傳的改變和癌信號分子的激活是惡性病變發生和進展的主要原因。表觀修飾尤其是miRNAs的異常表達與腫瘤的形成、轉移相關，并在腫瘤治療中起關鍵作用。miciORNAs (miRNAs)是一類內源性小分子非編碼RNA，結構高度保守，具有表達時序性和組織特異性，通過與靶基因3’非編碼區互補序列特異性結合，導致翻譯抑制或mRNA降解，從而調芐基因的表達。基于miRNA的以上特點，以及隨著大規模、高通量miRNA檢測技術的推廣應用，發現新的miRNA不僅為腫瘤的診斷和預后提供了頗具價值的標準，同時也為尋找新的腫瘤生物治療靶點奠定基礎。
[0003]miR-27a位于19號染色體，其表達水平和生物功能隨腫瘤類型而異，一些研究報道miR-27a是一種癌基因，例如，在乳腺癌、結腸癌細胞系，肝細胞腺癌細胞中表達增高，而且miR-27a的高表達與乳腺癌的進展和不良預后密切相關。另外一些研究也發現miR_27a通過促進轉錄因子特異蛋白(Sp)、血管內皮生長因子(VEGF)和血管內皮生長因子受體I (VEGFRl)的表達來發揮其作為癌基因的功能。另一方面miR-27a也扮演著抑癌基因的角色，例如，miR-27a在食管癌、口腔鱗癌和非小細胞肺癌中表達降低。在非小細胞肺癌中，miR-27a靶作用于MET和EGFR的3’ UTR導致MET和EGFR的表達降低。
[0004]我們的研究發現，miR-27a在結腸癌組織中表達顯著降低(41例結腸癌標本中33例miR-27a表達降低)，另外miR-27a的低表達和結腸癌的遠處轉移(二者正相關)以及臨床分期(3-4期的表達低于1-2期)密切相關。miR-27a通過靶作用于smad2、SGPPl抑制腫瘤的生長和轉移。我們對miR-27a在結腸癌組織中的表達水平以及其生物功能的研究尚屬首次，該研究對結腸癌的發生和轉移以及治療具有重大的意義。

【發明內容】

[0005]針對現有技術不足，本發明的目的是提供一種miR_27a的應用及其診斷試劑盒。
[0006]為實現上述目的，本發明提供了一種miR_27a在制備結腸癌發生或轉移診斷試劑盒中的應用。
[0007]本發明還提供了一種miR_27a在制備抑制結腸癌發生或轉移藥物中的應用。
[0008]本發明還提供了一種結腸癌發生或轉移診斷試劑盒，試劑盒含有miR_27a的實時熒光定量PCR引物，所述引物分別為:[0009]上游引物序列為:5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，如 SEQ ID NO:1 所示；
[0010]通用下游引物序列為:5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如 SEQ ID NO:2 所示。
[0011]該試劑盒還包括PCR反應常用的酶和試劑。作為優選，試劑盒包括:組織總RNA提取試劑、RNA加polyA試劑、逆轉錄試劑、定量PCR試劑。
[0012]其中，逆轉錄試劑中包括miR-27a的特異逆轉錄引物，其序列為:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTT GCGGAAjn SEQ ID NO:3 所示；
[0013]內參snord47 的逆轉錄引物，其序列為:GTGCAGGGTCCGAG GTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCTdn SEQ ID NO:4 所示；
[0014]定量PCR試劑中包括miR_27a的特異引物:
[0015]上游引物:TTCGGTTCACAGTGGCTAAGjnSEQ ID NO:1 所示；
[0016]內參snord47的特異引物:
[0017]上游引物:CGCCAA TGATGTAATGATTCTGjnSEQ ID NO:5 所示；
[0018]通用下游引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTjnSEQ ID NO:2 ；
[0019]通用Taqman 探針:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAT TT/3 IABkFQ0
[0020]本發明的有益效果:本發明提供的試劑盒通過檢測miR_27a的表達，可以對結腸癌發生進行早期診斷，通過檢測其表達水平與臨床分期以及轉移的關系，對病人預后作出評價。基于miR-27a靶作用于smad2、SGPPl的特點，可以設計抑制腫瘤生長、轉移的干預策略，提出了 miR-27a在制備抑制結腸癌腫瘤生長和轉移藥物中的作用。本發明在醫學和生物制藥領域有重大實際意義和巨大的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為miR_27a在41例標本中的表達情況；
[0022]圖2為miR_27a轉染HCTl 16細胞后劃痕實驗的結果；
[0023]圖3為SGPPl和smad2在結腸癌組織和鄰近正常組織中表達的免疫組化染色結果;
[0024]圖4為P-STAT3在結腸癌組織和鄰近正常組織中表達的免疫組化染色結果；
[0025]圖5為miR_27a轉染HCTl 16細胞后SGPPl的表達變化；
[0026]圖6為miR_27a轉染HCTl 16細胞后smad2的表達變化；
[0027]圖7為psiCHECKTM-2載體的圖譜；
[0028]圖8為miR_27a轉染HCTl 16細胞后SGPPl和smad2報告基因活性的變化；
[0029]圖9為MTS實驗檢測miR_27a轉染SW480、HCTl 16、Caco2后細胞增殖情況；
[0030]圖10為miR_27a轉染后細胞的凋亡變化；
[0031]圖11 為 miR_27a 轉染 HCTl 16 和 SW480 細胞后影響 STAT3 和 Caspase3 水平；
[0032]圖12為miR_27a轉染HCTl 16細胞后抑制SGPPl和Smad2蛋白水平；
[0033]圖13為miR_27a轉染SW480細胞后抑制SGPPl和Smad2蛋白水平；
[0034]圖14為實驗組(miR_27a轉染)和對照組(陰性對照miRNA轉染)小鼠在腫瘤細胞接種后增生物的體積隨時間的變化情況；
[0035]圖15為實驗組(miR_27a轉染)和對照組(陰性對照miRNA轉染)小鼠中增生物的重量情況(NC 為 negative control)；[0036]圖16為實驗組(miR_27a轉染)和對照組(陰性對照miRNA轉染)小鼠中增生物的情況；
[0037]圖17為實驗組(miR_27a轉染)和對照組(陰性對照miRNA轉染)小鼠中增生物的miR-27a的表達情況。
【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件。
[0039]實施例lmiR_27 a在結腸癌組織標本中的差異性表達
[0040]1、人結腸組織標本收集
[0041]從新鄉市中心醫院和新鄉醫學院第一附屬醫院，收集2012年11月至2013年12月間的共41例結腸癌標本及其臨近的正常結腸組織標本。一部分儲存于液氮、-80°C冰箱中，提取RNA和蛋白質用來做實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡。另一部分用10%福爾馬林固定，后用石蠟包埋。病人的臨床和病理信息如表1所示。所有病人均書面告知，標本收集均經新鄉醫學院倫理審查委員會同意。
[0042]表lmiR-27a與臨床病理資料間的聯系
【權利要求】
1.miR-27a在制備結腸癌發生或轉移診斷試劑盒中的應用。
2.miR-27a在制備抑制結腸癌發生或轉移藥物中的應用。
3.一種結腸癌發生或轉移診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒含有miR-27a的實時熒光定量PCR引物，所述引物分別為: 上游引物序列為:5，-TTCGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，如 SEQ ID NO:1 所示； 通用下游引物序列為:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如SEQ ID NO:2所示。
4.根據權利 要求3所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括PCR反應常用的酶和試劑。
【文檔編號】A61K48/00GK103966327SQ201410191811
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】鮑永華, 楊萬才, 郭永臣, 李澤信, 薛會朝, 朱紹輝, 徐紅偉, 游焜, 陳志國, 趙鐵索, 李凱, 王倩 申請人:新鄉醫學院